Name: Méthodes pour le pH intracellulaire d’imagerie de la lignée de cellules souches de follicule en Live drosophile de tissu ovarien (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Découvrez l'imagerie quantitative du pH intracellulaire dans le tissu ovarien vivant de Drosophila. Cette méthode utilise un biosenseur fluorescent pour étudier le comportement des cellules souches folliculaires en biologie du développement.

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Nous remercions Bryne Ulmschneider contributions au protocole et Diane Barber pour obtenir des suggestions sur le manuscrit. Ce travail a été financé par un Institut National d’octroi de santé GM116384 à Nystul de T.G. et D.L. Barber.

Remarque : pour mesurer pHi dans la lignée de la FSC, nous calculer le rapport des intensités de fluorescence de pHluorin à mCherry en FSC, les PFC et les cellules folliculaires dans les conditions physiologiques et convertir les rapports en valeurs de pHi à la norme courbes d’étalonnage pour chaque cellule de type 7. Tout d’abord, vivre des expériences d’imagerie sont réalisées pour mesurer les intensités de fluorescence des pHluorin et des mCherry en germaria disséqué dans une mémoire tampon contenant NaHCO 3, qui imite les conditions physiologiques 1 , 7. courbes suivant, standards sont générés par la mesure des intensités de fluorescence pHluorin et mCherry dans un + de Na-K + tampon contenant l’ionophore nigéricine libre, ajusté à deux valeurs de pH différents, 6,5 et 7,5. En présence de nigéricine, pHi s’équilibre avec le pH de la mémoire tampon à travers la membrane de plasma, causant pHi faire correspondre le pH extracellulaire. Enfin, les courbes d’étalonnage sont utilisés pour convertir les pHluorin mCherry ratios aux valeurs estimées pHi.
 1. préliminaire : pHi de préparation avant la mesure In Vivo Remarque : pour mesurer la pHi in vivo, le transgène mCherry::pHluorin doit être exprimé dans le type de cellules d’intérêt. Voici quelques moyens courants de générer pHluorin transgénique vole dans la lignée de la FSC. Générer des clones de mCherry::pHluorin est particulièrement utile pour l’identification des FSC, qui est situés sur le bord antérieur d’un clone FSC. Tissu mCherry::pHluorin spécifique expression est utile pour mesurer les pHi à travers le tissu entier et est également plus pratique pour combiner avec l’expression d’un Arni ou transgène.
<ol><li>Vole de la génération de transgénique pHluorin <ol><li>mCherry::pHluorin marqués FSC clones <ol><li>à faire des clones de mCherry::pHluorin FSC, cross SAMU-mCherry::pHluorin 1 à une loi-Gal4 flipout stock ou autre stock avec un Gal4 inductible Flp/FRT.</li>
			<li>Pour faire des clones inductibles, b b F1s adultes pour 2 jours post eclosion en flacons vides pendant 1 h dans un bain d’eau de 37 ° C, quatre fois environ chaque 12 h.</li>
			<li>Pour assurer une croissance normale et un taux maximum de l’ovogenèse pendant cette période, maintenir les mouches en fournissant humides de levure fraîche (approximativement égales à sec baker &#39; eau et levure s) par jour pendant au moins 6 jours après l’induction de clone.</li>
		</ol></li> <li>Expression de tissus spécifiques mCherry::pHluorin</li> <li>Cross mCherry::pHluorin SAMU 1 à un follicule cellule pilote spécifique, y 1 w * ; P {GawB} 10930/CyO (Bloomington ID : 7023).</li>
		<li>3 jours après le démarrage de mouches issues, collecter et placez-les dans des fioles contenant de la levure humide, pendant au moins 24 h avant la dissection.</li>
	</ol></li> <li>Rendant les solutions Remarque : il est important de préparer les tampons suivants le jour de l’expérience, parce que les concentrations de pH et de soluté dans la mémoire tampon peuvent changer au fil du temps.
	<ol><li>Prepare des tampons bicarbonate, nigéricine et dissection. Ajoutez les composants dans l’ordre figurant pour éviter la formation de précipités (voir tableau 1, tableau 2 et tableau 3).</li>
	</ol></li></ol> 2. Trial : Mesure pHi dans la lignée de FCS Remarque : la dissection, de montage et direct d’imagerie étapes pour le tampon bicarbonate et les deux conditions de tampon de nigéricine peuvent doivent être effectuées deux fois : une fois pour déterminer le microscope paramètres et une seconde fois pour recueillir des données expérimentales. Reportez-vous à la section 2.2 ci-dessous pour plus d’informations.
<ol><li>Montage et dissection Remarque : pour les matériaux nécessaires pour réaliser cette étape, veuillez vous reporter à la Figure 1 et Table des matières. Pour chambres de montage imprimé 3D, fichiers d’imprimante 3D sont fournies comme supplémentaire fichier 1 et 2 de fichier supplémentaire.
	<ol><li>Dissection : <ol><li>chambres montage Prepare en appliquant une fine couche de graisse sous vide sur le côté plat de la 3D imprimés salle de montage. Placez ce côté sur une lamelle de 22 x 40 mM pour sceller la lamelle à la chambre de montage.</li>
