Name: Génération d’un gène-perturbé Streptococcus mutans souche sans gène clonage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Découvrez une méthode rapide et économique pour générer des souches de Streptococcus mutans avec gènes perturbés par PCR de fusion et électroporation. Cette technique simplifie les études génétiques en microbiologie.

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Ce travail a été soutenu par la société japonaise pour la Promotion de la Science [Grant Numbers 16 K 15860 à T.M. et 15 K 15777 à N.H.].

1. conception d’amorce <ol><li>préparer des amorces pour 2-step fusion PCR et la vérification d’une perturbation gène. 
	Remarque : Le tableau 1 indique les séquences d’amorces utilisées dans le présent protocole. la figure 1 montre une illustration schématique de la méthode PCR de 2 étapes de fusion utilisée pour générer de S. mutans Δ gtfC.
	<ol><li>Des amorces de conception pour le remplacement de la région de cible dans le génome avec la résistance à la spectinomycine gène (spc r) 7. Le présent protocole remplace toute la région codante du gène gtfC avec spc, r.</li>
		<li>Inclure 15 bases complémentaires aux extrémités supérieures et inférieures de spc r 5 &#39; régions de haut-inverse et bas-forward amorces, respectivement. De même, comprend 15 bases complémentaires à l’extrémité inférieure des régions adjacentes en amont du gtfC et l’extrémité supérieure des régions adjacentes en aval du gtfC du 5 &#39; régions de spc r-avant et spc r -inverser les amorces, respectivement ( Figure 1 a). 
		Remarque : Les séquences des haut-inverse, vers le bas en avant, spc r - vers l’avant et spc r - inverser amorces sont déterminés automatiquement selon le site d’incorporation de la construction de la perturbation.</li>
		<li>Concevoir les amorces up-marche avant et en bas-arrière comprendre &#62; 1 kb en amont et en aval des régions flanquantes du gène gtfC, respectivement. Régler la température de fusion (T m) de haut-vers l’avant et vers le bas-arrière amorces selon la température de fusion des amorces inverse vers le haut et vers le bas en avant, respectivement ( Figure 1 a). 
		Remarque : Se référer à la formule suivante pour déterminer T m : T m (° C) = 2 (* NA + * NT) + 4 (* NC + * NG) - 5, où * N représente le nombre de nucléotides amorce avec l’identité spécifiée (A, T, C ou G).</li>
		<li>Concevoir des amorces imbriquées (N_up-marche avant et N_up-arrière) pour la 2 ème PCR ( Figure 1 b). 
		Remarque : Bien que la paire d’amorces ultrapériphériques (up-marche avant et en bas-arrière) peut être utilisée comme amorces pour la 2 ème PCR, amorces imbriquées (N_up-forward et reverse-N_up) ont été conçus dans le présent protocole. Amorces imbriquées sont souvent requis pour la 2 ème PCR, comme il est indiqué dans les Résultats de représentant.</li>
		<li>Des amorces de conception spécifiques pour spc r. Les amorces sont utilisés pour la PCR sur colonie pour dépister les perturbations gtfC.</li>
		Perturbation <li>des amorces de conception pour la vérification de gtfC. 
		Remarque : Les produits PCR amplifiés à l’aide de ces amorces chevauchent la frontière entre gtfC ou spc r et en amont ou en aval des régions flanquantes du gtfC. Amorces &#39; gtfC haut-vers l’avant et gtfC haut-inverse &#39; et &#39; gtfC vers le bas en avant et gtfC bas-reverse &#39; sont spécifiques pour gtfC, et &#39; gtfC haut-vers l’avant et spc r 2 -inverse &#39; et &#39; spc r 2-vers l’avant et gtfC bas-reverse &#39; sont spécifiques pour la spc, r.</li>
	</ol></li></ol> 2. L’Extraction d’ADN génomique de S. mutans <ol><li>stock Streak S. mutan s UA159 sur une gélose au cerveau coeur infusion (BHI). Incuber la plaque pendant une nuit à 37 ° C en anaérobiose.</li>
	<li>Ramasser une seule colonie à l’aide d’un cure-dents stérilisé et il inoculer dans 5 mL de bouillon BHI. Incuber la culture de s S. mutan pendant une nuit à 37 ° C en anaérobiose.</li>
	<li>Centrifugeuse la culture de cellules bactériennes pendant 15 min à 2 000 × g. Resuspendre le culot dans 5 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).</li>
	<li>Centrifuger pendant 15 min à 2 000 × g. Resuspendre le culot dans 200 µL de PBS.</li>
	<li>Extrait l’ADN génomique de la suspension à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN génomique perle-battement-base conformément aux instructions fournies par le fabricant.
