Ciblage des Thiols de cystéine pour in Vitro in situ Glycosylation des protéines recombinantes

L’objectif global de cette procédure est d’incorporer des résidus de cystéine dans les protéines par mutagenèse dirigée sur des sites glycosylés natifs et d’utiliser des approches de fixation et d’évaluation du glucose in vitro pour évaluer l’efficacité et les effets structurels de la glycosylation. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie structurale telles que, quelles sont les conséquences structurelles de la glycosylation des protéines et comment ces modifications affectent-elles les mécanismes de fonctionnement sous-jacents ? Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est facilement adaptable à l’étude ou à la manipulation de la glycosylation.

Il est très efficace et les perturbations de la structure et l’efficacité peuvent être rapidement évaluées. Les implications de cette technique s’étendent au traitement des maladies, car des modèles de glycosylation modifiés ont été associés à plusieurs cancers et troubles neurodégénératifs. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des effets des protéines glycosylées nativement, elle pourrait également fournir des informations indispensables sur la façon de modifier les modèles de glycosylation qui peuvent contribuer à cette gamme de maladies.

Pour introduire une seule mutation de la cystéine dans le vecteur d’expression, préparez deux tubes de réaction PCR individuels. Dans le premier tube, ajoutez l’amorce mutagène directe et dans le deuxième tube, ajoutez l’amorce mutagène inverse. Ajoutez une concentration finale de tampon PCR 1X dans les deux tubes.

Ensuite, mettez en place un programme de cinq cycles pour les deux tubes de réaction PCR séparés. Ajoutez un temps d’extension de sept minutes et demie à 72 degrés Celsius à la fin du cinquième cycle. Une fois les cinq cycles terminés, mélangez les deux réactions PCR distinctes dans un seul tube, centrifugez le tube pendant environ trois secondes et répétez 20 cycles supplémentaires en suivant les mêmes conditions de PCR.

Ensuite, exécutez 15 microlitres de l’échantillon sur un gel d’agarose à 1 % d’ADN à 120 volts pendant 40 minutes. Ensuite, plongez le gel dans de l’eau contenant 0,5 milligramme par millilitre de bromure d’éthidium et secouez-le à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, confirmez l’amplification du modèle sous la lumière UV à une longueur d’onde de 302 nanomètres.

Après cela, ajoutez 0,5 microlitre d’enzyme de restriction DPN1 aux 25 microlitres restants de mélange réactionnel PCR. Incuber le mélange pendant deux heures et demie à 37 degrés Celsius pour digérer l’ADN matrice méthylé. Ensuite, ajoutez environ cinq à 10 microlitres du mélange digéré à 100 microlitres de cellules E. coli capables de choc thermique et incubez sur de la glace pendant 60 minutes.

Ensuite, choquez le mélange cellule-ADN à 42 degrés Celsius pendant 45 secondes sur un bloc de chaleur sec. Ensuite, incubez immédiatement le mélange sur de la glace pendant trois minutes. Ensuite, ajoutez 900 microlitres de bouillon LB dans les cellules et transférez la suspension dans un tube stérile à fond rond de 14 millilitres.

Incuber à 37 degrés Celsius en secouant constamment à 190 tr/min pendant 90 minutes. Ensuite, étalez la pastille de cellules centrifugées sur des plaques de gélose enrichies en antibiotiques. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 16 heures.

Le lendemain, inoculez aseptiquement une seule colonie de la plaque dans cinq millilitres de milieu LB supplémenté en antibiotiques. Ensuite, cultivez la culture pendant la nuit à 37 degrés Celsius en secouant constamment. Transformer le plasmide muté du résidu cystéine en cellules E. coli par un traitement par choc thermique, suivi d’une culture cultivée pendant la nuit dans un milieu LB supplémenté en antibiotiques.

Le lendemain, épandez directement 150 microlitres de suspension cellulaire sur des plaques de gélose LB complétée par de la kanamycine, et conservez les plaques pour une incubation nocturne à 37 degrés Celsius. Le lendemain, transférez aseptiquement une seule colonie dans 20 millilitres de milieu LB dans un erlenmeyer et laissez incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, transférez la culture de nuit dans un tube conique de 50 millilitres.

Ensuite, granulez les cellules en centrifugeant la culture liquide pendant la nuit à 2 400 fois G pendant 15 minutes. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de milieu minimal M9 à la pastille cellulaire, puis suspendez le mélange cellulaire dans un litre de milieu M9 contenant de la kanamycine. Continuez à faire croître la culture liquide M9 à 37 degrés Celsius avec une agitation constante à environ 190 tr/min jusqu’à ce que la densité optique à 600 nanomètres atteigne environ 0,6 à 0,8.

Ensuite, ajoutez 200 micromolaires d’IPTG à la culture M9 pour induire l’expression des protéines et laissez la culture se développer pendant la nuit. Le lendemain, granulez les cellules bactériennes de la culture de nuit en les centrifugeant à environ 10 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. À l’aide d’une pipette de transfert motorisée de 10 millilitres, homogénéiser la pastille de cellules bactériennes congelée dans environ 40 millilitres de tampon d’homogénéisation.