		</ol></li> <li>Disséquer les ovaires des femelles adultes mouches dans 500 µL de tampon de dissection (tampon bicarbonate ou nigéricine, tableau 3) <ol><li>anesthésier les mouches de 3-4 à l’aide de CO 2 gaz et transfert vole sur un bloc de mouche perfusé avec CO 2 gaz.</li>
			<li>Ramasser une mouche anesthésiée avec pince et placez dans le milieu de dissection.</li>
			<li>Pincer le thorax de la mouche avec un instrument, tout en tirant sur l’extrémité de son abdomen jusqu'à ce que ses ovaires affleurent.</li>
			<li>Après avoir détaché les ovaires des autres organes, distinguer les ovarioles aide 22 1/2 aiguilles de seringue. Soigneusement séparé du muscle gaine des ovaires et des ovarioles individuels séparés du cluster d’ovarioles. Une technique efficace pour isoler la gaine musculaire consiste à utiliser une aiguille de seringue pour tenir la grappe d’ovarioles en place à son extrémité antérieure et la course vers le bas le long du seul ovarioles.</li>
			<li>Incuber les ovaires disséqués dans les médias de dissection pendant exactement 10 minutes avant de procéder à l’étape de montage afin qu’il y a assez de temps pour le pHi de cellules de pleinement s’équilibrer avec le pH du milieu dissection nigéricine. 
			Remarque : Assurez-vous que la gaine du muscle est prélevée les ovarioles. La gaine du muscle peut atténuer le signal de fluorescence, ce qui rend difficile l’identification des cellules individuelles à l’aide de concanaviline-A et peut causer des ovarioles se déplacer spontanément pendant direct imaging.</li>
		</ol></li> <li>Montage <ol><li>placer une petite goutte de géloses de dissection sur la lamelle de verre à l’intérieur de la salle de montage.</li>
			<li>Transfert séparés ovarioles avec une pincette.</li>
			<li>Séparer plus tard chambers d’oeufs de stade de germaria associé avec des chambres d’oeuf étape antérieures et faire en sorte que le germaria disséqué sont placés au centre de la goutte de médias de dissection.</li>
			<li>Ajouter deux petites gouttes de vernis à ongles aux côtés opposés d’une lamelle de 12 mm ronde et laissez-le sécher pendant environ 10 à l’air s.</li>
			Lamelle de <li>lieu le tour sur la chute des médias de dissection contenant séparé germaria telle que ce côté avec vernis à ongles pointe vers le bas et entre en contact avec les médias de la dissection. Appuyez sur les pièces du bord avec vernis à ongles à s’aplatir et de garantir la germaria en position. Nous recommandons l’utilisation de vernis à ongles plus âgés car il bave moins, sur la surface de la lamelle couvre-objet, tel qu’il est actuellement maintenu en place.</li>
			<li>Remplir la chambre de montage avec les médias de dissection supplémentaires. État tampon spécifique qui ne contient-elle pas de colorant de concanavaline-A peut être utilisé pour remplir la chambre de. 
			NOTE : Le temps total passé à disséquer et montage ne doit pas dépasser 15 minutes. Ceci est important afin de minimiser les effets des lésions tissulaires et la mort des cellules.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Imagerie live : Remarque : dans cette étape, d’abord rassembler des images de la condition de bicarbonate et les deux conditions de nigéricine pour déterminer les paramètres appropriés de microscope, microscope ajustez-les si nécessaire, et puis recueillir les images pour les données expérimentales. Utiliser un microscope confocal capable d’imagerie dans 3 canaux : GFP (excitation/475 509 d’émission), mCherry (575 excitation/610 d’émission) et rouge sombre (633 excitation/647 emission). 
	NOTE : Paramètres de Microscope : les intensités de pixels des images recueillies seront quantifiées pour déterminer les estimations de pHi, il est donc important que les valeurs d’intensité du signal dans chaque ensemble d’images n’est ni trop faible ni trop saturées. La gamme d’intensités qui peuvent être capturés dans une image est définie par le nombre de bits d’image. Dans de nombreux cas, images 8 bits sont générés par défaut, mais il est recommandé d’acquérir les données sous forme d’images 16 bits, qui ont une gamme dynamique plus large. Il est important de s’assurer que la diaphonie entre canaux fluorescent est réduite au minimum, donc les paramètres doivent être ajustées afin que le spectre d’émission prélevés chaque fluorophore ne se chevauche pas. Pour tester ces paramètres, prendre une image de l’échantillon en utilisant le spectre d’excitation de GFP et s’accumuler dans le spectre d’émission pour mCherry et vice versa. Si les paramètres ont été ajustés correctement, il ne faut aucun signal dans les deux cas. Définissez les paramètres de microscope (p. ex., réglages de tension sur un laser à balayage confocal, laser puissance et trou d’épingle taille) afin que les intensités de pixel du signal dans tous les ensembles de trois images sont dans la gamme dynamique du fichier image. Pour toutes nos expériences, nous avons utilisé une blanche lumière laser scanning microscope confocal avec un objectif 40 x pour acquérir des images 16 bits en format de 1 024 × 1 024, alors que nous avons optimisé le gain en tension pour chaque expérience selon les besoins. Par exemple, dans une expérience, nous avons mis le gain en tension de GFP, mCherry et rouge sombre que 37,8 %, 72,9 % et de 260 %, respectivement.
