Détection de potentiel de Membrane des mitochondries pour étudier CLIC4 HN4 induite par le Knockdown cellule Apoptosis In Vitro

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine cytobiologique, notamment la compréhension de l’apoptose et du dysfonctionnement des mitochondries. Le principal avantage de cette technique est que les chercheurs peuvent facilement et correctement effectuer la surveillance en temps réel du potentiel membranaire des mitochondries via la rhodamine-123 au sein d’une seule cellule. Cultiver une lignée cellulaire HN4 à partir d’un carcinome épidermoïde à cellules de la tête et du cou, comme décrit dans le protocole textuel.

Un jour avant la transfection, mettez en boîte 0,5 million de cellules dans deux millilitres par puits de milieu de culture sans antibiotiques dans des plaques à six puits. Diluez doucement 100 picomoles de petit ARN interférent CLIC4 ou de petit ARN interférent brouillé dans 250 microlitres de milieu sérique réduit. Diluez ensuite cinq microlitres de réactif liposomique dans 250 microlitres de milieu sérique réduit et incubez pendant cinq minutes.

Combinez le petit ARN interférent dilué avec le réactif liposomique dilué et mélangez doucement. Ajouter le mélange dans chaque puits contenant des cellules dans le milieu. Mélangez doucement en balançant l’assiette d’avant en arrière.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur à CO2. Remplacez le milieu par un milieu de croissance normal quatre heures après la transfection. Continuez à incuber les cellules pendant 20 heures supplémentaires avant de procéder à la procédure de marquage à la rhodamine-123.

Après le traitement par ARN interférent CLIC4 des cellules HN4 dans des plaques à six puits, utilisez une pince à épiler pour placer des lamelles circulaires au fond des nouvelles plaques à 12 puits. Pipette 150 microlitres de 100 microgrammes par millilitre de polylysine au milieu de chaque lamelle à l’intérieur des plaques de 12 puits. Après deux minutes, retirez soigneusement la polylysine à l’aide d’un pipeteur.

Ensuite, retirez le milieu de culture des cellules HN4 à l’intérieur de la boîte et ajoutez un millilitre de trypsine à 0,25 % pour détacher les cellules. Après six minutes, ajoutez deux millilitres de milieu de culture pour neutraliser la trypsine. Mélangez doucement les cellules HN4 à l’aide d’une pipette cinq fois et ensemencez les cellules sur des lamelles circulaires.

Placez les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2. Après huit heures d’incubation, ajoutez deux micromoles par litre de rhodamine-123 et mélangez doucement le milieu de haut en bas plusieurs fois pour assurer une répartition uniforme dans le milieu. Incuber les cellules HN4 pendant 40 minutes à 37 degrés Celsius.

À l’aide d’une pince à épiler, retirez les lamelles et transférez-les brièvement dans un tampon NPSS préchauffé pour laver le liquide restant. Placez les lamelles sur le fond de la chambre en acier inoxydable de 500 microlitres avec un fond en verre remplaçable de 25 millimètres scellé en place par un joint torique. Fixez les lamelles en place en serrant le couvercle sur la chambre.

Ajoutez 450 microlitres de tampon NPSS préchauffé dans la chambre assemblée. Placez ensuite le bain sous le champ visuel du microscope à fluorescence ou du microscope confocal à fluorescence à balayage laser. Allumez le microscope à fluorescence en suivant les instructions du fabricant.

Ouvrez le logiciel du système d’imagerie et sélectionnez le bouton nouveau dans la barre de commandes pour commencer une nouvelle expérience. Ajustez le champ visuel et la mise au point pour trouver l’emplacement des cellules dans la lumière blanche. Éteignez ensuite la lumière et appuyez sur le bouton pour fermer la lumière blanche.

Cliquez sur le bouton de mise au point dans la barre de commandes et sélectionnez Démarrer la mise au point pour activer la fluorescence. Trouvez à nouveau l’emplacement des cellules à l’aide du microscope avec une excitation de 507 nanomètres et une longueur d’onde d’émission passe-long de 529 nanomètres. Ajustez le champ visuel et faites à nouveau la mise au point si nécessaire.

Sélectionnez un champ visuel contenant uniquement 20 à 30 cellules HN4 séparées. Une fois que vous avez obtenu un champ visuel clair, cliquez sur Fermer la mise au point dans la barre de mise au point. Cliquez ensuite sur en acquérir un dans la barre de commandes pour acquérir un ensemble d’images.

Ensuite, cliquez sur régions dans la barre de commandes, puis cliquez sur le bouton OK pour modifier les régions de mesure. Pour s’adapter aux différentes formes de cellules individuelles, sélectionnez l’outil de région de trace. Encerclez la région d’une seule cellule et double-cliquez lorsque vous avez terminé.

Répétez la procédure jusqu’à ce que toutes les cellules soient encerclées. Cliquez sur OK et sélectionnez Enregistrer les images pour trouver l’emplacement enregistré. Cliquez sur l’horloge zéro et appuyez rapidement sur F4 pour commencer à surveiller le changement d’intensité de fluorescence.

Enregistrez le changement en temps réel de l’intensité de la fluorescence une fois toutes les cinq secondes pendant cinq minutes. Lorsque la ligne de base devient stable, ajoutez 50 microlitres de NPSS mélangés à 0,5 microlitre d’ATP de 100 millimoles par litre dans la chambre à l’aide d’un pipeteur. Allumez le microscope confocal à fluorescence à balayage laser en suivant les instructions du fabricant et ouvrez le logiciel fourni.

