Name: Acellulaire biochimique dosage fluorimétrique pour haut débit mesure de peroxydation des lipides dans les lipoprotéines de haute densité (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Apprenez un dosage fluorimétrique acellulaire pour mesurer la peroxydation des lipides dans les HDL. Cette méthode rapide et reproductible permet d'étudier la fonction des lipoprotéines de haute densité dans les maladies cardiovasculaires.

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Les auteurs remercient les travaux du Dr Mohamad Navab, Alan Fogelman et Reddy Srinivasa pour leur rôle clé dans le développement d’itérations précédentes de ce modèle. T.A.A. est pris en charge par un RMIT University rectorale bourse postdoctorale. AJ et AH sont pris en charge par NHMRC projet grant 1108792. TK est pris en charge par NIH accorde NIH K08AI08272, Grant NIH/NCATS # µL1TR000124.

toutes les expériences à l’aide d’échantillons biologiques humains ont été effectués avec l’approbation de l’éthique de l’Université de Californie à Los Angeles, Los Angeles et le Comité de l’éthique humaine Alfred Hospital, Melbourne.
 Remarque : il existe de nombreuses variations de la fonction de fluorochrome HDL Assay (Voir discussion) 32. Ci-dessous, nous allons décrire le protocole qui donne des résultats plus cohérents et reproductibles. Une vue d’ensemble du test est illustré à la Figure 2.
 1. spécimen de traitement <ol><li>utilisation frais, non hémolysé sérum (peuvent être recueillis dans des tubes de séparateur de sérum) ou le citrate plasma obtenu après 12 à 14 heures de jeûne. Si vous utilisez des échantillons cryoconservés, inclure un contrôle approprié tel que décrit dans le présent protocole.</li>
</ol> 2. Jour 0-préparation pour le dosage <ol><li>Prepare travail présentation d’expérience avec les contrôles appropriés, d’échantillons et réplique. Exécuter chaque échantillon au moins en géométrie. Une disposition bien représentant 96 est illustrée à la Figure 3.</li>
	<li>Calculer tous les volumes de réactifs qui seront utilisés pour l’analyse basée sur le nombre d’échantillons et analyses répétées. 
	NOTE : Inclure un volume supplémentaire de 10 % dans chaque stock de travail pour s’assurer qu’il y a assez de volume pour chaque réactif pour l’expérience spécifique.</li>
	<li>Identifier tous les tubes pour toutes les différentes étapes de l’essai par exemple pour la séparation des HDL, mesure de HDL-C (en option) et le fluorochromeassay.</li>
</ol> 3. Jour 1-Preparation de commandes <ol><li>préparation du contrôle commun spécifique à l’étude <ol><li>créer un exemple de contrôle de sérum ou de plasma d’étude tous les échantillons. Si en cours d’exécution 20 échantillons dans chaque assiette en trois exemplaires, combiner 10 µL de chaque échantillon dans un contrôle 200 µL mis en commun. Donner une portion distincte de ce contrôle de la mise en commun pour les laboratoires cliniques pour déterminer la valeur de HDL-C de ce contrôle. 
		Remarque : Utilisez ce contrôle commun pour standardiser l’analyse et à rendre compte de connu de tous les possibles (par exemple type de sérum de matrice ou plasma, cycles gel-dégel, cryoconservation) et des facteurs de confusion inconnus qui peuvent affecter la variabilité expérimentale 27 ,, 28.</li>
