Name: In Vitro Phagocytose des débris de la myéline par les Macrophages dérivés de la moelle osseuse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse de la phagocytose des débris de myéline par des macrophages dérivés de la moelle osseuse murine. Cette technique permet d'étudier efficacement les réponses immunitaires dans le contexte des neurotraumatismes.

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Les auteurs tiennent à remercier Glenn Sanger-Hodgson, spécialiste des médias à la faculté de médecine de l’ex-URSS pour tout son travail dans la production vidéo, l’édition et Voice-over.
Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (R01GM100474 et R01GM072611).

Les méthodes décrites ici et à l’article 2 ont été approuvés par la Florida State University institutionnels animalier et utilisation Comité (IACUC) et suit les lignes directrices énoncées dans le Guide du pour les soins et utilisation des animaux de laboratoire, 8ème édition . Tous les animaux utilisés dans le présent dans le présent protocole sont maison dans une animalerie de laboratoire dédié jusqu'à utilisation. Aucune expérimentation in vivo a été réalisé avant de sacrifier. Nombre d’animaux axées sur les besoins expérimentaux utilisant la moyenne des cellules et des collections de la myéline comme guide afin de minimiser la consommation.
Remarque : Ce protocole décrit la génération des macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs) (Section 1), la préparation des débris de myéline d’encéphales fluorescent étiquetés (Section 2), la procédure générale pour analyser la phagocytose de débris de la myéline (Section 3), et procédure générale d’analyse de l’accumulation de lipides débris de myéline (Section 4). Préparation du réactif, cellule récolte et manipulation, collection de la myéline et étiquetage et performances du test devraient être achevés dans un flux d’air laminaire biosafety armoire.
1. génération des Macrophages primaires de moelle osseuse
<ol>
	<li>Préparation du milieu de culture de macrophage complet (CMCM) Remarque : génération de macrophages de la moelle osseuse nécessite l’utilisation d’and macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). Cette préparation utilise L929 médias de fibroblastes murins conditionné comme source de M-CSF.<ol>
		<li>Générer des médias des fibroblastes murins conditionné L929 par culture de cellules dans les plats de 145 mm avec 50 mL de forte concentration de glucose (4 500 mg/L, L-glucose) Dulbecco modifié Eagle (DMEM) additionné de sérum de veau né le nouveau 5 % (NCS) et pénicilline/streptomycine pendant 7 jours.</li>
		<li>Recueillir des médias provenant de cultures dans des tubes à centrifuger coniques 50 mL et centrifuger pendant 30 minutes à 3500 x g, 4 ° C.</li>
		<li>Filtrer les surnageants sur un filtre de seringue 0,2 µm dans un tube à centrifuger conique 50 mL nouveau. Milieux conditionnés peut être stockées à-80 ° C pendant 6 mois.</li>
		<li>À forte concentration de glucose DMEM, ajouter 5 % vol/vol NCS, 15 % vol/vol L929 fibroblastes murins conditionné DMEM et 1 % la pénicilline/streptomycine. Médias peuvent être stockés à 4 ° C pendant 2 à 3 mois. Chaud à 37 ° C avant utilisation.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Collection de cellules de moelle primaire et induction macrophage 
	Remarque : L’utilisation de cette un souris protocole générera environ 20 millions macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs).<ol>
		<li>Euthanasier le nombre désiré de 8 à 10 semaine vieilles souris en utilisant les directives standard CO2 asphyxie suivies par dislocation cervicale.</li>
		<li>Désinfectez l’animal à l’aide de 70 % (vol/vol) éthanol : H2O, saturant la fourrure.</li>
		<li>Coupez une petite ouverture dans l’abdomen et tirez délicatement la peau pour révéler les tissus sous-jacents. Prenez soin de ne pas perforer la cavité péritonéale.</li>
		<li>Enlever les deux pattes arrière à partir de la hanche et se terminant à la cheville. Place les tissus prélevés dans un 100 mm boîte de Pétri contenant du phosphate stérile 5-10 mL solution saline tamponnée (PBS) additionnée de 1 % la pénicilline/streptomycine. 
		Remarque : Lorsque plusieurs animaux de traitement Assurez-vous garder la vaisselle sur la glace pour limiter la dégradation des tissus.</li>
		<li>Retirer les muscles et du tissu conjonctif de l’os à l’aide d’un scalpel. Seulement le fémur et le tibia sont utilisés pour le prélèvement de cellules, le péroné peut être mis au rebut.</li>
		<li>Exposer la cavité de la moelle des os prélevés en taillant une petite section de chaque extrémité avec un scalpel.</li>
		<li>À l’aide d’une aiguille 25g, rincer les cavités de la moelle osseuse avec CMCM dans un tube à centrifuger conique 50 mL. Les os apparaîtront blancs une fois qu’ils ont été suffisamment rincées.</li>
		<li>Une fois que la collection soit effectuée, agiter ponction avec une aiguille 18g pour 30-90 s à généré une suspension monocellulaire. 
		Remarque : Une étape de lyse facultatif des globules rouges (RBC) peut être effectuée à ce stade. Récemment, il a été suggéré que la teneur en fer intracellulaire peut influencer les effets des débris de la myéline à macrophage polarisation16. Pour plus d’informations au sujet de l’inclusion d’une étape de lyse RBC veux parler Trouplin et al. 17.</li>
		<li>Filtrer la suspension à travers un tamis de cellule stérile 70 µm dans un nouveau tube à centrifuger conique 50 mL.</li>