	<ol><li>Transfert la suspension d’un échantillon de 2,0 mL tube contenant des billes de verre (inclus dans le kit). Ajouter 750 µL de solution de lyse (incluse dans le kit) pour obtenir la suspension cellulaire.</li>
		<li>Boucher hermétiquement et placer les tubes symétriquement dans le porte-tube de l’appareil de perturbation perle-battant. Processus à la vitesse maximale pendant 5 min. Échantillons de Centrifuger la perle-battu PDT 1 min à 10 000 × g. transférer le liquide surnageant au filtre essorage (inclus dans le kit) dans un tube de prélèvement de 2,0 mL et centrifuger pendant 1 min à 7 000 × g .</li>
		Tampon <li>Ajouter 1 200 µL de fixation à l’ADN (inclus dans le kit) au filtrat. Transférer 800 µL du mélange de la colonne (inclus dans le kit) dans un tube de prélèvement de 2,0 mL et centrifuger pendant 1 min à 10 000 × g.</li>
		<li>Jeter le cheminement, ajouter 200 µL de tampon de prélavage (inclus dans le kit) à la colonne de la matrice colonne de lavage et centrifuger pendant 1 min à 10 000 × g. jeter le cheminement, ajouter 500 µL de tampon de lavage (inclus dans le kit) à l’essorage colonne de la matrice colonne de lavage, centrifuger pendant 1 min à 10 000 × g.</li>
		<li>Placer la colonne dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL et ajouter 100 µL de tampon d’élution (inclus dans le kit) à la matrice colonne.</li>
		<li>Centrifuger pendant 30 s à 10 000 × g pour éluer l’ADN génomique. Estimer la concentration d’ADN et de la pureté en mesurant l’absorbance à 260 nm et 280 nmusing un spectrophotomètre et confirmer que le A/a 260 280 ratio est supérieur à 1,8.</li>
	</ol></li></ol> 3. L’Amplification par PCR <ol><li>effectuer le 1 st PCR avec le génome de S. mutan s WT et le gène synthétique spc r en tant que modèles PCR (voir tableau 1). Amplifier la région accompagnement en amont du gène gtfC, dans la région de flanquement en aval du gène gtfC et le gène de la spc r en utilisant les trois ensembles d’amorces décrites ci-dessus ( Figure 1 a), comme par Tableau 2 et tableau 3. 
	NOTE : Amorces PCR, réactifs et cycles d’amplification sont résumées dans le tableau 1, tableau 2 et tableau 3, respectivement.</li>
	<li>Fractionner chaque produit PCR sur un gel d’agarose à 1 % et les bandes correspondants à l’aide d’un cutter de bande de gel de l’accise.</li>
	<li>Purifier chaque produit d’ADN amplifié de gels à l’aide d’un kit d’extraction de gel à base de membranes à colonne et silice spin.
