Immunostaining des Modifications de l’ADN : Computational Analysis of Images confocales

L’objectif global de cette technique est de fournir un outil informatique permettant d’évaluer la distribution spatiale et l’intensité du signal des modifications de l’ADN, visualisées par immunomarquage au sein des noyaux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’épigénétique, en permettant d’examiner la localisation nucléaire et les niveaux relatifs de modifications de l’ADN dans différents systèmes modèles. Le principal avantage de cette technique est que les modifications de l’ADN sont mesurées par l’amplitude du signal du bot, puis par sa distribution.

L’une des implications de cette technique est qu’elle facilite notre compréhension des rangées fonctionnelles potentielles de modifications de l’ADN dans divers systèmes biologiques. Cette technique a également l’application supplémentaire de l’analyse computationnelle d’autres épitopes détectables par immunohistochimie. Pour commencer, ouvrez les fichiers au format LSM de l’image de microscopie confocale.

Sélectionnez le traitement d’image, puis choisissez l’image souhaitée pour l’analyse. Notez que lors de la comparaison de profils d’intensité entre échantillons, la puissance et le gain du laser doivent être cohérents pour effectuer des comparaisons directes. Ensuite, cliquez sur afficher tout, pour rendre tous les contrôles graphiques visibles, puis sélectionnez l’onglet graphique et choisissez l’outil rectangle pour sélectionner une région contenant les noyaux d’intérêt.

Utilisez ensuite la commande Couper la région pour isoler la région d’intérêt. Enregistrez maintenant l’image sous un nouveau nom et au format LSM ou CZI et rouvrez le fichier dans le logiciel Zen Blue. Ouvrez le pupitre ZEN en Zen Blue, puis utilisez la commande send to ZEN en Zen Black pour ouvrir le fichier en Zen Blue.

Ensuite, activez l’onglet étiqueté 2.5d pour activer la visualisation de l’image en 2.5d. Cliquez sur Afficher tout pour rendre toutes les commandes graphiques visibles et modifier les paramètres à l’aide des quatre barres grises. Les barres contrôlent le zoom, la rotation, l’inclinaison de l’axe, l’expansion et la contraction des barres d’échelle.

Sélectionnez le mode de rendu pour visualiser au mieux les pics individuels, puis modifiez la grande distance en modifiant le pourcentage. Plus le pourcentage est faible, plus chaque pic individuel est défini. Maintenant, avant d’enregistrer l’image 2.5d, cachez la liste des fichiers et les outils graphiques en cliquant sur la flèche grise sous le graphique 2.5d.

Enregistrez ensuite le tracé sous forme de capture d’écran à l’aide de la touche d’impression d’écran du clavier. Ouvrez l’option de traitement d’image dans le logiciel et ouvrez le fichier qui vous intéresse. Ensuite, sélectionnez l’onglet Profil et sélectionnez l’onglet Afficher tout pour accéder à toutes les options de formatage.

Dans l’onglet Profil, choisissez l’option table et le bouton fléché. Utilisez maintenant la souris pour sélectionner un point de départ et tracer une ligne sur un nombre continu de cellules, un tracé d’intensité pour les cellules le long de cette ligne est ensuite généré avec le tableau des mesures d’intensité. Notez que le tableau fournit également la distance à laquelle l’intensité des pixels est rouge pour la fluorescence rouge, verte et bleue.

L’unité est le micron. Pour exporter ces données, faites un clic droit sur le tableau, sélectionnez Enregistrer le tableau et enregistrez-le sous forme de fichier texte. Pour enregistrer le profil d’intensité, choisissez l’option d’exportation, dans la fenêtre contextuelle, basculez deux options, fichier image étiqueté, format et contenu de la fenêtre d’image, volet unique, données.

Suivez ensuite les instructions pour enregistrer le fichier. Répétez maintenant ce processus pour chaque profil d’intensité nécessaire. Dans le logiciel, sélectionnez le traitement d’image et choisissez le fichier image qui vous intéresse.