		<li>Graines prélevées des cellules uniformément dans les récipients de culture de cellules de 145 mm contenant 15 à 20 mL CMCM. Utilisez environ trois récipients de culture par souris sacrifiées. Incuber les cultures à 37 ° C, 5 % de CO2.</li>
		<li>Après 72 heures laver les plaques une fois avec du PBS stérile pour enlever les cellules non adhérentes, puis ajouter 15 à 20mL CMCM fraîche. Incuber les cultures pour une période supplémentaire de 4 jours à 37 ° C, 5 % de CO2. Après 7 jours de culture totale, les cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse isolées au départ sera matures BMDMs (Figure 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. génération de débris fluorescent étiquetés encéphales myéline
Remarque : Tous les réactifs peuvent être stockés à 4 ° C pendant environ 1 mois.
<ol>
	<li>Préparation des réactifs de la myéline débris collection
	<ol>
		<li>Préparer Tris· Solution tampon de cl.<ol>
			<li>Pour 800mL distillée désionisée H2O (ddiH2O) ajouter 20 mL de 1 M Tris· CL, pH 7,45 (concentration finale de 20 mM) et 20 mL de 100 mM Na2EDTA (concentration finale de 2 mM).</li>
			<li>Ajuster le pH à 7,45. Régler le volume à 1 000 mL avec de le ddiH2solution O. filtre à travers une unité de filtration 0,2 µm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Préparer une solution de saccharose 1 M.<ol>
			<li>Dans 100 mL de Tris· CL solution tampon, ajouter 68,46 g de saccharose. Régler le volume à 200 mL avec Tris· Solution tampon de cl. Filtrer la solution à travers une unité de filtration de 0,2 µm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Préparer 200 mL de solution de saccharose de 0,32 M en diluant la solution 1 M avec la Tris· CL 0.83:0.16 de solution tampon (vol/vol).</li>
		<li>Préparer 150 mL de solution de saccharose de 0,83 M en diluant la solution 1 M avec la Tris· CL 0.83:0.16 de solution tampon (vol/vol).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Collecte des débris de la myéline brut encéphales 
	Remarque : La méthode de collection décrite ici est pour l’isolement des débris de la myéline brut.<ol>
		<li>Euthanasier 10-12 souris 8-10 semaines d’âge à l’aide de directives standard CO2 asphyxie suivies par dislocation cervicale.</li>
		<li>Disséquer les cerveaux et les placer dans un plat de 100 mm contenant 10 mL de solution de saccharose de 0,32 M.</li></ol></li></ol>Garder le plat sur la glace.
		<li>À l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles, couper le cerveau en pièces environ 5 mm3 en taille.</li>
		<li>Transvaser le tissu dans un tube à centrifuger conique 50 mL et ajouter environ 30 mL de solution de saccharose de 0,32 M.</li>
		<li>Homogénéiser avec un homogénéisateur rotatif à main stérile, jusqu'à l’obtention d’une solution sans heurt.</li>
		<li>Diluer le cerveau homogénéisé pour un volume final de 90 mL avec une solution de saccharose de 0,32 M.</li>
		<li>À six tubes de 38,5-mL à parois minces en polypropylène ultracentrifugeuse, ajouter 20 mL de solution de saccharose de 0,83 M.</li>
		<li>Ajouter doucement la solution cerveau homogénéisé au sommet de la solution de saccharose de 0,83 M, prenant soin de ne pas pour mélanger les deux couches.</li>
		<li>Équilibre entre chaque tube avec la solution de saccharose de 0,32 M.</li>
		<li>Centrifuger à 100 000 x g pendant 45 min à 4° C à l’aide appropriée préalablement refroidi rotor ultracentrifugeuse. Rotor accélération et décélération sur leur valeur minimale pour réduire les pertes de débris de la myéline.</li>
		<li>Recueillir les débris de la myéline dans l’interface des deux densités de sucrose. 
		NOTE: débris doit apparaître sur une bande blanche vers le centre du tube.</li>
		<li>Combiner les débris de la myéline brut dans un tube à centrifuger conique 50 mL et ajuster le volume à environ 35 mL à l’aide de Tris· Solution tampon de cl.</li>
		<li>Homogénéiser les débris de la myéline brut avec un homogénéisateur rotatif à main stérile pendant 30-60 s.</li>
		<li>Répartir uniformément la suspension entre 6 tubes ultracentrifugeuse propre et équilibre avec un volume approprié de Tris· Solution tampon de cl.</li>
		<li>Centrifuger à 100 000 x g pendant 45 min à 4° C à l’aide appropriée préalablement refroidi rotor ultracentrifugeuse. Rotor accélération et décélération sur leurs valeurs maximales.</li>
		<li>Comme pellets blancs solides sera maintenant visibles, éliminer le surnageant et remettre en suspension les pellets dans 10 à 15 mL de Tris· Solution tampon de cl.</li>
		<li>Répartir uniformément la suspension entre 2 tubes ultracentrifugeuse propre et équilibre avec un volume approprié de Tris· Solution tampon de cl.</li>
		<li>Centrifugeuse à nouveau à 100 000 x g pendant 45 min à 4 ° C à l’aide adéquate préalablement refroidi rotor ultracentrifugeuse. Rotor accélération et décélération sur leurs valeurs maximales.</li>
		<li>Jeter le surnageant et remettre en suspension les granules en 5 à 6 mL de PBS stérile et diviser la suspension entre un nombre approprié de tubes de micro-centrifugeuse pré-pesés 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifuger à 22 000 x g pendant 10 min à 4 ° C.</li>
		<li>Jeter le surnageant et déterminer le poids des myéline débris pellets.</li>
		<li>Remettre en suspension les boulettes dans du PBS à une concentration finale de 100 mg/mL. 
		NOTE: dizaine de cerveaux est suffisant pour produire 10 à 15 mL de débris de myéline de 100 mg/mL. Débris de la myéline peut être conserver à-80 ° C pendant 6 mois.</li>
	