	<ol><li>Transfert les tranches de gel à une micro-centrifugeuse propre tube et mélangent avec 500 µL de tampon (inclus dans le kit) de liaison. Incuber le mélange à 55 ° C pendant 15 min jusqu'à ce que les tranches de gel sont complètement dissous.</li>
		<li>Placer la colonne à centrifuger (incluse dans le kit) dans un tube de prélèvement (inclus dans le kit), charger l’échantillon sur la colonne et centrifuger pendant 30 s à 11 000 × g. Jeter le cheminement, les 600 µL de tampon de lavage (inclus dans le kit) s’ajoute la colonne Spin pour laver la membrane de la silice et centrifuger pendant 30 s à 11 000 × g.</li>
		<li>Jeter le cheminement et centrifuger pendant 2 min à 11 000 × g pour sécher la membrane silice.</li>
		<li>Placer la colonne dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL, ajouter 50 µL de tampon d’élution (inclus dans le kit) et incuber à température ambiante pendant 2 min.</li>
		<li>Centrifuger pendant 2 min à 11 000 × g pour éluer l’ADN amplifié. Estimer la concentration d’ADN et de la pureté en mesurant l’absorbance à 260 nm et 280 nmusing un spectrophotomètre et confirmer que le A/a 260 280 ratio est supérieur à 1,8.</li>
	</ol></li> <li>Effectuer le 2 nd PCR de la fusion de 2 étapes PCR à l’aide de trois fragments approximativement équimolaires en tant que modèles PCR, selon les tableau 2 et le tableau 3. 
	Remarque : Ces fragments ont été amplifiés et raccordé en utilisant les amorces imbriquées &#39; N_up-forward et reverse-N_down &#39; ou les amorces ultrapériphériques &#39; up-marche avant et en bas-arrière &#39; ( Figure 1 b). Des amorces PCR, réactifs et cycles d’amplification sont résumées dans le tableau 1, tableau 2 et tableau 3, respectivement.</li>
	<li>Charger un dixième du mélange réactionnel PCR (5 µL) sur un gel d’agarose 0,8 % et de comparer la taille de bande amplifié avec la taille de bande attendue pour confirmer la génération de l’amplicon approprié ( Figure 1).</li>
	<li>Concentrer le produit final restant de PCR par précipitation à l’éthanol sans purification.
	<ol><li>Ajouter 55 µL d’ultra purs pour le reste du mélange PCR pour ajuster le volume total à 100 µL.Add un dixième le volume d’eau 3M d’acétate de sodium (10 µL), pH 5,2, suivie par 2,5 volumes d’éthanol à 100 % (250 µL). Mélanger et geler pendant 30 min à -80 ° C.</li>
		<li>Centrifugeuse pendant 20 min à 15 000 × g à 4 ° C, vérifier le culot sur le fond du tube et jeter le surnageant. Laver le culot avec 1 mL d’éthanol à 70 %, centrifuger pendant 5 min à 15 000 × g à 4 ° C et éliminer le surnageant. Sécher le culot pendant environ 30 min et se dissolvent à 10 µL d’eau ultra pure.</li>
	</ol></li></ol> 4. Préparation de cellules compétentes et des transformations cellulaires <ol><li>stock Streak S. mutan s UA159 sur une gélose BHI. Incuber la plaque pendant une nuit à 37 ° C en anaérobiose.</li>
	<li>Ramasser une seule colonie à l’aide d’un cure-dents stérilisé et il inoculer dans 5 mL de bouillon BHI. Incuber la culture de s S. mutan pendant une nuit à 37 ° C en anaérobiose.</li>
	<li>Transférer 2 mL de la culture de s s. mutan à 50 mL de bouillon BHI et incuber pendant 6 à 8 heures à 37 ° C, à une densité optique à 600 nm (OD 600) de 0,2 à 0,4 en anaérobiose.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à 2 000 × g à 4 ° C pendant 15 minutes, éliminer le surnageant et laver les cellules deux fois avec 40 mL d’eau glacée, puis 40 mL de glycérol à 10 %. 
	NOTE : Des substances résiduelles affectent électroporation ultérieure.</li>
	<li>Aspirer le surnageant soigneusement avec une pipette Pasteur comme l’adhérence du culot dans 10 % de glycérol est réduite. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de frais 10 % de glycérol, administrer 50 µL de la suspension dans chaque tube de microtubes de 1,5 mL et stocker à-80 ° C jusqu'à ce que juste avant l’utilisation.</li>
	<li>Mélanger l’aliquote de 50 µL de cellules compétentes glacées 5 µl de la construction de la perturbation décrite ci-dessus à la section 3. Ajouter le mélange à cuvettes d’électroporation (avec une distance de 0,2 cm entre les électrodes). Employer le mode de Staphylococcus aureus (1.8 kV, Ω 600, 10 µF 1 impulsion) de l’appareil d’électroporation à electroporate.</li>
	<li>Suspendre les cellules de 500 µL de bouillon BHI immédiatement après l’électroporation et ajouter 50 µL de la suspension à la spectinomycine contenant des plaques de gélose BHI. 
