Quantification de Monocyte Transmigration et de la Formation de mousse cellulaire par des individus souffrant de maladies inflammatoires chroniques

L’objectif global de ce test est de quantifier la capacité des monocytes provenant d’échantillons cliniques humains à subir une migration transendothéliale et la formation de cellules spumeuses. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés dans le domaine cardiovasculaire telles que le potentiel athérogène des cellules d’individus à risque de maladie coronarienne aiguë. Le principal avantage de cette technique est que les échantillons cliniques peuvent être mesurés à partir de sang total frais ou de cohortes de patients stockés.

De plus, la formation de cellules spumeuses peut être quantifiée à la fois par microscopie et cytométrie en flux. Tout d’abord, préparez les gels de collagène polymérisés à partir d’une suspension de collagène frais. Dans un tube en polystyrène de cinq millilitres, ajoutez de l’hydroxyde de sodium, puis 10 fois M199, puis de l’acide acide, et enfin, ajoutez du collagène fibreux.

Mélangez bien le tout par pipetage. Ensuite, aliquote 50 microlitres dans les puits internes d’une plaque de culture tissulaire stérile à fond plat à 96 puits. Dans les bords extérieurs des puits, chargez 200 microlitres d’une fois Dulbecco PBS pour éviter la dessiccation.

Après deux heures d’incubation à 37 degrés Celsius, le collagène va polymériser. Ensuite, superposez les gels avec 150 microlitres de M199 une fois complété et incubez-les jusqu’à ce que vous ayez besoin de les utiliser cinq jours plus tard. Pour développer les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine stockées, préparez un flacon de culture de 25 centimètres carrés avec un millilitre de solution de fibronectine et incubez le plat pendant 10 minutes à température ambiante.

Pendant ce temps, décongelez les cellules stockées dans un bain-marie pour les remettre en suspension dans M20. Une fois les cellules décongelées, aspirez toute solution résiduelle de fibronectine de la boîte et mettez les cellules dans une assiette. Ensuite, la culture à la confluence en remplaçant le média au bout de deux à trois jours.

Les HUVECs devraient être confluents au cinquième jour de culture. Détachez ceux-ci en aspirant le surnageant de la culture dans le ballon, puis lavez le milieu contenant du sérum à l’aide de deux à trois millilitres d’une fois PBS. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de trypsine diluée et incubez brièvement les cellules à température ambiante en secouant doucement les cellules jusqu’à ce qu’elles apparaissent détachées.

Ensuite, récupérez-les rapidement avec cinq millilitres de M20 et transférez la suspension dans un tube de 10 millilitres et des cellules centrifugées. Maintenant, remettez les cellules en suspension dans M20 à 200 000 cellules par millilitre. Ensuite, aspirez le M199 de la plaque de collagène préparée et ajoutez 100 microlitres de HUVECs à chaque gel.

Continuez la culture pendant trois jours. Le huitième jour de la culture des HUVEC, activez les monocouches avant d’ajouter les monocytes. Après avoir aspiré le milieu de recouvrement, ajoutez 100 microlitres de solution humaine de TNF-alpha dans chaque puits.

Ensuite, incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant quatre heures. Après l’incubation, retirez le média et lavez les gels deux fois avec 100 microlitres de M199 par lavage. Maintenant, ajoutez 50 000 monocytes fraîchement isolés ou sous-ensembles de monocytes purifiés dans 100 microlitres de M20 aux monocouches HUVEC.

Après avoir ajouté les monocytes, incubez la plaque pendant une heure pour permettre la transmigration vers l’avant des cellules. Au bout d’une heure, recueillir les cellules non transmigrées dans une solution de lavage. Commencez par regrouper deux lavages EGTA à l’aide de 100 microlitres par puits.

Ensuite, faites tourner les solutions de lavage combinées à 300 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 30 microlitres de PBS et comptez les cellules pour déterminer le pourcentage de cellules transmigrées vers l’avant. Maintenant, lavez les puits d’assiette une fois avec M199 et ajoutez 100 microlitres de M20 frais dans les puits d’assiette et incubez l’assiette pendant deux jours.

Après deux jours, répétez la procédure de collecte des cellules non transmigrées dans la solution de lavage EGTA afin de collecter les cellules transmigrées inversement et de procéder à l’analyse phénotypique des cellules. Pour caractériser phénotypiquement les cellules liées au gel par analyse FACS, digérez les cellules en ajoutant 100 microlitres de collagène D à 37 degrés Celsius et en les laissant incuber pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, faites macérer les gels à l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres et incubez-les pendant 20 minutes supplémentaires pour digérer complètement les gels.

Une fois complètement digérés, filtrez et regroupez les gels répliqués digérés à travers un maillage en nylon de 35 microns dans un tube FACS sur de la glace. Maintenant, lavez les cellules filtrées une fois avec une solution de lavage FACS froide. Centrifugez les cellules et mettez-les en suspension dans 100 microlitres de solution de lavage à froid.

Ensuite, effectuez la coloration et l’analyse FACS selon le protocole texte. Pour analyser les cellules par microscopie, colorez d’abord les cellules comme décrit dans le protocole texte. Pour détacher les cellules colorées, bordez les puits à l’aide d’une aiguille de calibre 21 avec le biseau vers l’extérieur.

Ensuite, préparez des lames pour monter les gels. Percez deux petits trous dans une bande de ruban adhésif double face, puis fixez le ruban à la diapositive et retirez le revêtement protecteur. Ensuite, ajoutez une goutte d’eau dans chaque trou du ruban.

Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler, transférez doucement deux gels sur les deux trous et couvrez le ruban. Enfin, fixez soigneusement une lamelle sur le ruban et procédez à la visualisation des cellules. Après la transmigration, les cellules non transmigrées ont été comptées comme décrit.

Au total, 15 000 cellules non transmigrées ont été récupérées, et le pourcentage de transmigration vers l’avant a été déterminé à 95 %Après 48 heures d’incubation supplémentaire, 36 000 cellules transmigrées inverses ont été récupérées, ce qui représentait 12,6 % de transmigration inverse. La coloration des gels avec du O rouge d’huile a révélé des cellules spumeuses soulignées par des flèches blanches et des macrophages indiqués par des flèches noires. Ces monocytes ont été traités avec du LDL oxydé pendant la transmigration, une substance utilisée pour induire la formation de cellules spumeuses dans les modèles conventionnels d’induction de cellules spumeuses.

Les données globales de numération cellulaire de 12 donneurs ont confirmé que l’incubation des monocytes avec des LDL oxydés induisait plus de formation de cellules mousseuses que lorsque les monocytes sont incubés avec des milieux natifs LDL ou M199 seuls. Les cellules transmigrées ont également été analysées par cytométrie en flux. Après avoir exclu les cellules mortes, les doublets et les HUVEC CD45 négatifs, la population principale de cellules migrées a été sélectionnée et l’intensité moyenne de fluorescence des récepteurs d’intérêt a été comparée aux données de contrôle de fluorescence moins un ou d’isotype.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser ce test pour quantifier la migration transendothéliale des monocytes et la formation de cellules mousseuses à partir d’échantillons cliniques humains. N’oubliez pas que travailler avec des échantillons cliniques humains peut être extrêmement dangereux et qu’une bonne technique de laboratoire doit toujours être utilisée.