Ensuite, incubez l’homogénat dans un four d’hybridation pendant 90 minutes avec une rotation constante. Centrifuger le mélange à environ 15 000 fois G à huit degrés Celsius pendant 40 minutes pour séparer la fraction protéique soluble de la pastille insoluble. Ensuite, ajoutez 50 % volume par volume de boue de billes d’agarose de nickel nitrilotriacétique au surnageant et incubez par inversion dans le four d’hybridation pendant 90 minutes à température ambiante.

Ensuite, utilisez une colonne de purification de protéines par gravité pour collecter les billes d’agarose avec la protéine marquée à l’hexahistidine attachée au nickel. Enfin, lavez trois fois les perles d’agarose recueillies. Éluer les protéines en une série de fractions de deux millilitres.

Ensuite, confirmez la protéine purifiée marquée à l’hexahistidine dans les fractions éluées en appliquant un gel SDS-PAGE coloré au bleu de Coomassie. Regroupez les fractions de protéines éluées dans une membrane de dialyse avec une coupure de poids moléculaire de 3 500 daltons et incubez dans un tampon de repliement à quatre degrés Celsius pendant la nuit avec agitation magnétique. Ensuite, ajoutez environ une unité de thrombine par milligramme de protéine à la protéine accumulée dans la membrane de dialyse et incubez à nouveau pendant une journée à quatre degrés Celsius.

Le lendemain, retirez la protéine du sac de dialyse et concentrez-la environ dix fois à l’aide d’un concentrateur centrifuge d’ultrafiltration avec une coupure de poids moléculaire de 10 000 daltons. Par la suite, diluez à nouveau le concentré de protéines environ 20 fois dans un tampon de repliement sans chlorure de sodium. Pour purifier la protéine, chargez-la sur une colonne d’échange d’anions pré-emballée équilibrée avec le même tampon sans chlorure de sodium.

Commencez à éluer les protéines dans un gradient de zéro à 60 % d’une molaire contenant du chlorure de sodium contenant un tampon de repliement. Transférez les fractions de protéines regroupées dans un sac de dialyse. Effectuer une dialyse à quatre degrés Celsius pendant la nuit pour échanger la protéine dans le tampon de repliement expérimental avec la concentration molaire optimale de chlorure de sodium.

Tout d’abord, dialysez 1,5 millilitre d’environ 60 protéines micromolaires dans un litre de tampon de modification pour la glycosylation de la protéine. Après 24 heures, à quatre degrés Celsius, transférez la protéine modifiée dans un tube de microcentrifugation et ajoutez du glucose-5-MTS solubilisé au DMSO à une concentration finale de deux millimolaires. Tapotez doucement le tube de microcentrifugation toutes les 10 minutes pendant l’incubation de l’échantillon dans l’obscurité pendant une heure à température ambiante.

Après l’incubation, effectuez une dialyse à quatre degrés Celsius pour rééchanger la protéine dans le tampon expérimental final. Mesurer la masse précise de la protéine à l’aide de la spectrométrie de masse à ionisation par électronébulisation. Enfin, utilisez la RMN en solution pour calculer l’efficacité de la modification et identifier les changements structurels des résidus de cys glycosylés dans la protéine.

Une matrice d’ADN amplifiée par PCR mutationnelle réussie est mise en évidence dans ce gel d’agarose représentatif à 1 % d’ADN. L’échelle d’ADN et une quantité équivalente d’ADN matrice qui n’a pas été amplifiée par PCR sont utilisées comme témoins dans le gel. La bande supérieure avec une coloration au bromure d’éthidium de haute intensité montre le modèle amplifié de la taille souhaitée.

Ensuite, la protéine a été purifiée à l’aide d’une colonne d’échange d’anions. Le chromatogramme montre un profil d’élution observé à 280 nanomètres en bleu, présentant trois pics éluant contre un gradient de chlorure de sodium indiqué en rouge avec une concentration croissante jusqu’à 0,6 molaire. Le panneau inférieur montre un gel SDS-PAGE coloré en bleu Coomassie des fractions protéiques.

La glycosylation des résidus de cystéine a été déterminée par spectrométrie de masse à ionisation par électronébulisation. Le chromatogramme montre les masses de la protéine non modifiée et modifiée avant et après la glycosylation du résidu cystéine. Pour confirmation, une RMN en solution a été réalisée montrant la superposition spectrale HSQC des déplacements chimiques des amides spécifiques du résidu, indiquant à la fois des modifications et des perturbations structurelles de la protéine glycosylée.

Une fois maîtrisée, toutes les étapes, de la mutagénèse à l’évaluation RMN, peuvent être complétées en environ 12 jours, à l’exclusion du temps d’attente pour les services de synthèse d’amorces, de séquençage de l’ADN et de spectroscopie de masse. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’évaluer les effets structurels et biophysiques des mutations de la cystéine en l’absence de modification thiol comme mesures de contrôle de base. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la stabilité, la structure secondaire, la liaison ionique, les évaluations de l’interaction protéine-protéine, peuvent être effectuées pour révéler comment les propriétés biophysiques des fonctions protéiques sous-jacentes sont affectées par la glycosylation.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la signalisation calcique pour évaluer individuellement et cumulativement les rôles de l’asparagine 131 et de l’asparagine 171 et de la glycosylation dans l’interaction stromale de la molécule une signalisation calcique associée à l’entrée du calcium opérée par le magasin.