	Remarque : L’incubation Extra time après que électroporation n’est pas nécessaire. Toutefois, une incubation de 1 à 2 h après électroporation peut améliorer l’efficacité de la transformation.</li>
	<li>Incuber la plaque pendant 2 à 6 jours à 37 ° C en anaérobiose. 
	Remarque : S. mutans Δ gtfB est construit tel que décrit ci-dessus. Toute la région codante du gène gtfB est remplacée avec le gène de résistance érythromycine 8 dans S. mutans Δ gtfB. Chaque souche de S. mutans est cultivé dans le bouillon BHI à 37 ° C en anaérobiose.</li>
</ol> 5. Vérification de la perturbation de Gene et stockage <ol><li>prélever des colonies au hasard et leur inoculer dans le mélange PCR pour effectuer la colonie PCR selon le tableau 2 et tableau 3. Des amorces PCR, réactifs et cycles d’amplification sont résumées dans le tableau 1, tableau 2 et tableau 3, respectivement.</li>
	<li>Charger le mélange de réaction PCR sur un gel d’agarose à 1 % pour confirmer la spc r-bande d’ADN spécifique.</li>
	<li>Choisir la colonie positive à l’aide d’un cure-dents stérilisé et cellules de sous-culture dans 10 mL BHI spectinomycine contenant du bouillon pendant 2 jours à 37 ° C dans des conditions anaérobies.</li>
	<li>Vérifier la génération de S. mutans Δ gtfC.
	<ol><li>Divisent la suspension cellulaire également. Extraire l’ADN génomique des cellules décrites ci-dessus (étapes 2.3. à 2.5.5.). Effectuer l’ACP avec l’ADN génomique modèle PCR, utilisant les amorces pour la vérification d’une perturbation gtfC (tableau 1) selon le tableau 2 et tableau 3. 
		Remarque : Les amorces PCR, réactifs et cycles d’amplification sont résumées dans le tableau 1, tableau 2 et tableau 3, respectivement.</li>
		<li>Le mélange de la PCR sur un gel d’agarose de 2 % de la charge et comparez la taille de bande amplifié avec la taille de bande attendue pour confirmer la génération de l’amplicon approprié .</li>
		<li>Centrifuger la suspension cellulaire reste à 2 000 x g pendant 15 minutes à 4 ° C. Resuspendre le culot dans 5 mL de PBS.</li>
		<li>Centrifuger pendant 15 min à 2 000 × g à 4 ° C. remettre en suspension les cellules pellet dans 1,5 mL de bouillon BHI contenant 25 % de glycérol et stocker à-80 ° Cor -20 ° C.</li>
	</ol></li></ol> 6. L’analyse phénotypique <ol><li>Streak chaque souche de s S. mutan sur une gélose BHI. Incuber la plaque pendant une nuit à 37 ° C en anaérobiose.</li>
	<li>Ramasser une seule colonie à l’aide d’un cure-dents stérilisé et il inoculer dans 2 mL de bouillon BHI avec ou sans un antibiotique approprié. Incuber une nuit à 37 ° C en anaérobiose.</li>
	<li>Ensemencer 20 µL de la suspension bactérienne pendant la nuit dans 2 mL de bouillon BHI contenant 1 % ou 5 % de saccharose sans antibiotiques dans un tube de verre ; culture de cellules avec le tube à essai dans une position inclinée pendant une nuit à 37 ° C en anaérobiose.</li>
	<li>Vortex le verre des tubes à essai pendant 10 s et décanter les suspensions de la culture. Laver les tubes à essai trois fois avec de l’eau distillée. Ajouter 1 mL de 0,25 % Coomassie brillant blue (CBB) pour colorer les biofilms sur la paroi du tube et puis incuber pendant 1 min.</li>
	<li>Décanter la solution colorante, laver les tubes à essai trois fois avec de l’eau distillée et sécher les tubes à essai.</li>
	<li>Évaluer aussi bien la densité de couleur et extension du CBB teinté-biofilm visuellement pour déterminer la capacité de formation de biofilm dans une analyse phénotypique.</li>
</ol>

<ol><li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes%3A+gene+splicing+by+overlap+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li>
<li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+splicing+by+overlap+extension%3A+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li>
<li>Kuwayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-mediated+generation+of+a+gene+disruption+construct+without+the+use+of+DNA+ligase+and+plasmid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors.</a> Nucleic Acids Res. 30 (2), E2(2002).</li>