	</ol></li> <li>Préparation spécifiques du laboratoire de contrôle de qualité (QCs) <ol><li>préparer un stock important de HDL dans chaque laboratoire (par exemple les HDL isolée de 5 mL de plasma provenant de donneurs sains 10) et cryoconservé plusieurs parties aliquotes de cette stock pour réduire les cycles de gel-dégel.</li>
		<li>Utiliser au moins 10 différentes réplique à partir de ce stock pour déterminer la valeur moyenne des HDLox. Une gamme acceptable de HDLox mesurée les valeurs pour chaque échantillon QC inclus dans chaque essai est dans &lt; 15 % du coefficient de variation de cette valeur moyenne.</li>
		<li>Donner une portion distincte de ce contrôle de la mise en commun pour les laboratoires cliniques pour déterminer la valeur de HDL-C de ce contrôle (par exemple 40 mg/dL). 
		Remarque : Une approche détaillée l’utilisation de sang de banques de sang pour créer ces contrôles a déjà été décrit 27 , 28 , 32. Utiliser des QCs supplémentaire au besoin (p. ex. un provenant d’un donneur sain, connu pour avoir la fonction normale de HDL et l’autre provenant d’un donneur connu pour avoir largement anormale fonction HDL.</li>
	</ol></li> <li>Optimisation du signal de fond et les valeurs vierges (facultatifs) <ol><li>pour minimiser le fond, ajouter la quantité appropriée de la catalase (1 à 4 U/mL) dans le milieu d’incubation pour enlever rapidement la formé H 2 O 2 en raison de l’oxydation de l’air spontané des tampons. 
		Remarque : Étant donné que les valeurs des puits vides (aucun HDL) sont être soustraites des valeurs des échantillons HDL et les résultats sont rapportés par rapport à un contrôle commun (qui est inclus dans la même assiette bien 96), nous avons trouvé que cette étape n’est pas pratiquement influencent t les résultats. Ainsi, optimisation du signal d’arrière-plan avec la catalase peut être omise, si nécessaire.</li>
	</ol></li></ol> 4. Jour 1-séparation de cholestérol HDL, à l’aide de précipitations de HDL Remarque : utilisez un réactif de précipitation HDL cholestérol standardisé disponible commercialement pour isoler apoB appauvri sérum selon le fabricant ' s instructions. Ces réactifs sont largement utilisés dans les dosages colorimétriques pour déterminer les niveaux de cholestérol HDL.
<ol><li>Utiliser fraîche (ou décongeler) échantillon de sérum ou de plasma.</li>
	<li>Mélanger des quantités égales (par ex. 80 µL) de plasma et réactif précipitant de HDL cholestérol (20 % p/v polyéthylène glycol dans un tampon glycine à pH 10,0 (25 ° C)).</li>
	<li>Mix bien en pipettant également, up et down.</li>
	<li>Centrifuger à 1000-2000 x g pendant 10 min.</li>
	<li>Aspirer le surnageant (fraction HDL).</li>
	<li>Idéalement utiliser immédiatement le HDL isolée pour le fluorochromeassay de la peroxydation lipidique HDL. Toutefois, si plusieurs échantillons sont exécutés dans le même jour et autres étapes comme la mesure de la concentration de HDL-cholestérol sont également fait, puis stocker le HDL isolé à 4 ° C et l’utiliser le lendemain pour la fonction fluorochromeHDL Assay.</li>
</ol> 5. Jour 1-Détermination du HDL-C HDL isolée Remarque : cette partie est facultative si la valeur de HDL-C de laboratoire clinique est utilisée pour normaliser les HDLox par la quantité de HDL-C.
<ol><li>Quantifier le HDL-cholestérol de plasma, à l’aide de la norme colorimétrique dosages 27. Ajouter 50 µL de réactif de cholestérol dans chaque puits et déterminer la concentration de cholestérol à l’aide de colorimétrique d’un lecteur et un cholestérol standard fournis dans chaque kit.</li>