	<ol><li>Image ovarioles dans un tampon dissection nigéricine à pH 6,5 et ajuster les paramètres tels que les intensités de pixels des images pHluorin et mCherry sont faibles, mais pas en dessous de la limite de détection de la caméra.</li>
		<li>Image d’une autre série d’ovarioles dans un tampon dissection nigéricine à pH 7,5 et régler les paramètres de sorte que les intensités de pixels des images pHluorin et mCherry sont élevés, mais pas saturé.</li>
		<li>Image ovaires dans la dissection de bicarbonate tampon et faire en sorte que les intensités de pixels des images pHluorin et mCherry ne sont pas saturées avec les paramètres choisis. Si les pixels sont saturés, ajustez les paramètres si nécessaire. 
		Remarque : Microscope de paramètres peuvent différer basé sur la configuration de microscope exact utilisée et doit être optimisé pour chaque expérience. Après ont défini les paramètres de microscope, ne changent pas leur jusqu'à la fin de l’expérience. Les paramètres doivent être conformes à travers le contrôle et les conditions expérimentales. Dans nos expériences de pHi initiale, nous avons généré des courbes d’étalonnage nigéricine point 2 et 3 et observé aucune différence significative entre le pHi calculée en utilisant les deux méthodes. Toutefois, en règle générale, l’ajout de plusieurs points de la courbe d’étalonnage devrait améliorer la précision. Nous recommandons donc de générer des courbes avec différents nombres de points afin de déterminer combien est nécessaires pour un ensemble donné de conditions expérimentales.</li>
	</ol></li> <li>Collecte des données : <ol><li>effectuer la dissection, de montage et d’imagerie des échantillons dans les conditions de tampon bicarbonate et nigéricine. Après dissection et le montage, le temps maximal passé une série d’échantillons d’imagerie ne doit pas dépasser 45 min pour vérifier que les mesures d’intensité de fluorescence sont apportées dans les tissus vivants, en bonne santé.</li>
		<li>Pour chaque condition, acquisition d’images au moins 5 germaria.</li>
	</ol></li></ol> 3. Après le procès : Analyse d’Image <ol><li><ol><li>fond des intensités de fluorescence mesure FSC, PFC, et cellules folliculaires soustraction : <ol><li>Open images à Fidji avec chaque canal dans une fenêtre séparée (en l’État la figure 4).</li>
			<li>Utiliser l’outil rectangle pour dessiner une zone d’intérêt (ROI) dans la fenêtre de canal de pHluorin dans une partie de l’image sans signal.</li>
			<li>Facultatif étape : définir la limite inférieure du seuil pour que les pixels dont les valeurs d’intensité inférieure à fond sont exclues et réglez la limite supérieure du seuil maximum. Lorsque le seuil est défini de cette manière, les zones de l’image sans signal sont pour la plupart en bleus et le signal est bien visible ( Figure 4 a).</li>
			<li>Mesure la moyenne intensité de fluorescence dans le retour sur investissement. Si le seuil a été défini à l’étape 3, assurez-vous de vérifier la &#34; limite de seuil &#34; boîte dans la boîte de dialogue définir les mesures.</li>
			<li>Soustraire l’intensité mesurée d’arrière-plan de chaque canal et la tranche de l’image en utilisant la fonction Subtract, dans le processus &#8594; menu Math.</li>
			<li>Répéter étapes 3.1.1.2-6 pour la fenêtre de canal mCherry sauf que, à l’étape 3.1.1.2, au lieu de dessiner un nouveau rectangle avec l’outil rectangle, utilisez la fonction de sélection de restauration, trouvé dans l’édition &#8594; menu de sélection, d’ajouter un rectangle avec les mêmes Dimensions et la position sur l’image.</li>
		</ol></li> <li>Identifier FSC, les PFC et les cellules folliculaires : <ol><li>identifier le FSC, les PFC et les cellules folliculaires de la morphologie et l’emplacement à l’aide de la coloration de la concanavaline A à trouver les limites de la cellule ( Figure 2).</li>
			<li>FSC est minces cellules triangulaires situés sur le bord de la germarium à la frontière de 2 a/2 b région. Si mCherry::pHluorin est exprimé en un clone FSC, FSC peut également être identifié comme la cellule plus antérieure du clone.</li>
			<li>PFC est des cellules de forme irrégulières en région 2 b, en aval du FSC et immédiatement adjacent à.</li>
			<li>Cellules folliculaires sont des cellules carrées ou en colonnes qui entourent le kyste de cellules germinales dans la région 3.</li>
		</ol></li> <li>Obtenir des rapport d’intensité de fluorescence <ol><li>choisir une ou plusieurs tranches dont la cellule d’intérêt a plus forte intensité de fluorescence dans le canal de mCherry et de s’assurer que la coloration de la concanavaline A, vu dans le canal rouge sombre, est dans le foc nous au sein de la tranche sélectionnée.</li>
			<li>ROI attirer autour de chaque FSC et mesure l’intensité de fluorescence moyenne de pHluorin et mCherry dans toutes les tranches choisie pour les mesures.</li>
