Name: Injection hydrodynamique bassinet non-virale expression des protéines dans le rein (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Découvrez l'injection hydrodynamique dans le pelvis rénal pour l'expression protéique ciblée dans le rein de souris adulte. Cette méthode non-virale permet une expression transgénique reproductible spécifique au rein en néphrologie.

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Une bourse de développement de carrière du ministère des anciens combattants [BX002797] soutenu L.E.W. et le National Institutes of Health [R01-DK095867] et American Heart Association [15GRNT25700209] soutenu J.C. Le National Institutes of Health [DK093660], ministère des anciens combattants [BX002190] et le centre de Vanderbilt pour une maladie rénale, prise en charge M.H.W. Ce matériau est le résultat d’un travail soutenu avec les ressources et l’utilisation des installations du système de soins de santé VA Tennessee Valley.

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer et à ne déclarer aucun conflit d’intérêts.

Dans le présent protocole est décrit une méthode robuste pour parvenir à l’expression des gènes reproductible expressément dans le rein. Dans les mains d’un chirurgien moyennement expérimenté, nous avons trouvé le pourcentage de souris transfectées par cette technique d’être dans la gamme de 50 à 100 %, selon l’âge de la souris et la sensibilité de la lecture du transgène. Le niveau d’expression de gène de luciférase dépassait de fond pendant plusieurs mois chez les souris recevant les transposons piggyBac et co...

La technique d’injection hydrodynamique queue veineuse est devenu un moyen couramment utilisé pour atteindre de hauts niveaux d’expression des gènes chez les souris du foie1,2. Les reins sont également transfectées par cette technique à un niveau beaucoup plus faible, environ 100 fois moins3. L’injection hydrodynamique bassinet décrite ici offre un moyen simple pour contrôler la spécificité d’expression organe par des moyens physiques, selon les mêmes principes d’hydrodynamiques qui ont été établies précédemment dans le foie4,5 , muscle6et autres organes7,8. Cette méthode transfects cellules d’animaux vivants en vivo à l’aide de la pression et la vitesse pour forcer le liquide contenant de l’ADN dans les cellules, en même temps induisant des dommages à l’organe qui est rapidement résolu9. À l’aide de techniques chirurgicales bien établies pour visualiser le rein via une incision de flanc10 avec une seule injection par seringue à insuline, nous avons trouvé une transfection réussie de divers types de cellules de rein, principalement les fibroblastes interstitielles, les tubules et perception conduit11. Dissection de ces souris a montré que les autres organes sont transfectées pas à des niveaux suffisamment élevés pour visualiser de la luciférase imaging techniques11. La technique étant non viraux, utilisation d’ADN plasmidique pour la transfection permet une préparation rapide et facile des réactifs nécessaires pour injection.
Nous avons utilisé les injections localisées de l’hydrodynamiques pour exprimer l’antioxydant glutathion S-transférase A4, le récepteur du facteur de croissance 1 analogue à l’insuline et l’hormone érythropoïétine dans le rein, tous avec les effets biologiques attendus11, 12 , 13. une évaluation détaillée de la voie d’administration, volume d’injection, dosage de l’ADN et choix du promoteur a été effectué11. En outre, les deux le piggyBac transposon système cyclophosphamide traitement et/ou de supprimer la réaction immunitaire du transgène a été démontré pour améliorer à long terme gene expression résultats11. Autres chercheurs ont utilisé une approche de la veine rénale chez le rat avec succès, accroître l’efficacité élevée de transfection pour des périodes supérieures à un mois14. Cependant, correction génétique des phénotypes imitant des maladies humaines sont généralement effectués chez des souris tout d’abord comme une preuve de concept car plus de mammifères modèles génétiques sont des modèles de souris. Nous avons comparé injection dans la veine rénale à l’injection de bassinet du rein et constaté que l’injection dans le bassinet était supérieure à la veine rénale pour l’expression des gènes (environ dix fois plus élevée) et11de la survie. Le bassinet est une voie idéale de pénétration dans le rein car il est assez souple pour supporter les fluctuations dans la production d’urine et est souvent en mesure de conserver son intégrité structurelle même quand dilaté pendant une hydronéphrose. En outre, l’injection dans le bassinet autorisé à accéder à du rein sans percer la capsule rénale, permettant ainsi le fluide injecté sera visiblement conservé par le rein mieux qu’intraparenchymateuses injection. Autres organes de souris n’ont pas d’itinéraire d’entrée autres que le système vasculaire, mais l’espace urinaire du rein est un site d’injection idéale. En outre, injection dans la veine rénale a entraîné la fuite de sang dans la cavité abdominale. Le volume total de rein des reins de souris sauvage a été estimé par imagerie par résonance magnétique à environ 0,2 cm3, donc le volume d’un seul rein est approximativement égal à la quantité de liquide injecté par bassinet hydrodynamique injection (100 µL)15. Ici, nous proposons toutes les nuances détaillées du protocole injection hydrodynamique bassinet pour réaliser une transfection reproductible du rein.