</ol> 6. Jour 2-préparation des réactifs <ol><li>solutions préparer HRP et cholestérol de HRP 5 U/mL de solution (1 et 10 U/mL).</li>
	<li>Préparer 20 mM fluorochrome (p. ex., Amplex rouge) solutions : Décongeler un flacon de réactif fluorochrome et DMSO à température ambiante. Avant utilisation, dissoudre réactif fluorochrome (1 mg) dans 200 µL de DMSO. Stocker la solution-mère congelée à ≤-20 ° C, abri de la lumière.</li>
	<li>Préparer des témoins positifs et négatifs : utilisation 1 X ' tampon de réaction ' sans cholestérol et 20 mM H 2 O 2 solution de travail comme un contrôle positif et négatif, respectivement.</li>
</ol> 7. Jour 2-Fluorochrome dosage <ol><li>Ajouter 50 µL de 1 x tampon de réaction comme vide (témoin négatif).</li>
	<li>Facultatif : ajouter la solution de travail de 20 mM H 2 O 2 comme témoin positif dans chaque assiette.</li>
	<li>Pour minimiser la variabilité expérimentale et faire en sorte que l’addition des réactifs et des échantillons est effectués régulièrement et en temps opportun, effectuer tous les ajouts des échantillons dans une plaque 96 séparée de bien fond rond, clair, en polystyrène ou polypropylène (photo 1). Puis utilisez une pipette multicanaux pour transférer des volumes spécifiques dans 3 plaques à 96 puits (plaques 2-4 : bot en polypropylène, platTom, noir) (qui ont une disposition identique) ( Figure 2, Figure 3).
	<ol><li>Par exemple, tout d’abord ajouter 160 µL de HDL isolée dans chaque puits/échantillon de plaque 1 et ensuite à l’aide de la pipette multicanaux transférer 50 µL de HDL-cholestérol de chaque puits/échantillon dans les plaques 96 puits. Changer les conseils entre chaque ligne/colonne et utiliser les embouts non filtrés pour toutes les cessions.</li>
	</ol></li> <li>Laisser des échantillons dans les puits. Ne pas jeter. Il n’y a aucune étape de lavage entre addition des réactifs.</li>
	<li>Ajouter 50 µL de solution HRP 5 U/mL (0,25 U) dans chaque puits. 
	Remarque : Utilisez HRP avant l’addition du réactif fluorochrome.</li>
	<li>Incuber 30 min à 37 ° C. Ne pas jeter des échantillons après incubation (aucune étape de lavage entre les ajouts de réactifs).</li>
	<li>Ajouter 50 µL de fluorochromereagent pour une concentration finale de 300 µM. À ce stade, volume de réaction totale est de 150 µL. bien mélanger et protéger de la lumière.</li>
	<li>Évaluer l’affichage fluorescent (dans l’obscurité) chaque minute pendant 120 min à 37 ° C avec un lecteur de plaque fluorescente (filtres de 530/590 nm). 
	Remarque : Utilisez un intervalle de 60 minutes plus court avec les échantillons frais. Nous avons trouvé ce test 120 minutes donne plus de données reproductibles avec l’utilisation d’échantillons cryoconservés.</li>
	<li>Enregistrer des données à l’aide de logiciels appropriés.</li>
</ol> 8. Analyse des données 3 jour <ol><li>enregistrer les unités (unités arbitraires) de la fluorescence à 120 minutes après l’addition de la fluorochrome réactif de tous les échantillons, y compris les blancs et tous les contrôles.</li>
	<li>Calculer la valeur moyenne des unités de fluorescence (basé sur au moins triplicates) (HDL ox_sample). Ne prenez pas de valeurs aberrantes (&gt; 2 SDs de la valeur moyenne) en considération.</li>