			<li>Diviser l’intensité de fluorescence moyenne du canal pHluorin par l’intensité de fluorescence moyenne du canal mCherry à calculer un ratio de pHluorin à fluorescence mCherry.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>PHi de dériver des valeurs et générer des images pseudocolored <ol><li>valeurs pHi Derive <ol><li>dans tous les cas, la courbe de régression linéaire doit être générée à l’aide d’ovaires de mouches du même génotype à la fois expérimentale et des conditions de contrôle. Générer une courbe de régression linéaire pour chaque type de cellule en utilisant les données de deux conditions de tampon de nigéricine ( Figure 3). Dans Excel, cela peut être fait en traçant les données sur un graphique et en ajoutant une courbe de tendance linéaire. Alternativement, voir :</li> <li>utiliser la pente et l’ordonnée à l’origine de la courbe de régression linéaire calculées à partir des conditions de nigéricine et l’équation d’une ligne (y = mx + b) pour convertir le pHluorin mCherry ratio valeurs calculée à partir des échantillons dans le bicarbonate condition aux valeurs de pH. Dans cette équation, substituer la forme de pente (l’ordonnée) pour b, mettre la valeur du ratio en x et résoudre pour y.</li>
		</ol></li> <li>Générer une image pseudocolored reflétant les valeurs de ratio à Fidji.
		<ol><li>Suivre la procédure ci-dessus pour la soustraction de l’arrière-plan (étape 3.1.1 et Figure 4).</li>
			<li>Diviser le canal pHluorin du canal mCherry à l’aide de la fonction calculatrice de l’Image, dans le menu de processus. N’oubliez pas le &#34; nouvelle fenêtre créer &#34; et &#34; résultat 32 bits (float) &#34; cases à cocher sont les deux joueurs checkent. Modifier la table de correspondance (LUT), trouvé dans le menu Image, thermique ou LUT de choix. Voir la Figure 4 pour les autres possibilités de passage.</li>
			<li>Dans la boîte de dialogue ajuster luminosité et contraste (Image &#8594; Adjust &#8594; luminosité/contraste), cliquez sur le &#34; mis &#34; bouton. Jeu Minimum affiche la valeur 0 et la valeur maximale affichée valeur un ratio qui capture le mieux les données, généralement de 1,0 à 2,0 ( Figure 5).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+H%2B+efflux+is+sufficient+to+induce+dysplasia+and+necessary+for+viability+with+oncogene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression.</a> eLife. 03270, (2015).</li>
<li>Ulmschneider, B., Grillo-Hill, B. K., Benitez, M., Azimova, D. R., Barber, D. L., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+intracellular+pH+is+necessary+for+adult+epithelial+and+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Increased intracellular pH is necessary for adult epithelial and embryonic stem cell differentiation.</a> J. Cell Biol. 215 (3), 345-355 (2016).</li>
<li>Han, J., Burgess, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Indicators+for+Intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+reviews%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Indicators for Intracellular pH.</a> Chemical reviews. 110 (5), 2709-2728 (2010).</li>
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<li>Choi, C. -H., Webb, B. A., Chimenti, M. S., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+sensing+by+FAK-His58+regulates+focal+adhesion+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">pH sensing by FAK-His58 regulates focal adhesion remodeling.</a> J. Cell Biology. 202 (6), 849-859 (2013).</li>
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<li>Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+imaging+of+pH+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ratiometric imaging of pH probes.</a> Methods in Cell Biol. 123, 429-448 (2014).</li>
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<li>Margolis, J., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+behavior+of+epithelial+stem+cells+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification and behavior of epithelial stem cells in the Drosophila ovary.</a> Development. 121 (11), 3797-3807 (1995).</li>
<li>Nystul, T. G., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epithelial+niche+in+the+Drosophila+ovary+undergoes+long-range+stem+cell+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">An epithelial niche in the Drosophila ovary undergoes long-range stem cell replacement.</a> Cell stem cell. 1 (3), 277-285 (2007).</li>
<li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neuro%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in neuro. 24 (5), 251-254 (2001).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous décrivons ici une méthode de mesure du pHi des cellules de la lignée FSC dans le tissu de type sauvage. Ce protocole a été développé et affiné au cours des cinq dernières années, puisque nous avons commencé à étudier pHi dans drosophile tissu ovarien. Pendant ce temps, le protocole a été utilisé avec succès par plusieurs chercheurs dans notre laboratoire et au moins quatre disques de rotation différents et les microscopes à balayage laser. La reproductibilité de notre observation originale, que pHi augmenta...