	
	<li>Marquage fluorescent de débris de la myéline
	<ol>
		<li>Préparer la 50 µM carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) solution immédiatement avant l’emploi.<ol>
			<li>À l’aide de PBS stérile, diluer une solution mère de 5 mM de CFSE préparé avec 100 % diméthylsulfoxyde (DMSO) à une concentration finale de travail de 50 µM.</li>
			<li>Filtrer la solution à travers un filtre de seringue 0,2 µm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Décongeler la quantité désirée de débris de myéline de 100 mg/mL et une nouvelle suspension avec une aiguille stérile de 29 g. 
		NOTE: les débris de la myéline de congélation entraînera sa abandonnent solution nécessitant une remise en suspension avant utilisation.</li>
		<li>Transférer les débris la myéline dans un tube de micro-centrifugeuse pré-pesés 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifuger à 14 800 x g pendant 10 min à 4° C. Jeter le surnageant.</li>
		<li>Remettre en suspension les débris de la myéline dans 200 µL de solution CFSE par 100 débris de myéline µL granulée.</li>
		<li>Incuber 30 min à température ambiante (RT) abrie de la lumière.</li>
		<li>Centrifuger à 14 800 x g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.</li>
		<li>Resuspendre le culot dans 600-800 µL de tampon de lavage (0,2 µm filtre stérilisé glycine 100 mM dans du PBS).</li>
		<li>Centrifuger à 14 800 x g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.</li>
		<li>Répétez les étapes 2.3.8-2.3.9 deux fois plus.</li>
		<li>Après le lavage final, déterminer le poids de la pastille de débris de la myéline et remettre en suspension à 100 mg/mL avec du PBS stérile. Remarque : Débris de myéline marqué peut être conserver à-80 ° C pendant 6 mois.</li>
	</ol>
	</li>