	<li>Soustraire la fluorescence de fond à l’aide de l’équation suivante : 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq1.jpg"></li> <li>normalisation pour la quantité de cholestérol HDL (HDL-C) : normaliser la valeur de la peroxydation lipidique HDLox pour chaque échantillon (y compris le contrôle commun) par le HDL-C) (mg/dl). Tout au long de la section résultats, HDL ox est présenté comme n (HDL-C) HDLox mesure pour tenir compte de l’ajustement pour HDL-C. Utiliser l’équation suivante : <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq2.jpg"></li> <li>uniformiser l’expression de HDLox valeur de peroxydation lipidique de chaque échantillon contre la valeur d’un contrôle commun. Normaliser le n (HDL-C) HDLox valeur de peroxydation lipidique pour chaque échantillon (corrigé de HDL-C) par la n (HDL-C) HDLox valeur de peroxydation lipidique du contrôle commun. Tout au long de la section résultats, HDL ox est présenté comme nHDL ox mesure pour tenir compte de l’adaptation aux variations expérimentales et HDL-C. Utiliser l’équation suivante : <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq3.jpg"> Remarque : cette approche est similaire aux autres approches expérimentales établies afin de réduire la variabilité des mesures expérimentale telles que international normalized ratio (INR) 44 , 45. Cette approche a été validée dans les études cliniques 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39.</li> <li>effectuer le contrôle de la qualité des résultats expérimentaux à l’aide d’échantillons de contrôle de qualité standard. Chaque laboratoire doit établir ses propres contrôles de qualité (QCs). Idéalement, il y a un pour nHDLox auprès d’un échantillon avec HDL dysfonctionnel connu et un QC pour nHDLox auprès d’un échantillon de donneurs sains [p. ex. utilisation échantillon de jeunes adultes qui sont les donateurs de la Banque de sang établie et n’ont pas connu la comorbidité et facteurs de risque maladies cardiovasculaires notamment fumer]. Le contrôle de ce dernier standardise les résultats entre les différents laboratoires. Les valeurs moyennes de ces QCs sont établies sur la base répétitions au moins 5 (en général, nous utilisons 10 séries pour cette étape importante).
	<ol><li>Cocher si QCs mesuré dans chaque essai ont des valeurs dans l’intervalle prévu des valeurs. En supposant une variabilité expérimentale maximale acceptable de 15 %, toutes les valeurs mesurées expérimentales doivent tomber dans 15 % des valeurs moyennes connues d’établies au Québec. Utiliser les équations suivantes : <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq4.jpg"> <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq5.jpg"> Remarque : si soit du contrôle qualité inclus samples () normal par rapport aux HDL dysfonctionnelle) donne des valeurs HDLox en dehors de la plage attendue (mis en place dans chaque laboratoire) puis répéter l’expérience.</li>
	</ol></li> <li>Effectuer le contrôle de la qualité des résultats expérimentaux à l’aide du coefficient de variation (CV) pour quantifier la variabilité expérimentale : répéter tous les échantillons avec CV % &gt; 15 %. Utiliser l’équation suivante : <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq6.jpg"> Remarque : une typique intra-essai (dans la même assiette) et la variabilité expérimentale inter-essai (entre les différentes plaques) est &lt; 15 %. 2) typique intra-série CV se situe entre 1 à 7 % et un interassay typique CV est entre 3 et 10 %.</li>
</ol>