Études récentes ont révélé un rôle pour les modifications du pHi pendant cellulaire différenciation et dysplasie en vivo1,2. Ces études ont montré que pHi est remarquablement constant dans les cellules du même type au même stade de différenciation, mais qu’il change à mesure que les cellules de transition d’un stade à l’autre. Dans certains cas, bloquant les changements pHi partiellement perturbe la différenciation, ce qui suggère que le changement du pHi n’est pas simplement une conséquence des changements dans le sort de la cellule mais contribue plutôt à promouvoir le changement dans le destin cellulaire, peut-être par le biais des effets sur la régulation pH sensibles les protéines ou les réactions chimiques nécessaires à la différenciation. Les études à venir sont susceptibles de révéler plus de perspicacité dans les nombreux différents rôles de pHi dynamics in vivo. Toutefois, l’un des défis d’étudier le pHi au cours de la différenciation in vivo est d’obtenir des mesures précises de pHi. Contrairement à d’autres caractéristiques de différenciation, comme les changements dans la morphologie cellulaire et l’expression des gènes, pHi est une propriété chimique labile de la cellule qui n’est pas conservée dans les cellules qui ont été fixés et perméabilisées avec des méthodes standard. En outre, pHi peut-être pas stable dans les cellules qui sont stressés ou de mourir à la suite de la manipulation expérimentale. Ainsi, il est important de garder les cellules vivant et en bonne santé que possible lors de la mesure de pHi. Plusieurs colorants vitaux sont disponibles que fonctionnent bien pour mesurer le pHi de cellules en culture3, mais dans de nombreux cas, ils ne sont pas appropriées pour in vivo études parce qu’ils ne pénètrent pas le tissu profondément ou uniformément assez pour fournir des mesures précises .
Pour contourner le problème de la pénétration du colorant pauvres, nous et autres avons utilisé une sonde génétiquement encodée, mCherry::pHluorin4,5,6,7, qui peut être exprimé plus précisément dans la cellule types d’intérêt et imagés dans des tissus vivants. pHluorin est une variante de GFP avec un pKa plus élevé (~ 7.0 vs ~ 4.0) qui se plie plus facilement à des pH plus élevés ; Si l’intensité de fluorescence totale émise par une population de pHluorin molécules dans la cellule augmente avec le pHi8. Ce qui est important, la fluorescence est linéaire dans la plage normale cytosolique des valeurs de pHi. En revanche, la fluorescence de la mCherry (pKa ~ 4,5) est insensible aux variations de pH comprise entre cytosolique. Ces deux journalistes sont liées de façon covalente ensemble comme une seule protéine chimérique, codée par un cadre de lecture unique, donc ils sont toujours présents en quantités égales. Par conséquent, le ratio de pHluorin à l’intensité de la fluorescence mCherry fournit une mesure de pHi qui est normalisée à la concentration de sonde dans chaque cellule. Les ratios peuvent ensuite être convertis aux estimations des valeurs de pHi à l’aide d’une courbe d’étalonnage qui est générée en obtenant la pHluorin mCherry ratios de tissus qui ont été équilibrés à des valeurs de pH connus.
Nous décrivons ici les méthodes pour l’utilisation de mCherry::pHluorin pour mesurer le pHi de la lignée épithéliale de FSC dans l’ovaire de la drosophile . Ce tissu bien caractérisé a été utilisé pour modéliser les nombreux aspects de la biologie épithéliale, tels que les cellules souches autorenouvellement et différenciation9,10,11, migration des cellules collectives12 , le développement et la maintenance de la cellule polarité13,14. L’épithélium folliculaire est produit par deux sociétés qui résident au bord antérieur du tissu dans une structure appelée le germarium15,16. Ces cellules se divisent régulièrement au cours de l’âge adulte pour se renouveler et de produire des descendants, appelées cellules prefollicle (PFC), qui peuvent rentrer dans la niche et devenir une FSC ou se différencient en un des trois types de cellules différents follicule : cellules polaires, des cellules de tige, ou cellules de l’organisme principal de follicule. Nous avons démontré précédemment que dans les tissus de type sauvage, le pHi augmente progressivement durant les premiers stades de différenciation, d’un pHi environ 6.8 en FSC à 7,0 dans HPF, 7.3 en follicule cellules2. Bloquer cette augmentation par ARNi précipitation d’un échangeur de sodium/proton ubiquitaire expresse, DNhe2, altère la différenciation pFC gravement, mais bien que pHi a augmenté la surexpression des DNhe2 entraîne une différenciation excès douce phénotype. Ces résultats démontrent que le pHi est solidement maintenu dans la lignée FSC au début et qu’il peut être expérimentalement augmente ou diminue en vivo. Les méthodes décrites ici peuvent servir à mesurer les pHi en tissu de type sauvage ou diverses formes de tissus mutants, y compris les Arni knockdown ou surexpression utilisant un Gal4 d’intérêt et des clones mitotiques.