3. la myéline débris phagocytose Assay
Remarque : Voici la méthode de base pour l’observation de phagocytose des débris de la myéline fluorescent étiquetés. Ajout d’autres traitements et conditions expérimentales devra être optimisé par l’enquêteur.
<ol>
	<li>Préparation des plaques de traitement
	<ol>
		<li>Pour chaque plaque 145 mm, recueillir des matures BMDMs dans un tube à centrifuger conique 15 mL à l’aide de 5 à 6 mL de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 10 mM dans une solution saline de Dulbecco tamponnée au phosphate (SPD) (pH 7,4). 
		Remarque : Ne pas utiliser la trypsine car il peut modifier l’état d’activation des cellules18.</li>
		<li>Ajouter un volume égal de CMCM préchauffé dans chaque tube de cellules recueillies.</li>
		<li>Centrifuger à 180 x g pendant 8 min à 20 ° C. Jeter le surnageant.</li>
		<li>Remettre en suspension les cellules CMCM et comte.</li>
		<li>Ajouter à chaque puits d’une plaque de culture cellulaire de 24 puits, 1 x 105 cellules dans 1 mL de la CMCM.</li>
		<li>Incuber à 37 ° C, 5 % de CO2 pendant 24 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analyse et traitement de débris de la myéline
	<ol>
		<li>Ajouter 10 µL de 100 mg/mL CFSE étiqueté les débris de la myéline dans chaque cupule (concentration finale de 1 mg/mL).</li>
		<li>Incuber pendant 1 à 3 heures à 37 ° C, 5 % de CO2.</li>
		<li>Laver la plaque 3 fois avec du PBS stérile pour enlever les débris de la myéline non englouti.</li>
		<li>Ajouter 400 µL de paraformaldéhyde à 4 % dans chaque puits. Incuber 30 min à température ambiante.</li>
		<li>Laver la plaque 2 fois avec du PBS stérile.</li>
		<li>Ajouter 400 µL de solution de Hoechst 33258 dans chaque puits. Incuber pendant 5 min à l’abri de la lumière de RT.</li>
		<li>Laver les plaques 2 fois avec du PBS stérile.</li>
		<li>Ajouter 200 µL de Fluoro-gel avec tampon Tris dans chaque puits pour réduire le photoblanchiment.</li>
		<li>Cellules d’image à l’aide d’un microscope inversé à epi-fluorescente capable. 
		Remarque : Les longueurs d’onde d’excitation et d’émission de CFSE sont 494 nm et 521 nm, respectivement.</li>
		<li>Divisez le nombre de cellules positives CFSE par le nombre de noyaux afin de déterminer l’absorption relative de la myéline débris.</li>
		<li>Avant l’imagerie, maintiennent les plateaux jusqu'à 7 jours à 4 ° C, abri de la lumière.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. quantification des lipides intracellulaires par une coloration rouge-O huile
Remarque : Voici la méthode de base pour l’observation des lipides intracellulaires de la myéline-débris-dérivé.L’utilisation de CFSE étiqueté les débris de la myéline n’est pas recommandée pour quantification fluorescente de ORO coloration en raison du chevauchement spectrale. Ajout d’autres traitements et conditions expérimentales devra être optimisé par l’enquêteur.
<ol>
	<li>Préparation de solutions de coloration
	<ol>
		<li>Préparer la solution colorante de 0,5 % huile rouge-O (ORO).<ol>
			<li>Ajouter lentement 100 mL de 100 % propylène glycol (1, 2-Propanediol) à 0,5 g d’ORO (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol) tout en remuant.</li>
			<li>Chauffer la solution à 95 ° C pendant 15 min ou jusqu'à ce que toutes les grosses particules sont dissolvent. 
			NOTE: ne pas chauffer à plus de 100 ° C.</li>
			<li>Filtrer la solution à travers un morceau de papier filtre quand elles sont encore tièdes dans un nouveau conteneur.</li>
			<li>Laisser la solution refroidir jusqu’au lendemain à RT. Solution peut être conservée pendant 1 an à température ambiante.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Préparer la solution de propylène glycol 85 %.<ol>
			<li>Ajouter 85 mL de 100 % propylène glycol dans 15 mL de ddiH2O. remuer jusqu'à ce que le mélange. Solution peut être conservée pendant 1 an à température ambiante.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Préparation des plaques de traitement
	<ol>
		<li>Préparer une plaque 24 puits suivant la méthode décrite à la Section 3.</li>
		<li>Incuber à 37 ° C, 5 % de CO2 pendant 24 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Traitement de débris de la myéline
	<ol>
		<li>Ajouter 10 µL de débris de myéline de 100 mg/mL dans chaque cupule (concentration finale de 1 mg/mL).</li>
		<li>Incuber pendant 1-3 h à 37 ° C, 5 % de CO2.</li>
		<li>Laver la plaque 3 fois avec du PBS stérile pour enlever les débris non digérés de la myéline. Remarque : À ce stade, plaques peuvent subir la fixation immédiate ou CMCM frais peut être ajouté et cellules retournées pour une incubation de points dans le temps additionnel.</li>
		<li>Ajouter 400 µL de paraformaldéhyde à 4 % dans chaque puits. Incuber 30 min à température ambiante.</li>
		<li>Laver la plaque 2 fois avec stérile PBS puis rencontrée aux taches.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coloration de ORO et analyse
	<ol>
		<li>Laver la plaque fixe 3 fois avec ddiH2O.</li>
		<li>Ajouter 400 µL de 100 % propylène glycol dans chaque puits et incuber pendant 5 min à température ambiante. 
		NOTE: cela va réduire les reports de ddiH2O.</li>
		<li>Aspirer le propylène glycol et ajouter 400 µL de solution ORO dans chaque puits.</li>
		<li>Incuber pendant 8 min à 60 ° C.</li>
		<li>Aspirer la solution ORO. Ensuite, ajouter 400 µL de 85 % de propylène glycol dans chaque puits et incuber pendant 5 minumintes à température ambiante.</li>
		<li>Laver la plaque 3 fois avec ddiH2O.</li>
		<li>Ajouter 400 µL de solution de Hoechst 33258 dans chaque puits. Incuber 5 min à ta, abri de la lumière.</li>
		<li>Laver les plaques 2 fois avec du PBS stérile.</li>
		<li>Ajouter 200 µL de Fluoro-gel avec tampon Tris dans chaque puits.</li>
		<li>Cellules d’image à l’aide d’un microscope inversé à epi-fluorescente capable. ORO peut être photographiée à l’aide d’un ensemble standard de filtre Texas Red ou DsRed.</li>
		<li>Quantifier la rétention relative de lipides en déterminant la zone positive de ORO dans chaque champ de l’image et en divisant par le nombre de noyaux.</li>
		<li>Maintenir les plaques pendant 7 jours à 4 ° C abri de la lumière.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont aucune divulgation.