Ce protocole et le dosage sont pertinentes pour le brevet PCT/US2015/018147.

Le protocole décrit ici offre un outil robuste pour répondre à des questions de recherche importantes concernant le rôle de fonction de HDL dans l’athérosclérose et des maladies humaines. L’essai quantifie la teneur en peroxyde lipidique HDL par mg de HDL-C en utilisant l’amplification enzymatique (HRP). Cette approche évite les limitations connues de tests de fonction HDL préalables (par exemple l’essai de l’efflux de cholestérol) y compris une hétérogénéité significative en ce qui concerne les types de cellules utilisé...

Les maladies cardiovasculaires athérosclérotiques (CVD) sont la principale cause de décès dans le monde1,2. Les études épidémiologiques ont montré que les faibles niveaux de cholestérol des lipoprotéines de haute densité (HDL) sont généralement inversement associés au risque pour le développement de l’athérosclérose1,2. Bien que plusieurs études prend en charge un rôle atheroprotective HDL1,2, le mécanisme par lequel les HDL atténue l’initiation et la progression de l’athérosclérose est complexe 3,4. Ainsi, il a été suggéré que la structure complexe et la fonction de HDL au lieu du niveau absolu peuvent prédire avec plus de précision l’athérosclérose 5,6,7,8. Plusieurs HDL protéines et lipides de compositions changements qui portent atteinte à la HDL se produisent dans les États inflammatoires telles que l’athérosclérose. Ces i) réduire son cholestérol efflux potentiels 9, ii) réduction anti-inflammatoires et augmentation des protéines pro-inflammatoires associées aux HDL 6,7, niveaux de facteur d’antioxydants diminution iii) et de l’activité et de HDL capacité d’inhiber l’oxydation des lipoprotéines de basse densité (LDLox)10 et iv) augmenter les lipides hydroperoxyde contenu et redox activité (HDLox)9,11. Dosages robustes qui évaluent les fonctions pleotropic de HDL (par exemple l’efflux de cholestérol, fonction antioxydante) peuvent compléter le dosage du HDL-C-HDL dans la clinique.
La fonction de HDL est habituellement évaluée par des méthodes basées sur les cellules comme les efflux de cholestérol dosage8,12,13,14. Ces méthodes ont des limites importantes, y compris une hétérogénéité significative en ce qui concerne les types de cellules utilisées, le type de lecture a signalé, l’absence de normalisation et effets confusionnels des triglycérides 7,15. Ces inconvénients soulèvent des difficultés pour les grandes études cliniques16. Dosages acellulaire peuvent accorder des mesures plus robustes de fonction de HDL par rapport aux analyses cellulaires. L’efflux de cholestérol est l’une des fonctions plus importantes de HDL, mais il ne peut être déterminée par des analyses cellulaires. Autres approches pour déterminer la fonction de HDL comme protéomique17,18,19,20,21,22,23, essais chimiotactisme sur les cellules monocytes de HDL fonction 17,22,25 et 24 n’ont pas été normalisées et ne peut être utilisés dans les études chez l’homme à grande échelle.
HDL a important antioxydant atheroprotective effet5,6,7,8. La fonction antioxydante de HDL a été déterminée en présence de LDL dans la précédente cellule dosages fluorimétrique libre 26. Ces méthodes fluorimétrique biochimiques de la fonction antioxydante HDL ont été développées par Mohamad Navab et Alan Fogelman et leurs collègues26. Bien que plusieurs études sur les humains ont utilisé ces méthodes pour déterminer les HDL fonction 17,18,19,20,21,22,23 ,24, lipides (HDL)-lipides (LDL) et les interactions lipide-fluorochrome peuvent limiter la reproductibilité de ces épreuves biochimiques non-enzymatique libre cellulaire du HDL fonction27,28.
Intérêt récent a mis l’accent sur les conséquences fonctionnelles de l’oxydation de HDL qui est le résultat de l’oxydation des lipides et de protéines dans les HDL 27,29,30. Des études antérieures ont démontré que l’oxydation du HDL altère HDL fonction 27,29,30. HDL a un rôle majeur dans le transport de peroxydes lipidiques et élévé de peroxydes lipidiques est liée à la fonction anormale de HDL. Ainsi les teneur en peroxyde lipidique HDL peut être utilisée pour déterminer les HDL fonction 9,17,20,31 et étant donné les limitations connues des essais préalables de HDL fonction7, 15,27,32, nous avons développé une méthode fluorimétrique alternative qui quantifie les HDL lipides teneur en peroxyde (HDLox) 32. Cette méthode s’inspire de la peroxydase de raifort (HRP) de l’enzyme et le fluorochrome rouge Amplex qui permet de quantifier (sans oxydase de cholestérol) la teneur en lipides peroxydes par mg de HDL-C 32. Principe du dosage biochimique est montré dans la Figure 1. Nous avons montré que cette approche axée sur la fluorescence n’a pas les limites des tests de la fonction de HDL préalable27,28. Ce test a été encore raffiné et standardisé dans notre laboratoire afin qu’il fiable peut être utilisé dans les études chez l’homme à grande échelle même avec cryoconservés plasma 32,33,34, 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. la lecture de ce test est associée avec lectures d’essais basés sur les cellules validés, les mesures de substitution des maladies cardiovasculaires, l’inflammation systémique, dysfonctionnement immunitaire et phénotypes de risques cardiovasculaires et métaboliques 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. nous décrivons ici, cette méthode simple mais robuste pour mesurer la teneur en peroxyde lipidique HDL (HDLox). Ce dosage peut servir comme un outil pour répondre à des questions de recherche importantes concernant le rôle de fonction de HDL dans la maladie humaine où l’inflammation systémique, le stress oxydatif et lipides oxydés ont un rôle clé (telles que l’athérosclérose)32.