<table><tbody><tr><td>AnaSed Xylazine</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-808-1947</td><td>Anesthésique - Substance non contrôlée</td></tr><tr><td>BD Seringue à insuline 0,5 mL 29G 1/2 pouce</td><td>Cardinal Health</td><td>309306</td><td>Seringues requises</td></tr><tr><td>Buprenex</td><td>Pharmacien/Vétérinaire</td><td></td><td>Analgésie - Substance contrôlée</td></tr><tr><td>Dynarex Drap de serviette jetable</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>19-310-671</td><td>Placer sur un coussin chauffant</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Utiliser uniquement de l’ADN plasmidique sans endotoxines</td></tr><tr><td>Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Positive Control</td><td>Charles River</td><td>PC200</td><td>Contrôle positif pour le test d’endotoxines</td></tr><tr><td>Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Single Test</td><td>Vial Charles River</td><td>R13500</td><td>Test d’endotoxines</td></tr><tr><td>Micro Dissection extra fine Ciseaux</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5882</td><td>Outil chirurgical</td></tr><tr><td>Fisherbrand Pochette de stérilisation à fermeture instantanée - 9"</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>01-812-51</td><td>Pour l’autoclave des outils chirurgicaux</td></tr><tr><td>Pompe à chaleur Gaymar</td><td>Paragon Medical</td><td>TP-700</td><td>Pompe à chaleur à circulation d’eau</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>Roboz Instrument chirurgical</td><td>DS-401</td><td>Pour réutiliser les outils chirurgicaux pendant l’opération</td></tr><tr><td>Graefe Pince</td><td>Instrument chirurgical Roboz</td><td>RS-5136</td><td>Outil chirurgical</td></tr><tr><td>Graefe Pince à tissus</td><td>Instrument chirurgical Roboz</td><td>RS-5153</td><td>Outil chirurgical</td></tr><tr><td>Halsey Porte-aiguille, 5 » de longueur</td><td>Instrument chirurgical Roboz</td><td>RS-7841</td><td>Outil chirurgical</td></tr><tr><td>Coussins chauffants - 15 » x 21 » - nécessite au moins 3</td><td>Paragon Medical</td><td>TP22G</td><td>À utiliser avec la pompe</td></tr> <tr><td>à chaleur GaymarIsoFlo (Isoflurane, USP)</td><td>Abbott Animal Health</td><td>5260-04-05</td><td>Pour l’imagerie et l’euthanasie</td></tr><tr><td>Système d’administration d’isoflurane Isotec Vaporisateur</td><td>Smiths Medical</td><td>VCT3K2</td><td>Pour l’imagerie et l’euthanasie</td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>Pharmacien/Vétérinaire</td><td></td><td>Anesthésique - Substance contrôlée</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34120</td><td>Tissus de laboratoire</td></tr><tr><td>Logiciel d’image vivante</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td>Pour l’imagerie d’animaux vivants</td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Perkin Elmer</td><td>122796</td><td>Pour l’imagerie d’animaux vivants</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000-US-CAN</td><td>Spectrophotomètre pour la mesure</td></tr><tr><td>de l’ADN Prevantics Swabs</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23-100-110</td><td>Pour la préparation à la chirurgie de la peau Prolene</td></tr><tr><td>5-0 sutures Taper 30"</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC0256891</td><td>Sutures non résorbables pour la peau</td></tr><tr><td>Puralube Brand Opthalmic Ointment</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-888-2572</td><td>Pour garder les yeux humides pendant la chirurgie</td></tr><tr><td>Trans IT - QR Hydrodynamic Delivery Solution</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR-5240</td><td>Tampon de distribution hydrodynamique pour diluer l’ADN</td></tr><tr><td>Vicryl 5-0 Sutures J303H</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9816710</td><td>Sutures résorbables pour couche musculaire</td></tr><tr><td>Wahl Mini Arco Clipper</td><td>Med-Vet International</td><td>8787-1550</td><td>Rasoir pour la préparation de la peau</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 200</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td>Pour l’imagerie d’animaux vivants</td></tr></tbody></table>