<table><tbody><tr><td>Fly Stocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UAS-mCherry ::p Hluorin[1]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>y1 w* ; P{GawB}10930/CyO</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>7023</td><td></td></tr><tr><td>Act-Gal4 stock rabattable Bloomington</td><td>Stock Center</td><td>4409</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Chemicals for Buffer Preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-3911</td><td></td></tr><tr><td>glucose</td><td>Mallinckrodt</td><td>4912</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-5080</td><td></td></tr><tr><td>HCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-9272</td><td></td></tr><tr><td>NMDG+</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-2004</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>7088</td><td>Utiliser pour fabriquer KHPO4 pH 7.4</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP362</td><td>Utiliser pour fabriquer KHPO4 pH 7.4</td></tr><tr><td>Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugué</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C21421</td><td>0,25 mg/ml dilution</td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N1495</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments<</td></tr><tr><td>strong>Outils de dissection et de montage</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 Dumont Pince en inox (Taille 5)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9473431</td><td></td></tr><tr><td>2 aiguilles de seringue de calibre 23</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z192457</td><td></td></tr><tr><td>Plat de dissection en verre à 9 puits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-748B</td><td></td></tr><tr><td>Graisse sous vide</td><td>Dow Corning</td><td>1018817</td><td></td></tr><tr><td>22 X 40 mM lamelles en verre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12545C</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles rondes en verre, 12 mm de diamètre, 0,13-0,16 mm d’épaisseur</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>26023</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de montage 3D</td><td>fabriquée sur</td><td></td> <td>mesure.stl et .ipt fichiers pour imprimante 3D inclus en tant que fichiers supplémentaires</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Other equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-mètre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-620-183A</td><td>Modèle : Microscope de dissection Accumet AB15</td></tr><tr><td>Olympus</td><td>Corporation</td><td>0H11436</td><td>Modèle : Microscope confocaux SZ2-ST</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td> à balayage laser <td>Leica Biosystems</td><td></td><td>SP5 ou SP8 avec un objectif 40&times avec une ouverture numérique de 1,3</td></tr></tbody></table>

