Génération d’un gène-perturbé Streptococcus mutans souche sans gène clonage

L’objectif global de cette procédure est de générer des souches ciblées de Streptococcus mutans perturbées par des gènes à l’aide d’une PCR par fusion en deux étapes et d’une électroporation. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la microbiologie, telles que le fonctionnement d’un gène d’intérêt. Le principal avantage de cette technique est qu’aucune réaction enzymatique autre que la PCR n’est nécessaire et que la préparation compétente des cellules pour l’électroporation est assez simple. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la technique de perturbation du gène de Streptococcus mutans, elle peut également être appliquée à d’autres espèces microbiennes telles que Staphylococcus aureus. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés parce qu’elles ne sont pas familières avec l’efficacité des amorces emboîtées pour la deuxième PCR. La démonstration de la procédure sera faite par le docteur Ayako Okada, un instructeur de recherche de notre laboratoire. Pour commencer cette procédure, appliquez des stres de S.mutans UA159 sur une plaque de gélose cerveau-cœur, de perfusion ou de BHI et incubez la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans des conditions anaérobies. Le lendemain, utilisez un cure-dent stérilisé pour cueillir une seule colonie et inoculez-la dans cinq millilitres de bouillon BHI. Incuber la culture de S. mutans pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans des conditions anaérobies. Ensuite, centrifugez la culture à 2000 fois G pendant 15 minutes. Retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans cinq millilitres de PBS. Centrifuger à nouveau à 2000 fois G pendant 15 minutes. Remettre en suspension la pastille cellulaire obtenue dans 200 microlitres de PBS. Extrayez l’ADN génomique de la suspension à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN génomique basé sur le battage des billes. Transférez d’abord la suspension cellulaire dans un tube d’échantillon de deux millilitres contenant des billes de verre. Ajoutez ensuite 750 microlitres de solution de lyse à la suspension cellulaire. Fermez hermétiquement les tubes et placez-les symétriquement dans le porte-tube de l’appareil de débourrage. Traitez à la vitesse maximale pendant cinq minutes. Centrifugez les échantillons battus par des billes à 10 000 fois G pendant une minute. Transférez le surnageant dans une colonne de centrifugation dans un tube de collecte de deux millilitres et centrifugez-le à 7000 fois G pendant une minute. Ajoutez 1200 microlitres de tampon de liaison à l’ADN au filtrat et transférez 800 microlitres du mélange dans la colonne de centrifugation dans un tube de collecte de deux millilitres. Centrifuger à 10 000 fois G pendant une minute. Jetez le flux continu. Ajoutez 200 microlitres de tampon de prélavage dans la colonne d’essorage pour laver la matrice de colonne et centrifuger de 10 000 fois G pendant une minute. Jetez le flux, ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage dans la colonne d’essorage pour laver la matrice de la colonne et centrifugez à nouveau. Placez chaque colonne de centrifugation dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et ajoutez 100 microlitres de tampon d’élution à la matrice de colonne. Centrifuger à 10 000 fois G pendant 30 secondes pour éluer l’ADN génomique. Estimez la concentration et la pureté de l’ADN en mesurant l’absorbance à 260 nanomètres et 280 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre. La première PCR est réalisée en utilisant le génome de type sauvage de S. mutans et le gène synthétique de résistance à la streptomycine comme modèles de PCR. Trois ensembles d’amorces sont utilisés pour amplifier respectivement la région flanquante amont du gène de la glycosyltransférase C ou gtfC, la région flanquante aval du gène gtfC et le gène de résistance à la spectinomycine. Fractionner chaque produit PCR sur un gel d’agarose à 1 %. La taille de chaque produit à partir de la première PCR doit être d’environ un Ko. Utilisez un coupe-bande de gel pour exciser les bandes correspondantes et purifier chaque produit d’ADN amplifié comme indiqué dans le protocole de texte. L’étape suivante consiste à utiliser les trois fragments molaires à peu près égaux comme modèles de PCR pour effectuer la deuxième PCR. Ces fragments sont amplifiés et épissés à l’aide d’amorces appropriées pour produire la construction de perturbation. Étant donné que le succès de cette procédure dépend de l’amplification de la construction de perturbation par seconde PCR, il est important de confirmer le deuxième produit de PCR par électrophorèse. Chargez 1/10 du mélange réactionnel de la PCR sur un gel d’agarose à 0,8 % pour confirmer que l’amplicon généré a la taille de bande prédite. Dans cet exemple, les amorces imbriquées ont donné une bien meilleure amplification. Transférez le reste du mélange PCR dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et ajoutez 55 microlitres d’eau ultrapure pour ajuster le volume total à 100 microlitres. Ajouter 1/10 volume d’acétate de sodium à trois molaires pH 5,2, suivi de 2,5 volumes d’éthanol à 100 % et mélanger. Congeler à moins 80 degrés Celsius pendant 30 minutes. Centrifuger à 15 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Lorsque la centrifugation est terminée, vérifiez la présence de la pastille au fond du tube. Jetez le surnageant. Lavez la pastille avec un millilitre d’éthanol à 70 % et centrifugez-la à 15 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez le surnageant et faites sécher la pastille à l’air libre pendant environ 30 minutes. Enfin, dissolvez le granulé avec 10 microlitres d’eau ultra-pure. Les cellules S.mutans UA159 compétentes ont été préalablement préparées et stockées sous forme d’aliquotes de 50 microlitres à moins 80 degrés Celsius. Mélangez chaque aliquote de 50 microlitres de cellules compétentes glacées avec cinq microlitres de la construction de perturbation. Ajouter le mélange dans des cuvettes d’électroporation avec une distance de 0,2 centimètre entre les électrodes. Effectuer l’électroporation en utilisant le mode Staphylococcus aureus de l’appareil d’électroporation. Immédiatement après l’électroporation, suspendez les cellules dans 500 microlitres de bouillon BHI et ajoutez 50 microlitres de la suspension sur des plaques de gélose BHI contenant de la spectinomycine. Incuber les plaques de deux à six jours à 37