injection hydrodynamique bassinet non-virale expression des protéines dans le rein

Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney

Injection hydrodynamique crée un environnement local et à haute pression de transfecter divers tissus avec l’ADN de plasmide et d’autres substances. Injection dans la veine queue hydrodynamiques, par exemple, est une méthode bien établie par lequel le foie peut être transfecté. Ce manuscrit décrit l’application de principes hydrodynamiques par injection du rein souris directement avec l’ADN de plasmide pour l’expression des gènes spécifiques rein. Souris sont anesthésiés et le rein est exposé par une incision du flanc suivie d’une injection rapide d’une solution contenant de l’ADN de plasmide directement dans le bassinet. L’aiguille est maintenue en place pendant dix secondes, et l’incision est suturée. Le jour suivant, vivre l’imagerie animaux, Western blot ou immunohistochimie peut être utilisé pour analyser l’expression des gènes ou autres dosages adaptés pour le transgène de choix sont utilisés pour la détection de la protéine d’intérêt. Méthodes publiées pour prolonger l’expression des gènes comprennent le transgène induite par le transposon intégration et cyclophosphamide traitement pour inhiber la réponse immunitaire pour le transgène.

La technique d’injection et de la chirurgie sont simples à effectuer une fois maîtrisé, nécessitant pas de matériel lourd ou matériaux coûteux. Si la nouvelle à la chirurgie rénale flanc-incision, une journée de formation sur plusieurs souris, à la demande d’euthanasie devrait pouvoir dans laquelle les souris ne sont pas récupérée après une chirurgie parce que la première tentative à cette chirurgie peut prendre beaucoup plus longtemps que la normale. Par ailleurs, enquêteurs connaissent ...

Ce protocole décrit une méthode pour injecter de l’ADN de plasmide dans le rein de souris via le bassinet pour produire l’expression du transgène spécifiquement dans le rein.

Injection hydrodynamique bassinet non-virale expression des protéines dans le rein

Hydrodynamic injection creates a local, high-pressure environment to transfect various tissues with plasmid DNA and other substances. Hydrodynamic tail ...

L’objectif global de cette intervention chirurgicale est de produire l’expression de protéines à partir de l’ADN plasmidique dans le rein de souris adulte. Cette méthode est un nouvel outil pour répondre à des questions clés en néphrologie, telles que la façon dont l’expression d’une protéine d’intérêt affecte le rein adulte. Le principal avantage de cette technique est qu’elle produit l’expression des protéines de manière reproductible, en particulier dans le rein, contrairement à d’autres méthodes qui peuvent également produire l’expression de gènes dans d’autres organes.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car l’injection du bassinet du rein nécessite une exposition soigneuse et doit être effectuée rapidement pour que l’ADN plasmatique pénètre dans les cellules. Commencez par remettre en suspension l’ADN plasmidique dans le tampon de livraison hydrodynamique. Sur un coussin chauffant à circulation d’eau recouvert d’un coussin bleu, placez la souris.À l’aide d’un rasoir conçu pour le toilettage des animaux, rasez le côté gauche du dos de la souris de l’épaule à la croupe et du flanc à la colonne vertébrale. Nettoyez les cheveux lâches et les débris et appliq

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Source : Gupta, K., et al. Injection intra-rénale d’Escherichia coli dans un modèle rat de pyélonephrite.  J. Vis. Exp. (2017).Cette vidéo montre l’injection intrarénale d’E. coli dans le bassin rénal d’un rat anesthésié pour induire une infection rénale localisée, modélisant ainsi une pyélonephrite aiguë. Il met en lumière les étapes chirurgicales clés et les techniques aseptiques nécessaires pour établir un modèle d’infection in vivo reproductible pour une analyse en aval.