Sélectionnez ensuite l’onglet intitulé coloc pour l’analyse de co-localisation et sélectionnez Afficher tout pour accéder à toutes les options de formatage. Dans les quatre onglets de la moitié inférieure de l’écran, choisissez la colocalisation et choisissez les options de tableau et d’image. Choisissez ensuite la troisième icône en haut de l’onglet, identifiée par le texte contextuel, fermé besier.

Utilisez cet outil pour encercler un seul noyau. Les valeurs apparaîtront alors dans le tableau et un nuage de points sera produit pour la fluorescence rouge par rapport à la fluorescence verte. L’axe de ce tracé est mobile et celui-ci contrôle le gating de détection.

Toutes les intensités de pixels à l’intérieur du noyau doivent être considérées comme des signaux positifs. Comme les niveaux de modifications de l’ADN varient à travers le noyau, pour prendre en compte les signaux faibles, nous ne portons pas les données. Il convient de souligner ici que l’on peut se demander si les valeurs de fond doivent être incluses dans l’analyse.

Il est important de noter que le coefficient de chevauchement est indépendant des différences d’intensité du signal entre les deux canaux. Alors que le coefficient de corrélation de la personne suppose une relation linéaire entre les signaux. Répétez maintenant ce processus d’encerclement des noyaux afin de compléter l’ensemble de données.

Ensuite, pour exporter les données, faites un clic droit sur le tableau et suivez les options pour enregistrer les données. Pour enregistrer une image de co-localisation, utilisez la commande d’exportation avec les deux options, fichier image balisé, format et contenu du volet unique de la fenêtre d’image, données, puis suivez les options pour enregistrer le fichier. La distribution spatiale de deux déliratifs oxydés de cinq cytosine méthylique a été examinée dans la différenciation des progéniteurs haphadiques, en utilisant le protocole décrit.

Les signaux rouges et verts représentent les deux modifications distinctes de l’ADN. Les signaux sont bien définis avec un chevauchement limité. Conformément aux attentes, les profils des deux intensités de signal et de la cellule correspondante ne coïncident pas fortement l’un avec l’autre.

Le modèle distinct suggère que l’oxydation dépendante du robinet de cinq méthylcytosine peut générer différents dérivés oxydés dans des régions spécifiques de la chromatine. Une comparaison similaire des deux modifications de l’ADN a été faite dans les cellules du médulloblastome de Daoy et dans les cellules de l’épendymome BXD. Les deux lignées cellulaires proviennent de tumeurs cérébrales pédiatriques.

La quantification révèle que les cellules BXD présentent des niveaux significativement plus faibles des deux signaux par rapport aux cellules Daoy. Ensuite, la co-localisation des dérivés oxydés de 5MC a été examinée dans des hiPSC indifférenciés. Dans les 24 heures suivant l’induction de la différenciation de l’endoderme hépatique et des hiPSC.

Dans cette analyse, la co-localisation du signal a changé de manière significative avec l’induction de la différenciation, ce qui peut être attribuable à une amplitude réduite de cinq CAC dans les cellules indifférenciées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des graphiques et des profils d’intensité 2,5d et de la façon de produire des données de co-localisation. Les outils d’analyse et de visualisation d’images décrits ici contribuent à la recherche épigénétique, en fournissant un moyen relativement rapide de comparer les signaux des différentes modifications de l’ADN dans différents groupes expérimentaux.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ une heure si elle est exécutée correctement. Il est important d’éviter la surexposition et d’utiliser les mêmes paramètres pour différents groupes expérimentaux pendant la microscopie. Des bulles d’air dans la monture et une immersion insuffisante peuvent entraîner une perte locale de fluorescence, par conséquent, une inspection visuelle de la zone de balayage est essentielle.

La procédure peut être automatisée en segmentant les noyaux et en créant des régions d’intérêt à l’aide de Zen Blue. Ces régions peuvent être importées dans Zen Black, pour effectuer une analyse de co-localisation sur plusieurs noyaux.