<table><tbody><tr><td>Réactif précipitant <fort>réactif expérimental</fort></td>HDL PEG (polyéthylène <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glycol)</td><td>Pointe Scientific</td><td>H7511</td><td></td></tr><tr><td>Réactif Amplex Red.</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Kit de dosage du cholestérol rouge Amplex. &bull ; &le ; &ndash ; 20&deg ; C et taureau ; Dessécher & taureau ; Protéger du</td></tr><tr><td>DMSO léger.</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Kit de dosage du cholestérol rouge Amplex. &bull ; &le ; &ndash ; 20&deg ; C et taureau ; Dessécher & taureau ; Protéger de la</td></tr><tr><td>peroxydase de radis cheval légère (HRP)</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. &bull ; &le ; &ndash ; 20&deg ; C et taureau ; Dessécher & taureau ; Protéger de la légère</td></tr><tr><td>cholestérol estérase.</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Kit de dosage du cholestérol rouge Amplex. &bull ; &le ; &ndash ; 20&deg ; C et taureau ; Dessécher & taureau ; Protéger de la lumière</td></tr><tr><td>Cholestérol Standard Standard</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Kit de dosage du cholestérol rouge Amplex. &bull ; &le ; &ndash ; 20&deg ; C et taureau ; Dessécher & taureau ; Protéger de la lumière</td></tr><tr><td>Resorufin fluorescense Référence</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. &bull ; &le ; &ndash ; 20&deg ; C et taureau ; Dessécher & taureau ; Protéger de la lumière</td></tr><tr><td>5x tampon de réaction.</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Kit de dosage du cholestérol rouge Amplex. &bull ; &le ; &ndash ; 20&deg ; C et taureau ; Dessécher & taureau ; Protéger de la lumière</td></tr><tr><td>HDL Cholestérol réactif automatisé</td><td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, États-Unis.</td><td>TR39601</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Plasticware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well plates (polypropylène, fond plat, transparent).</td><td>Plaques Sigma Aldrich</td><td>M0687</td><td></td></tr><tr><td>à 96 puits (polypropylène, fond plat, noir).</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9936</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Tubes Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>ClipTip 200, stérile</td><td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, États-Unis.</td><td>14-488-058</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pipettes multicanaux, 8 canaux, 125</td><td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, États-Unis.</td><td>&nbsp ; 14-387--955</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</strong</td><td>>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 2.01 software</td><td>Biotek, Vermont, USA</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td> Entreprise <</td><td>strong>Numéro de catalogue</strong</td><td>>Commentaires</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 Lecteur de plaques</td><td>Biotek, Vermont, USA</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

acellulaire biochimique dosage fluorimétrique pour haut débit mesure de peroxydation des lipides dans les lipoprotéines de haute densité

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Les lipoprotéines de haute densité faible taux de cholestérol (HDL-C) est l’un des plus puissants prédicteurs négatifs indépendants d’athérosclérose cardiovasculaire (MCV). La structure et la fonction des HDL et non HDL-C peuvent prédire avec plus de précision l’athérosclérose. Plusieurs HDL protéines et lipides de compositions changements qui portent atteinte à la HDL se produisent dans les États inflammatoires telles que l’athérosclérose. Fonction de HDL est généralement déterminée par la cellule en fonction des tests comme le test de l’efflux de cholestérol, mais ces tests ont plusieurs inconvénients manque de normalisation. Dosages acellulaire peuvent accorder des mesures plus robustes de fonction de HDL par rapport aux analyses cellulaires. Oxydation de HDL altère la fonction de HDL. HDL a un rôle majeur dans le transport de peroxydes lipidiques et élévé de peroxydes lipidiques est liée à la fonction anormale de HDL. Les interactions lipide-sonde devraient considérer quelle interprétation des résultats de la fluorescence non enzymatique tests pour mesurer l’état d’oxydation lipidique. Cela a motivé nous développions une méthode enzymatique acellulaire biochimique pour évaluer des HDL peroxyde contenu lipidique (HDLox) qui contribue à la dysfonction de HDL. Cette méthode s’inspire de la peroxydase de raifort (HRP) de l’enzyme et le fluorochrome rouge Amplex qui permet de quantifier (sans oxydase de cholestérol) la teneur en lipides peroxydes par mg de HDL-C. Voici un protocole describedfor détermination de la peroxydation lipidique HDL utilisant le réactif de fluorochrome. Variabilité du dosage peut être réduite par une normalisation stricte des conditions expérimentales. HDLox des valeurs plus élevées sont associés à la fonction d’antioxydant HDL réduite. La lecture de ce test est associée de lectures d’essais basés sur les cellules validés, les mesures de substitution des maladies cardiovasculaires, l’inflammation systémique, dysfonctionnement immunitaire et phénotypes de risques cardiovasculaires et métaboliques. Cette approche technique est une méthode fiable pour évaluer la fonction des HDL dans la maladie humaine où l’inflammation systémique, le stress oxydatif et lipides oxydés ont un rôle clé (telles que l’athérosclérose).

50 µL de chaque échantillon de HDL sont ajoutés dans chaque puits comme au point 7.3. 50 µL de solution HRP 5 U/mL (0,25 U) sont ensuite ajoutés dans chaque puits comme à l’étape 7,5. Les échantillons sont incubés pendant 30 min à 37 ° C, comme dans l’étape 7,6. 50 µL de réactif de fluorochrome sont ensuite ajoutés dans chaque puits comme à l’étape 7,7 (concentration finale de 300 µM). L’affichage fluorescent (en foncé) est ensuite évalué chaque minute pendant 120 minutes à 37 ° C avec un...