<li>Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digalactosyldiacylglycerol+is+required+for+stabilization+of+the+oxygen-evolving+complex+in+photosystem+II%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II.</a> Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).</li>
<li>Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+a+Streptococcus+mutans+glucosyltransferase+gene+coding+for+insoluble+glucan+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis.</a> Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).</li>
<li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutans+gtfC+gene%2C+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li>
<li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD%289%29+determinant+from+Enterococcus+faecalis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li>
<li>Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cloning+vector+able+to+replicate+in+Escherichia+coli+and+Streptococcus+sanguis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis.</a> Gene. 19 (3), 345-353 (1982).</li>
<li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiol Lett. 363 (11), (2016).</li>
<li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infect Immun. 41 (2), 722-727 (1983).</li>
<li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci%3A+application+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li>
<li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> J Vis Exp. (69), (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans le présent protocole, les amorces pour le 1st PCR doivent être conçus pour amplifier environ 1 Ko en amont et en aval des régions flanquantes de la région cible dans le génome. De telles séquences flanquantes longtemps sont nécessaires pour améliorer l’efficacité de la recombinaison homologue.
Les séquences des amorces (haut-inverse, vers le bas en avant, spc,r-avance et spcr-inverse) dans le présent protocole ont été déterminées automati...

Analyse de la fonction génique implique généralement une comparaison phénotypique entre une souche sauvage et une déformation dans laquelle un gène d’intérêt a été perturbé. Cette technique de gène-perturbation a été utilisée pour les analyses de la fonction du gène dans un large ensemble de taxons, des bactéries aux mammifères. Une construction de gène-perturbation est nécessaire pour la génération de la souche de gène-perturbé ; Cette construction de l’acide désoxyribonucléique (ADN) comprend le gène marqueur de résistance aux antibiotiques fusionné à l’amont et l’aval des régions flanquantes du gène ciblé et est incorporée dans le génome par recombinaison homologue. La souche perturbé de gène peut être isolée en utilisant des milieux sélectifs contenant l’antibiotique. La méthode classique utilisée pour la construction de la souche de gène-perturbée nécessite des étapes complexes, telles que l’amplification du gène cible par polymerase chain reaction (PCR), ligature du gène dans un plasmide approprié, digestion avec restriction enzymes et RELIGACIÓN pour insérer le gène marqueur de résistance aux antibiotiques. Ce processus prend du temps, prenant plusieurs jours à plusieurs semaines, selon le succès de chaque étape. En outre, la conception de constructions de perturbation repose sur les sites de l’enzyme de restriction du gène cible. Pour résoudre ces problèmes, basées sur la PCR ADN épissage méthodes1,2 pour la conception de gène-perturbé des mutants de Dictyostelium discoideum3 et Synechocystis SP. PCC68034 ont été rapportés. Dans la présente étude, il a développé une méthode pour générer une souche de streptocoque gène-perturbé de façon relativement rapide, facile et peu coûteuse, en utilisant une méthode de PCR-based modifiée (désignée 2-step fusion PCR) pour la construction de la perturbation construction et électroporation pour transformation génétique.