Les procédures décrites ici utilisent des fraîchement isolées débris de myéline CNS brut ou les macrophages primaires de moelle osseuse. Pour réduire les dépenses de l’animales, il est recommandé que les deux cerveaux et les cellules de la moelle osseuse être cueillie dans chacune des souris au moment du sacrifice. Deux chercheurs travaillant ensemble peuvent préparer ces deux matériaux en même temps. Alternativement, les cerveaux peut être stockées à-80 ° C dans du PBS additionné d’antibiotiques avant l’isolement de déb...

Les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs) sont un lien important entre le système immunitaire inné et adaptatif. Comme antigène présentant des cellules (CPA), ils peuvent communiquer avec via les deux présentation de l’antigène, les lymphocytes et cytokine release1,2,3. Cependant, comme les phagocytes professionnels, leur fonction principale est de clairement pathogènes, cellules âgées et les débris cellulaires1,4. Suite à une blessure de la moelle épinière (SCI), des quantités considérables de débris de la myéline est généré à partir des oligodendrocytes mourants, le type de cellule responsable de la CNS axon myélinisation5. Nous et autres avons montré que dégagement des débris de la myéline est avant tout la responsabilité d’infiltration de BMDMs5,6,7. Toutefois, au sein de la moelle épinière engouffrement de sites des débris de la myéline a été suggéré de transférer ces cellules normalement anti-inflammatoires vers un état pro-inflammatoire5,8,9. Comme des médiateurs clés de la neuro-inflammation de la moelle épinière lésée, BMDMs sont des objectifs cliniques importants.
Afin d’étudier l’influence de BMDMs dans la moelle épinière lésée, nous avons développé un modèle in vitro pour étudier directement comment BMDMs répondre aux débris de la myéline. Afin d’améliorer la pertinence biologique, tant primaires BMDMs murins et les débris de la myéline fraîchement isolées sont utilisées dans ces enquêtes. Par conséquent, les méthodes présentées ici également détaillent l’isolement et la culture de BMDMs murins primaires et une technique de dégradé mis à jour le saccharose utilisée pour isoler les CNS murin dérivé myéline débris10,11,12. Débris de la myéline peut porter facilement avec un colorant fluorescent, carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE), pour suivre que son internalisation par CFSE BMDMs. est bien adaptée pour cette application, car il est non cytotoxiques et son permis étroit spectre de fluorescence multiplexage avec autre fluorescent sondes13,14. Après la phagocytose, la myéline débris lipides sont transportés à travers les lysosomes et empaquetées comme les lipides neutres dans les gouttelettes de lipides intracellulaires5. Afin de quantifier cette accumulation de lipides intracellulaires, nous présentons un O huile de rouge (ORO) coloration méthode optimisée pour l’analyse quantitative d’image. Cette méthode de coloration simple produit des résultats reproductibles robustes et15de la quantification. Ces méthodes facilitent l’étude de la myéline débris phagocytose et lipides rétention de matériel spécialisé limitée.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30243.01</td><td>Glycémie élevée avec L-glutamine, pyruvate de sodium</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine Solution</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>Solution Sérum de veau nouveau-né (NCS)</td><td>Rocky Mountain Biologics</td><td>NBS-BBT-5XM États-Unis</td><td></td></tr><tr><td>Origine NCTC clone 929 [Cellule L, L-929, dérivé de la souche L]&nbsp ;</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td>L929 Lignée cellulaire de préparation de milieux conditionnés Plaques</td></tr><tr><td>de culture cellulaire à 24 puits</td><td>VWR</td><td>10062-896&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Plat de culture cellulaire</td><td>Greiner Bio-One</td><td>639960</td><td>Polystyrine, 145/20mm</td></tr><tr><td>CFSE Kit de prolifération cellulaire</td><td>Thermo Fisher</td><td>C34570</td><td>DMSO pour la constitution</td></tr><tr><td>Fluoro-gel fourni avec tampon Tris&nbsp ;</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>17985-11</td><td></td></tr><tr><td>Huile Rouge O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td><Equipement></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matériaux</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td>Thinwall, polypropylène, 38,5 ml, 25 x 89 mm</td></tr><tr><td>SW 32 Ti Rotor ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td>SW 32 Ti Rotor, godet oscillant,</td></tr><tr><td>homogénéisateur rotatif portatif</td> en titane <td>Fisher Science</td><td>08-451-71</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro phagocytose des débris de la myéline par les macrophages dérivés de la moelle osseuse