méthodes pour le ph intracellulaire d’imagerie de la lignée de cellules souches de follicule en live drosophile de tissu ovarien

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Variations de pH intracellulaire (pHi) jouent un rôle important dans la régulation de nombreuses fonctions cellulaires, y compris le métabolisme, la prolifération et la différenciation. En général, pHi dynamique est déterminée dans des cellules cultivées, qui sont prêtent bien à mesurer et manipuler expérimentalement pHi. Cependant, le développement récent de nouveaux outils et de méthodologies a permis d’étudier pHi dynamique au sein de tissus intacts, vivre. Pour la recherche de la drosophile , une évolution importante a été la génération d’une lignée transgénique portant un biocapteur pHi, mCherry::pHluorin. Nous décrivons ici un protocole que nous utilisons régulièrement pour imagerie live Drosophila ovarioles pour mesurer pHi dans la lignée de cellules souches (FSC) épithéliales folliculaires dans mCherry::pHluorin transgénique de type sauvage lignes ; Cependant, les méthodes décrites ici peuvent être facilement adaptés pour les autres tissus, y compris les disques alaires et l’épithélium de le œil. Nous décrivons les techniques pour exprimer des mCherry::pHluorin dans la lignée de la FSC, maintien des tissus ovariens pendant direct imaging, acquisition et analyse d’images pour obtenir les valeurs de pHi.