La fusion de 2 étapes que PCR nécessite quatre paires d’ADN génomique et le gène marqueur de résistance aux antibiotiques comme modèle PCR convenablement conçu des amorces oligonucléotidiques. Dans la première étape (1st PCR), une région de flanquement 1 kb en amont du gène cible, une région de flanquement 1 kb en aval de la cible génétique et le gène marqueur de résistance aux antibiotiques sont amplifiés par PCR. Les régions 5' de l’apprêt inversée et l’amorce vers l’avant, pour l’amplification de l’amont et en aval les régions flanquantes, respectivement, incluent 15 bases complémentaires jusqu’aux extrémités du gène marqueur. Les régions 5' d’amorces avant et arrière pour l’amplification du gène marqueur de même incluent 15 bases complémentaires à l’extrémité inférieure de la région d’accompagnement en amont du gène cible et l’extrémité supérieure de la région de flanquement en aval du gène cible, respectivement. Par conséquent, les trois fragments amplifiés contiennent des régions de 30-nucléotide qui se chevauchent sur le site de fusion. Dans la deuxième étape (2nd PCR), PCR est réalisée avec des amorces PCR imbriqués à l’aide de trois fragments amplifiés par le 1st PCR en tant que modèles. Les régions complémentaires des modèles sont en outre reliées entre eux par l’intermédiaire de la 2ème PCR. Enfin, la construction de la recombinaison homologue est introduite à la souche sauvage par électroporation. Perturbation du gène réussie peut être vérifiée par PCR avec des amorces spécifiques. Bien que la construction de la perturbation est amplifiée utilisant haute fidélité ADN polymérase, les réactions enzymatiques supplémentaires, tels que la ligature d’ADN ou de la digestion de l’ADN, ne sont pas nécessaires pour générer la construction. En outre, une région supprimée ou conservée sur le génome peut être avec souplesse choisie selon la conception d’amorce.
Dans le présent travail, suppression de toute la région codante du gène gtfC , qui encode glucosyltransférase chez Streptococcus mutans, a été réalisée pour illustrer la méthode de perturbation rapide et facile des gènes dans une espèce de streptocoque. En outre, un gtfB-souche perturbée provenait de la même manière. La glycosyltransférase codé par gtfC et gtfB contribue à cariogènes biofilm dentaire développement5,6. Les capacités de formation de biofilm de la souche sauvage de la souche (S. mutans WT), gtfC-perturbé la souche (S. mutans ΔgtfC) et gtfB-souche perturbée (S. mutans ΔgtfB) ont été évalués pour les analyses phénotypiques comparatives. Ce protocole étend l’application d’une méthode en deux étapes pour la rupture du gène d’autres espèces et peut-être être modifié pour l’étude de la fonction des gènes dans un plus grand nombre de taxons.

<table><tbody><tr><td>Streptococus mutans</td><td>Stock en laboratoire.</td><td></td><td>Souche de type sauvage (souche UA159)</td></tr><tr><td>Kit d’extraction d’ADN génomique</td><td>Zymo Research</td><td>D6005</td><td></td></tr><tr><td>Appareil de perturbation des billes</td><td>Taitec</td><td>GM-01</td><td></td></tr><tr><td>Gènes synthétiques</td><td>Eurofins Genomics</td> Gène de résistance à la <td>spectinomycine et à l’érythromycine</td><td>commandé sur mesure</td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>Astec</td><td>PC-708</td><td></td></tr><tr><td>Amorces PCR</td><td>Eurofins Genomics</td><td>Commande sur mesure</td><td>35 bases d’ADN</td></tr><tr><td>polymérase</td><td>Takara</td><td>R045A</td><td>ADN polymérase haute fidélité</td></tr><tr><td>Kit d’extraction de gel</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-91202</td><td>Extraction d’ADN à partir de gel d’agarose</td></tr><tr><td>Coupe-bande de gel</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-830</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td>Beckman Coulter</td><td>DU 800</td><td></td></tr><tr><td>Électroporateur</td><td>Bio-rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette d’électroporation</td><td>Bio-rad</td><td>1652086</td><td>espace de 0,2 cm</td></tr><tr><td>Anaeropack</td><td>Mitsubishi Gas Chemical</td><td>A-03</td><td>Système de culture anaérobie</td></tr><tr><td>Cerveau cœur infusion bouillon</td><td>Becton, Dickinson</td><td>237500</td><td>Milieux de culture bactérienne</td></tr><tr><td>Spectinomycine</td><td>Wako</td><td>195-11531</td><td>Antibiotiques</td></tr><tr><td>Érythromycine</td><td>Wako</td><td>057-07151</td><td>Antibiotiques</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td>Pour le développement du biofilm</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>Pour la coloration du biofilm</td></tr></tbody></table>