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

Les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs) sont des leucocytes matures qui servent un rôle physiologique essentiel comme les phagocytes professionnels capable d’effacer une variété de particules. Normalement, les BMDMs sont restreints de système nerveux central (CNS), mais suite à une blessure, ils peuvent facilement s’infiltrer. Une fois dans le tissu lésé de CNS, BMDMs sont le type de cellules primaires responsable de l’apurement des débris cellulaires dérivées de blessures, y compris de grandes quantités de débris de myéline riche de lipides. Les ramifications neuropathologiques de l’infiltration et la myéline phagocytose de débris BMDM dans le système nerveux central sont complexes et pas bien compris. Les protocoles décrits ici, permettent l’étude directe in vitro de BMDMs dans le contexte des blessures de la CNS. Nous couvrons murin BMDM isolement et culture, préparation de débris de la myéline et tests pour évaluer la phagocytose de débris BMDM la myéline. Ces techniques produisent des résultats quantifiables robustes sans le besoin d’équipement spécialisé significatif ou matériaux, mais peuvent être facilement personnalisés pour répondre aux besoins des chercheurs.

Traitement des BMDMs avec CFSE étiqueté les débris de la myéline devrait produire une internalisation claire (Figure 2). Un temps de 3 heures interaction est suffisant pour BMDMs à phagocyter assez débris de myéline supplémentaire pour la détection en aval robuste, accumulation intracellulaire peut être observée avec aussi peu que 1 heure d’interaction. Cependant, quelques débris de la myéline peut toujours être présent à la surface des cellules après le lavage. Ceci peut être dû lavage insu...

Nous présentons des méthodes pour évaluer la capacité phagocytaire des primaires macrophages dérivés de la moelle osseuse murines utilisant des débris de la myéline fluorescent étiquetés et coloration de gouttelettes de lipides intracellulaires.

In Vitro Phagocytose des débris de la myéline par les Macrophages dérivés de la moelle osseuse