Ici, nous avons décrit le processus de mesure pHi dans l’épithélium folliculaire, qui implique plusieurs étapes. Tout d’abord, les ovaires sont disséqués de mouches du génotype approprié à l’aide des outils de dissection et de fixation (Figure 1). Les ovarioles sont imagés puis à l’aide de la microscopie en fluorescence quantitatives et les images sont analysés pour obtenir des mesures de pHi. Pour chaque image, les types de cellules d’intérêt sont identifiés...

Nous fournissons un protocole d’imagerie pH intracellulaire d’une lignée de cellules souches épithéliales en direct tissus ovariens de drosophile . Nous décrivons des méthodes pour générer des mouches transgéniques exprimant un biocapteur de pH, le mCherry::pHluorin, l’image le biocapteur utilisant l’imagerie par fluorescence quantitatives, générer des courbes standard et convertir les valeurs d’intensité de fluorescence aux valeurs de pH.

Méthodes pour le pH intracellulaire d’imagerie de la lignée de cellules souches de follicule en Live drosophile de tissu ovarien

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

L’objectif global de cette procédure est de mesurer le pH intracellulaire des cellules folliculaires dans le tissu ovarien de la drosophile vivante explantée. Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés en biologie des cellules souches et du développement, telles que la façon dont les modifications du pH intracellulaire contribuent aux décisions relatives aux sulfates. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de quantifier avec précision le pH dans les tissus vivants intacts.Pour commencer l’expérience, préparez les chambres de montage en appliquant une fine couche de graisse sous vide sur le côté le plus plat d’une chambre de montage imprimée en 3D. Placez le côté le plus plat sur une lamelle de 22 x 40 millimètres pour sceller la lamelle de protection sur la chambre de montage. Ensuite, disséquez les ovaires de mouches adultes femelles dans 500 microlitres de tampon de dissection.Anesthésie trois à quatre mouches à l’aide de gaz CO2 et transfère les mouches sur un coussin anti-mouches. À l’aide d’une pince, sélectionnez une mouche et placez-la dans le milieu de dissection. Pincez le thorax de la mouche avec une paire de pinces tout en tirant sur le bout de son abdomen jusqu’à ce que ses ovaires soient exposés.Réglez une minuterie sur exactement 10 minutes. Après avoir détaché les ovaires des autres organes, séparez les ovarioles à l’aide de 22 aiguilles de seringue de calibre 22 et demi. Utilisez une aiguille de seringue pour maintenir le groupe d’ovaires en place à son extrémité antérieure et passez vers le bas sur la longueur des ovarioles simples pour séparer soigneusement la gaine musculaire des ovaires.Incuber les ovaires disséqués dans un milieu de dissection pour le reste du temps sur la minuterie. Il est important que les ovaires restent dans le milieu de dissection pendant exactement 10 minutes pour laisser suffisamment de temps aux cellules. Placez une petite goutte de support de dissection sur la glissière du couvercle en verre à l’intérieur de la chambre de montage.Transférez les ovarioles séparés à l’aide d’une pince. Séparez les chambres d’œufs de stade avancé des germaria associés aux chambres d’œufs de stade antérieur et assurez-vous que les germaria disséqués sont placés au centre de la chute de média de dissection. Ajoutez deux petites gouttes de vernis à ongles sur les côtés opposés d’environ 12 millimètres et laissez sécher à l’air libre pendant environ 10 secondes.Placez la lamelle ronde sur la goutte du support de dissection contenant des germes séparés, de sorte que le côté avec le vernis à ongles soit tourné vers le bas et entre en contact avec le support de dissection. Appuyez sur les bords pour aplatir et fixer le germaria en position. Remplissez la chambre de montage avec des supports de dissection supplémentaires et passez à l’imagerie en direct.Image des ovarioles dans un tampon de dissection ny à pH 6,5. Ajustez les paramètres de sorte que l’intensité des pixels des images pHluorin et mCherry soit faible, mais pas inférieure aux limites de détection de la caméra. Ensuite, imagez un autre ensemble d’ovarioles dans le tampon de dissection de nygerion à pH 7,5 et ajustez les paramètres de sorte que les intensités de pixels des images pHluorin et mCherry soient élevées mais non saturées.Imagez les ovaires et le tampon de dissection bicarbonatée et assurez-vous que les intensités de pixels des images pHluorin et mCherry ne sont pas saturées avec les paramètres choisis. Si les pixels sont saturés, ajustez les paramètres. Après avoir sélectionné les paramètres d’imagerie en direct appropriés, procédez à la collecte d’images d’au moins cinq germaria dans chacune des conditions.Soustrayez l’arrière-plan en ouvrant les images non traitées aux Fidji avec chaque canal dans une fenêtre séparée. Utilisez l’outil rectangle pour dessiner une région d’intérêt ou un retour d’intérêt dans la fenêtre du canal pHluorin et une partie de l’image sans signal. Définissez la limite inférieure du seuil de sorte que les pixels dont l’intensité est inférieure à l’arrière-plan soient exclus et définissez la limite supérieure du seuil au maximum.Lorsque le seuil est réglé de cette manière, les zones de l’image sans signal sont principalement bleues et le signal est clairement visible. Si le seuil a été défini, accédez à la boîte de dialogue Définir les mesures et assurez-vous de cocher la case Limiter au seuil. Mesurez l’intensité moyenne de fluorescence dans le ROI, allez dans le menu Processus, puis dans le menu mathématique pour soustraire l’intensité d’arrière-plan mesurée de chaque canal et tranche de l’image à l’aide de la fonction de soustraction.Répétez les étapes pour la fenêtre de la chaîne mCherry, mais utilisez la fonction de restauration de la sélection au lieu de dessiner un nouveau rectangle avec l’outil rectangle trouvé dans le menu d’édition de la sélection, pour ajouter un rectangle avec les mêmes dimensions et position sur l’image. Choisissez une ou plusieurs tranches dans lesquelles la cellule d’intérêt a l’intensité de fluorescence la plus élevée dans le canal mCherry et assurez-vous que la coloration de la concanavaline A dans le canal rouge lointain est nette dans la tranche sélectionnée. Ensuite, dessinez un retour d’intérêt autour de chaque cellule souche folliculaire ou FSC et mesurez l’intensité moyenne de fluorescence de pHluorin et de mCherry et de toutes les tranches choisies pour les mesures.Enfin, divisez l’intensité moyenne de fluorescence du canal pHluorin par l’intensité moyenne de fluorescence du canal mCherry, pour calculer un rapport entre la fluorescence pHluorin et la fluorescence mCherry. Deux germaria ont été imagés à l’aide de la microscopie à fluorescence quantitative avec UAS mCherry pHluorin et 10930 gal 4, colorés avec de la concanavaline A et ROI décrivant la cellule souche folliculaire ou FSC ou PFC et une cellule folliculaire est montrée dans chaque image. Le rapport des intensités de fluorescence dans les canaux GFP et mCherry est converti en valeurs de pH I, à l’aide d’une courbe standard.Le pH I augmente avec la différenciation dans la lignée FSC précoce, passant de 6,8 dans les FSC à 7,0 dans les cellules préfolliculaires à 7,3 dans les cellules folliculaires. Les valeurs de pH I de chaque type de cellule peuvent être représentées sous la forme d’une micrographie pseudo-colorée qui montre les différences de rapports pHluorin à mCherry, affiche ces différences de couleur telles que définies par une LUT. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier d’avoir tous les réactifs à portée de main à l’avance, car de nombreuses étapes de ce protocole sont sensibles au temps.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du développement, pour explorer le rôle du pH dans les décisions de malano gaster intracellulaire des sulfates.

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Developmental Biology

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Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour effectuer une imagerie en direct de la division asymétrique des cellules souches germinales (GSC) dans la niche ovarienne de la drosophile. Nous utilisons une lignée transgénique qui exprime de manière ubiquitaire une fusion de la protéine fluorescente verte (GFP) de la protéine du spectrosome Par-1.

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Méthodes pour le pH intracellulaire d’imagerie de la lignée de cellules souches de follicule en Live drosophile de tissu ovarien (Vidéo) | JoVE Journal

Méthodes pour le pH intracellulaire d’imagerie de la lignée de cellules souches de follicule en Live drosophile de tissu ovarien

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