Cliquez sur objectif dans le menu d’acquisition pour sélectionner l’objectif à huile à ouverture numérique 63X 1.4. Observez l’échantillon et trouvez un champ visuel clair sous le champ lumineux. Appuyez sur le bouton de sélection de la lumière pour passer en mode fluorescence et sélectionnez les filtres de fluorescence appropriés pour trouver l’emplacement de la cellule dans l’obscurité via le microscope.

Poussoir pour protéger l’échantillon lorsque l’observation est terminée. Dans le menu d’acquisition, ajustez le canal PMT approprié et cliquez sur Réaliser pour activer le chemin optique réglé. Cliquez sur le menu de configuration et choisissez laser pour déterminer le type de laser requis.

Cliquez en direct pour obtenir des images en temps réel et assurez-vous que le champ visuel ne contient que 20 à 30 cellules HN4 séparées. Ensuite, sélectionnez XYT en mode d’acquisition dans le sous-menu d’acquisition du menu d’acquisition. Définissez cinq secondes pour l’intervalle de temps et 20 minutes pour la durée.

Cliquez sur Appliquer lorsque tous les paramètres sont réglés. Dans le menu Quantifier, utilisez l’outil Dessiner une polyligne pour entourer la zone d’enregistrement de chaque cellule. Sélectionnez le profil de la ligne et choisissez Démarrer pour effectuer l’observation.

Enregistrez le changement en temps réel de l’intensité de la fluorescence pendant cinq minutes. Lorsque la ligne de base devient stable, ajoutez 50 microlitres de NPSS mélangés à 0,5 microlitre de 100 millimoles par litre d’ATP dans la chambre à l’aide d’une pipette. Pour effectuer une analyse statistique à l’aide d’un microscope à fluorescence courant, ouvrez le logiciel du système d’imagerie et sélectionnez le bouton Ouvrir dans la barre de commandes pour ouvrir une expérience enregistrée.

Cliquez sur Régions dans la barre de commandes, puis cliquez sur le bouton OK pour modifier les régions de mesure. Sélectionnez l’outil de région de trace. Encerclez la région d’une seule cellule et double-cliquez lorsque vous avez terminé.

Répétez la procédure jusqu’à ce que toutes les cellules aient été encerclées. Cliquez sur OK et sélectionnez le bouton F4 avant pour obtenir une trace indiquant l’intensité de fluorescence. Une fois terminé, cliquez sur le bouton fléché vers le bas situé dans le coin inférieur droit du graphique, puis cliquez sur afficher les données du graphique.

Cliquez deux fois sur OK et choisissez le bouton de journal des données pour ouvrir l’interface du logiciel de traitement des données. Cliquez ensuite à nouveau sur les données de journal pour trouver les enregistrements de fluctuation en temps réel de l’intensité de fluorescence qui apparaissent sur la feuille de calcul. Voici des résultats représentatifs montrant des changements de dépolarisation mitochondriale induits par l’ATP dans la cellule HN4 sous différentes interventions, tels que résolus par la microscopie à fluorescence commune.

La dépolarisation de la membrane mitochondriale a rapidement augmenté après le traitement à l’ATP et s’est progressivement rétablie à un niveau normal dans les deux groupes. Des traces représentatives d’intensité fluorescente de la rhodamine-123 démontrent que le traitement MMP du petit ARN interférent CLIC4 a amélioré la dépolarisation mitochondriale par rapport au groupe témoin. Un histogramme représentatif a en outre révélé que l’inactivation de CLIC4 augmentait la dépolarisation mitochondriale par rapport au groupe témoin.

Ici, les résultats représentatifs de la microscopie confocale à balayage laser montrent également des changements de dépolarisation mitochondriale induits par l’ATP dans la cellule HN4 sous différentes interventions. La dépolarisation de la membrane mitochondriale augmente rapidement après le traitement à l’ATP et revient progressivement à un niveau normal dans les deux groupes. Des traces représentatives d’intensité fluorescente de la rhodamine-123 démontrent que le traitement MMP du petit ARN interférent CLIC4 a amélioré la dépolarisation mitochondriale par rapport au groupe témoin.

De même, l’histogramme représentatif a révélé que l’inactivation de CLIC4 augmentait la dépolarisation mitochondriale par rapport au groupe témoin. Après avoir regardé cette vidéo, vous aurez une meilleure compréhension de la façon d’utiliser la rhodamine-123 pour effectuer une surveillance en temps réel du potentiel de la membrane mitochondriale par microscopie à fluorescence normale et microscopie confocale à balayage laser. Une fois maîtrisée, cette technique de microscopie à la rhodamine-123 peut être réalisée en moins de 20 minutes pour un échantillon si elle est réalisée correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas entrer en contact avec la chambre pendant l’injection en attendant le processus de balayage. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que le Western Blot et la cytométrie en flux peuvent être effectuées pour répondre à d’autres questions telles que l’apoptose ou la nécrose. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la science du vivant pour explorer le dysfonctionnement mitochondrial et trouver des preuves solides de l’apoptose cellulaire dans diverses cellules vivantes.

N’oubliez pas que travailler avec de la rhodamine-123 peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de gants et de masques faciaux doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.