génération d’un gène-perturbé streptococcus mutans souche sans gène clonage

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Méthodes typiques pour l’élucidation de la fonction d’un gène particulier comportent des analyses comparatives et phénotypiques de la souche sauvage et une souche dont le gène d’intérêt a été perturbé. Une construction d’ADN gène-perturbation contenant un gène marqueur de résistance aux antibiotiques appropriés est utile pour la génération des souches perturbé de gène dans les bactéries. Cependant, les méthodes de construction classiques, qui nécessitent des mesures clonage de gènes, axée sur des protocoles complexes et fastidieuses. Ici, une méthode relativement facile, rapide et rentable pour la rupture du gène ciblé chez Streptococcus mutans est décrite. La méthode utilise une fusion 2-étape chaîne par polymérase (PCR) pour générer la perturbation construct et électroporation pour transformation génétique. Cette méthode ne nécessite pas une réaction enzymatique, autres que les PCR et offre en outre une plus grande flexibilité en ce qui concerne la conception de la construction de la perturbation. Emploi d’électroporation facilite la préparation des cellules compétentes et améliore l’efficacité de la transformation. La présente méthode peut être adaptée pour la production de souches de gène-perturbée de diverses espèces.

La figure 2 montre que la taille de chaque produit du 1st PCR, tel qu’observé sur le gel d’agarose à 1 %, est en bon accord avec la taille estimée d’environ 1 kb. La figure 3 montre l’analyse par électrophorèse sur gel des produits de la 2ème PCR. La figure 4 montre des colonies de S. mutans transformés avec la construction de la perturbation et une analyse de l’électro...

Nous décrivons une méthode facile, rapide et relativement peu coûteuse pour la génération de gène-perturbé Streptococcus mutans souches ; Cette technique peut être adaptée pour la production de souches de gène-perturbée de diverses espèces.

Génération d’un gène-perturbé Streptococcus mutans souche sans gène clonage

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

L’objectif global de cette procédure est de générer des souches ciblées de Streptococcus mutans perturbées par des gènes à l’aide d’une PCR par fusion en deux étapes et d’une électroporation. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la microbiologie, telles que le fonctionnement d’un gène d’intérêt. Le principal avantage de cette technique est qu’aucune réaction enzymatique autre que la PCR n’est nécessaire et que la préparation compétente des cellules pour l’électroporation est assez simple. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la technique de perturbation du gène de Streptococcus mutans, elle peut également être appliquée à d’autres espèces microbiennes telles que Staphylococcus aureus. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés parce qu’elles ne sont pas familières avec l’efficacité des amorces emboîtées pour la deuxième PCR. La démonstration de la procédure sera faite par le docteur Ayako Okada, un instructeur de recherche de notre laboratoire. Pour commencer cette procédure, appliquez des stres de S.mutans UA159 sur une plaque de gélose cerveau-cœur, de perfusion ou de BHI et incubez la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans des conditions anaérobies. Le lendemain, utilisez un cure-dent stérilisé pour cueillir une seule colonie et inoculez-la dans cinq millilitres de bouillon BHI. Incuber la culture de S. mutans pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans des conditions anaérobies. Ensuite, centrifugez la culture à 2000 fois G pendant 15 minutes. Retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans cinq millilitres de PBS. Centrifuger à nouveau à 2000 fois G pendant 15 minutes. Remettre en suspension la pastille cellulaire obtenue dans 200 microlitres de PBS. Extrayez l’ADN génomique de la suspension à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN génomique basé sur le battage des billes. Transférez d’abord la suspension cellulaire dans un tube d’échantillon de deux millilitres contenant des billes de verre. Ajoutez ensuite 750 microlitres