Injection intrarénale d’E. coli dans le bassin rénal d’un rat

Source: Van Lidth de Jeude, et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the process of producing viral particles through transfection of embryonic kidney cells with plasmid–polyethylenimine complexes, which leads to viral genome expression, particle assembly, and virus collection in the medium.

Polyethylenimine-Mediated Transfection of Embryonic Kidney Cells for Recombinant Virus Production

Dans cette vidéo, nous présentons le protocole d’injection hydrodynamique de plasmides dans le bassinet du rein de souris pour la transfection d’acides nucléiques. Cette technique permet l’administration de plasmides spécifiques à un organe en utilisant le principe de la pression hydrostatique élevée, qui pousse avec force les plasmides dans le site spécifique sans causer de lésions tissulaires.

Injection hydrodynamique du bassinet du rein : une technique pour délivrer directement de l’ADN dans les cellules rénales d’un modèle murin

Dans cette vidéo, nous démontrons l’administration intrarénale de médicaments chez le rat via l’artère rénale. Cette méthode est bénéfique pour améliorer le ciblage des médicaments, la puissance des médicaments et la minimisation de la toxicité systémique.

Administration intrarénale de médicaments chez le rat : méthode d’administration de médicaments thérapeutiques dans le rein de rat par injection intra-artérielle

Ici, nous présentons un protocole pour utiliser des cartes de destin et des traceurs de lignées pour cibler les injections dans des blastomères individuels qui donnent naissance au rein d’embryons de Xenopus laevis.

Technique à la cible microinjection du Developing<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

blessures rénales survenant à partir de néphrotoxines, qui comprennent des médicaments allant des antibiotiques aux agents chimiothérapeutiques, peuvent entraîner des troubles complexes dont la pathogénie reste mal compris. Ce protocole montre comment zebrafish peut être utilisé pour la modélisation de la maladie de ces conditions, qui peuvent être appliquées à l'identification des mesures néphroprotecteurs.

Néphrotoxine microinjection dans Zebrafish au Modèle lésion rénale aiguë

L'administration de médicaments pour la récupération de la fonction rénale nécessite un contrôle de la localisation et la distribution du composé thérapeutique. Ici, nous décrivons en détail une technique simple pour la livraison intrarenal de médicaments chez les rats. Cette procédure peut être facilement réalisée sans la mortalité et une reproductibilité élevée.

Livraison intravasculaire de produits biologiques du rein de rat

Ce manuscrit décrit un modèle chirurgical de pyélonéphrite chez le rat utilisant une infection intrarénale directe par Escherichia coli dans le bassinet du rein. La procédure expérimentale peut être utilisée pour étudier la pathogenèse de la pyélonéphrite ainsi que l’inflammation et la fibrose associées.

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Ce manuscrit décrit une méthode pour la livraison ciblée à un rein simple par l’intermédiaire d’un cathéter placé dans l’aorte abdominale infrarenal dans la souris.

Livraison directe de médicaments au rein par l’intermédiaire de l’artère rénale

Ici, nous livrons des imitations exogènes de miARN synthétisées artificiellement au rein via l’injection veineuse d’un vecteur non viral et de nanoparticules de polyéthylènemine dans plusieurs modèles murins de maladie rénale. Cela a conduit à une surexpression significative de miARN cible dans le rein, entraînant une progression inhibée de la maladie rénale dans plusieurs modèles murins.

Livraison d’un miARN exogène synthétisé artificiellement dans le rein à l’aide de nanoparticules de polyéthylènemine dans plusieurs modèles murins de maladie rénale

Ce rapport détaille la méthode d’injection localisée des vecteurs AAV via le bassinet du rein pour un transfert de gènes efficace et sûr dans le rein de souris.

Administration efficace et sûre de gènes dans le rein de souris par injection rétrograde lente de vecteurs viraux adéno-associés

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