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

L’objectif global de ce protocole est d’évaluer la phagocytose des macrophages dérivés de la moelle osseuse des débris de myéline dérivés du cerveau. Ce protocole est conçu pour répondre à des questions clés dans le domaine des neurotraumatismes. L’avantage de cette méthode est qu’elle permet une analyse efficace et relativement rentable des réponses des macrophages in vitro, en particulier de la capacité phagocytaire des macrophages dérivés de la moelle osseuse pour les débris de myéline.Cette méthode peut facilement être adaptée pour étudier les effets des modulateurs externes. Après avoir saturé la souris avec 70 % d’éthanol, faites une ouverture dans la peau abdominale. Tirez la peau vers l’arrière pour révéler les pattes pour la dissection.Veillez à ne pas percer la cavité péritonéale pendant ce processus. Une fois exposé, retirez les jambes en coupant au niveau de la cheville et de la hanche. Placez les cuisses dans du PBS glacé complété par des antibiotiques.Lavez le tissu dans du PBS frais et glacé complété par des antibiotiques pour déloger toutes les particules qui auraient pu adhérer au tissu pendant la dissection. Un léger mouvement de grattage appliqué le long du muscle délogera la majorité des tissus indésirables.À l’aide d’un scalpel et d’une pince à épiler, libérez le tibia du muscle et du tissu conjonctif. Une fois libéré, retirez les deux extrémités pour exposer la cavité de la moelle. Répétez ce processus pour le fémur.Fixez une aiguille de calibre 25 sur une seringue de 20 millimètres remplie d’un milieu complet de macrophages dérivés de la moelle osseuse. Ensuite, rincez la cavité de la moelle osseuse. L’os apparaîtra blanc lorsqu’il sera suffisamment rincé.Agitez les aspirations de moelle collectées à l’aide d’une aiguille de calibre 18 pendant 30 à 90 secondes afin d’obtenir une suspension à cellule unique. Ensuite, passez la suspension dans une crépine stérile de 70 micromètres à cellules poreuses. Répartissez uniformément les suspensions cellulaires dans des boîtes de culture cellulaire de 145 centimètres.Chaque souris fournira suffisamment pour un total de trois plats. Après sept jours de culture, ces plats seront généralement entre 70 et 80 % confluents avec des macrophages matures. Pour isoler les débris de myéline brute du cerveau, une série d’étapes d’ultracentrifugation par gradient de saccharose est effectuée.Pour commencer, 10 à 12 cerveaux sont disséqués chez des souris âgées de huit à 10 semaines. Les cerveaux sont ensuite homogénéisés dans une solution de saccharose à 0,32 molaire, puis superposés sur un coussin de solution de saccharose à 0,383 molaire pour créer un gradient discontinu. Après la centrifugation, les débris de myéline brute se retrouvent à l’interface entre les couches.Celui-ci est collecté et distribué dans une solution tampon Tris puis centrifugé à nouveau pour granuler les débris de myéline. Le granulé est remis en suspension dans une solution tampon Tris et réparti entre deux tubes pour une cénétrification supplémentaire. Pour commencer, retirez tout le cerveau et placez-le dans un plat avec une solution glacée de saccharose 0,32 molaire.À l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles, coupez les cerveaux collectés en morceaux d’environ cinq millimètres. Cette étape facilite le processus d’homogénéisation ultérieur. Prélevez le tissu dans un tube de 50 millilitres.À l’aide d’un homogénéisateur rotatif, homogénéisez le tissu en une boue lisse. Assurez-vous que tous les gros solides cérébraux visibles ont été soigneusement homogénéisés. Dans un tube d’ultracentrifugation contenant 20 millilitres de solution de saccharose à 0,83 molaire, générer et homogéner en prenant soin de maintenir la séparation.Équilibrez soigneusement chaque tube à l’aide de la solution de saccharose à 0,32 molaire. Une fois terminé, transférez les tubes dans un rotor de centrifugeuse approprié et faites-les tourner pendant 45 minutes à 100 000 fois la gravité, quatre degrés Celsius. Assurez-vous que l’accélération et la décélération sont réglées à leurs valeurs minimales.Une fois la centrifugation terminée, les débris de myéline seront visibles entre l’interface de densité du saccharose. Récupérez délicatement les débris de myéline. Une fois collecté, ajoutez du tampon Tris aux débris de myéline.Homogénéiser à nouveau avec un homogénéisateur rotatif. Répartissez l’homogénat entre six tubes d’ultracentrifugation propres et équilibrez les tubes si nécessaire avec un tampon Tris supplémentaire. Centrifugez à nouveau les débris de myéline collectés à 100 000 fois la gravité, quatre degrés Celsius pendant 45 minutes, avec l’accélération et la décélération réglées à leurs valeurs maximales.Après centrifugation, la myéline aura été granulée. À l’aide du tampon Tris, remettez la pastille en suspension. Combinez à nouveau les resuspensions et l’ultracentrifugeuse.Après la centrifugation, un granulé bien tassé se forme. Décantez le surné. Remettez la pastille en suspension dans du PBS stérile.Répartissez également les débris de myéline en suspension dans des tubes de microcentrifugation pré-pesés. Après une centrifugation de 10 minutes à 22 000 fois la gravité, retirez le surnuméraire PBS. Après avoir pesé la pastille, remise en suspension à une concentration de 100 milligrammes par millilitre avec du PBS.Les débris de myéline brute qui en résultent conviennent maintenant à l’étude de la phagocytose. Les débris de myéline de marquage CFSE peuvent être