de solution de lyse à la suspension cellulaire. Fermez hermétiquement les tubes et placez-les symétriquement dans le porte-tube de l’appareil de débourrage. Traitez à la vitesse maximale pendant cinq minutes. Centrifugez les échantillons battus par des billes à 10 000 fois G pendant une minute. Transférez le surnageant dans une colonne de centrifugation dans un tube de collecte de deux millilitres et centrifugez-le à 7000 fois G pendant une minute. Ajoutez 1200 microlitres de tampon de liaison à l’ADN au filtrat et transférez 800 microlitres du mélange dans la colonne de centrifugation dans un tube de collecte de deux millilitres. Centrifuger à 10 000 fois G pendant une minute. Jetez le flux continu. Ajoutez 200 microlitres de tampon de prélavage dans la colonne d’essorage pour laver la matrice de colonne et centrifuger de 10 000 fois G pendant une minute. Jetez le flux, ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage dans la colonne d’essorage pour laver la matrice de la colonne et centrifugez à nouveau. Placez chaque colonne de centrifugation dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et ajoutez 100 microlitres de tampon d’élution à la matrice de colonne. Centrifuger à 10 000 fois G pendant 30 secondes pour éluer l’ADN génomique. Estimez la concentration et la pureté de l’ADN en mesurant l’absorbance à 260 nanomètres et 280 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre. La première PCR est réalisée en utilisant le génome de type sauvage de S. mutans et le gène synthétique de résistance à la streptomycine comme modèles de PCR. Trois ensembles d’amorces sont utilisés pour amplifier respectivement la région flanquante amont du gène de la glycosyltransférase C ou gtfC, la région flanquante aval du gène gtfC et le gène de résistance à la spectinomycine. Fractionner chaque produit PCR sur un gel d’agarose à 1 %. La taille de chaque produit à partir de la première PCR doit être d’environ un Ko. Utilisez un coupe-bande de gel pour exciser les bandes correspondantes et purifier chaque produit d’ADN amplifié comme indiqué dans le protocole de texte. L’étape suivante consiste à utiliser les trois fragments molaires à peu près égaux comme modèles de PCR pour effectuer la deuxième PCR. Ces fragments sont amplifiés et épissés à l’aide d’amorces appropriées pour produire la construction de perturbation. Étant donné que le succès de cette procédure dépend de l’amplification de la construction de perturbation par seconde PCR, il est important de confirmer le deuxième produit de PCR par électrophorèse. Chargez 1/10 du mélange réactionnel de la PCR sur un gel d’agarose à 0,8 % pour confirmer que l’amplicon généré a la taille de bande prédite. Dans cet exemple, les amorces imbriquées ont donné une bien meilleure amplification. Transférez le reste du mélange PCR dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et ajoutez 55 microlitres d’eau ultrapure pour ajuster le volume total à 100 microlitres. Ajouter 1/10 volume d’acétate de sodium à trois molaires pH 5,2, suivi de 2,5 volumes d’éthanol à 100 % et mélanger. Congeler à moins 80 degrés Celsius pendant 30 minutes. Centrifuger à 15 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Lorsque la centrifugation est terminée, vérifiez la présence de la pastille au fond du tube. Jetez le surnageant. Lavez la pastille avec un millilitre d’éthanol à 70 % et centrifugez-la à 15 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez le surnageant et faites sécher la pastille à l’air libre pendant environ 30 minutes. Enfin, dissolvez le granulé avec 10 microlitres d’eau ultra-pure. Les cellules S.mutans UA159 compétentes ont été préalablement préparées et stockées sous forme d’aliquotes de 50 microlitres à moins 80 degrés Celsius. Mélangez chaque aliquote de 50 microlitres de cellules compétentes glacées avec cinq microlitres de la construction de perturbation. Ajouter le mélange dans des cuvettes d’électroporation avec une distance de 0,2 centimètre entre les électrodes. Effectuer l’électroporation en utilisant le mode Staphylococcus aureus de l’appareil d’électroporation. Immédiatement après l’électroporation, suspendez les cellules dans 500 microlitres de bouillon BHI et ajoutez 50 microlitres de la suspension sur des plaques de gélose BHI contenant de la spectinomycine. Incuber les plaques de deux à six jours à 37

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