utilisés pour suivre l’internalisation précoce ainsi que le trafic intracellulaire. Les débris de myéline non marqués sont compatibles avec la coloration lipidique Oil Red-O pour évaluer le stockage et le métabolisme des lipides internalisés.Si vous utilisez des débris de myéline qui ont été stockés à moins 80 degrés Celsius, vous voudrez d’abord les remettre en suspension avec une aiguille de calibre 29. Remettez en suspension 10 milligrammes de débris de myéline granulés dans 200 microlitres de PBS. Ajoutez ensuite deux microlitres de solution CFSE de cinq millimolaires.Pipette pour mélanger. Après une incubation de 30 minutes, à l’abri de la lumière et du lavage ultérieur, remettre en suspension les débris de myéline à 100 milligrammes par millilitre avec du PBS. Après la culture et la fixation avec 4 % de paraformaldéhyde, ajoutez 100 % de propylène glycol dans chaque puits.Après avoir incubé pendant cinq minutes à température ambiante, ajoutez la solution de coloration Oil Red-O dans chaque puits. Incuber pendant huit minutes à 60 degrés Celsius en agitant doucement. Inclinez doucement la plaque pour permettre une aspiration complète de la teinture Oil Red-O.Dans chaque puits, ajoutez 85 % de propylène glycol. Après cinq minutes d’incubation à température ambiante, lavez bien les puits avec du PBS et colorez les cellules avec le colorant nucléaire de votre choix. Images représentatives de cellules de moelle osseuse en culture.24 heures après l’ensemencement initial, peu de cellules adhérentes sont présentes. Cependant, en présence du facteur de stimulation des colonies de macrophages, le M-CSF, les cellules précurseurs des leucocytes commencent à se différencier. Après sept jours de culture en présence de M-CSF, les cellules précurseurs sont complètement différenciées en macrophages matures dérivés de la moelle osseuse capables de phagocytose.En utilisant cette méthode, une seule souris C57 noire 6J âgée de huit à 10 semaines produira généralement 18 à 24 millions de macrophages de moelle osseuse. Pour visualiser l’internalisation, des débris de myéline marqués au CFSE sont ajoutés à des cultures de macrophages dérivées de la moelle osseuse. Les cellules ont été traitées avec un milligramme par millilitre de débris de myéline marqués au CFSE pendant une heure avant le lavage et la fixation avec 4 % de paraformaldéhyde.Les débris de myéline internalisés peuvent être visualisés à l’aide d’ensembles de filtres GFP standard sur un microscope à capacité épifluorescente. Pour démontrer comment l’accumulation de myoline lipidique change au fil du temps, les macrophages ont été traités avec des débris de myéline non marqués pendant 90 minutes, puis lavés et fixés à divers moments. Immédiatement après le lavage, peu de gouttelettes de lipides sont visibles.Cependant, au fil du temps, davantage de gouttelettes lipidiques deviennent visibles, atteignant un maximum environ 24 heures après le lavage. Les macrophages commenceront à métaboliser pour s’écouler vers les réserves de lipides, réduisant ainsi le nombre de gouttelettes colorables. Pour quantifier la coloration Oil Red-O, cinq images obtenues au hasard à partir de chaque échantillon de point temporel ont été obtenues à l’aide d’un microscope à capacité épifluorescente.La zone colorée en Oil Red-O a été déterminée pour chaque puits à l’aide d’images capturées dans le canal DsRed. Le nombre total de cellules est déterminé en comptant le nombre de noyaux présents dans chaque champ. Ce graphique montre la quantification résultante.Une augmentation constante du signal Oil Red-O-positif est typique, car les macrophages dérivés de la moelle osseuse convertissent les lipides de myéline internalisés en lipides neutres. Une diminution du signal positif Oil Red-O suit le pic à 24 heures lorsque les macrophages commencent à métaboliser ou à efflux les lipides. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon d’isoler et de cultiver des macrophages primaires dérivés de la moelle osseuse, ainsi que de la façon d’étudier leur interaction avec des débris de myéline dérivés du cerveau fraîchement isolés.La partie la plus importante de ces procédures est le bon maintien de la technique aseptique à tout moment. Étant donné que les macrophages peuvent répondre de manière robuste à de petites quantités de molécules associées à des agents pathogènes, il est essentiel de minimiser toute interaction potentielle susceptible de biaiser les résultats. Le principal avantage de ces techniques est qu’elles nous permettent d’obtenir des cellules primaires biologiquement pertinentes et des débris de myéline frais, tout en éliminant la quantité d’équipement spécialisé nécessaire.De plus, avec une certaine optimisation de l’utilisateur, ces méthodes peuvent être facilement adaptées pour répondre à une grande variété de questions concernant la réponse des macrophages dérivés de la moelle osseuse aux débris de myéline. En utilisant à la fois des débris de myéline marqués à la fluorescence et la coloration Oil Red-O des macrophages myélinisés, il est possible d’étudier des interventions thérapeutiques potentielles pour les patients souffrant de divers neurotraumatismes. L’objectif global de ce travail est d’éliminer les débris cellulaires à distance par les macrophages afin de favoriser la résolution de l’inflammation.

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In Vitro Phagocytose des débris de la myéline par les Macrophages dérivés de la moelle osseuse

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