Nous décrivons ici un dosage fluorimétrique acellulaire biochimique pour dosage du HDL-la peroxydation lipidique. Ce test rapid et reproductible peut servir à déterminer la fonction de HDL dans les études à grande échelle et peut contribuer à notre compréhension de la fonction de HDL dans la maladie humaine.

Acellulaire biochimique dosage fluorimétrique pour haut débit mesure de peroxydation des lipides dans les lipoprotéines de haute densité

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

L’objectif global de cette méthode expérimentale est de déterminer la fonction des lipoprotéines de haute densité à l’aide d’un test biochimique acellulaire qui mesure la teneur en peroxyde lipidique d’une quantité spécifique de HDL. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans plusieurs domaines de la médecine, tels que le rôle de la fonction HDL dans les anomalies métaboliques des maladies cardiovasculaires. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une méthode biochimique acellulaire qui peut être utilisée pour déterminer de manière fiable la fonction HDL.Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du rôle de la fonction HDL dans les maladies cardiovasculaires et les anomalies métaboliques, elle peut également être appliquée à d’autres études sur les maladies, telles que les maladies inflammatoires. Pour commencer cette procédure, préparez le schéma de travail de la plaque à 96 puits, y compris les témoins, les échantillons et les répétitions appropriés, comme indiqué dans le protocole textuel. Calculez le volume de réactifs nécessaire en fonction du nombre d’échantillons et de répétitions.À l’aide d’un marqueur permanent, étiquetez les tubes pour chaque étape du dosage. Ensuite, combinez 10 microlitres de chaque échantillon pour créer un échantillon de contrôle groupé. Créez un deuxième échantillon de contrôle groupé pour le laboratoire clinique, afin de déterminer la valeur HDL-C.Après avoir préparé un stock important de HDL, cryoconservez plusieurs aliquotes pour minimiser les cycles de congélation et de dégel. Regroupez au moins 10 répétitions différentes pour créer un contrôle qualité groupé. Ensuite, déterminez la valeur moyenne de HDLox comme indiqué dans le protocole texte.Créer un deuxième contrôle qualité groupé pour le laboratoire clinique, afin de déterminer la valeur HDL-C. Pour commencer, décongelez un échantillon de plasma ou de sérum frais. Mélangez des volumes égaux de plasma et de réactif précipitant le cholestérol HDL.Pipetez de haut en bas plusieurs fois pour bien mélanger. Centrifuger à une vitesse comprise entre 1000 et 2000 fois G pendant 10 minutes. Après cela, aspirez le surnageant.Stockez le HDL isolé à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à effectuer le test de la fonction HDL fluorochrome. Si la valeur HDL-C du laboratoire clinique est utilisée pour normaliser HDLox, quantifiez le HDL-C plasmatique comme indiqué dans le protocole textuel. Pour commencer, mélangez le cholestérol et la HRP, de sorte que les solutions préparées contiennent cinq unités par millilitre de HRP.Décongelez un flacon de réactif fluorochrome et un flacon de DMSO à température ambiante. Une fois décongelés, dissolvez un milligramme de réactif fluorochrome dans 200 microlitres de DMSO. Conservez cette solution à une température inférieure à moins 20 degrés Celsius, à l’abri de la lumière.Ensuite, ajoutez 50 microlitres de tampon de réaction 1X à la plaque d’échantillon en tant que contrôle négatif. Ajouter 50 microlitres de solution de travail de peroxyde d’hydrogène de 20 millimolaires comme contrôle positif. Après cela, disposez une plaque fraîche à fond rond de 96 puits à utiliser comme plaque de préparation.Ajoutez 200 microlitres de HDL isolé dans chaque puits de cette plaque de préparation. À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez 50 microlitres de HDL de la plaque de préparation aux plaques expérimentales, comme indiqué dans le protocole de texte, le nombre de plaques expérimentales étant égal au nombre de répétitions dans l’essai. Après cela, ajoutez 50 microlitres de solution HRP préparée dans chaque puits.Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis ajouter 50 microlitres de réactif fluorochrome dans chaque puits, pour un volume total de 150 microlitres par puits. Bien mélanger et protéger de la lumière. À l’aide d’un lecteur de plaques fluorescentes, évaluez la lecture fluorescente à 37 degrés Celsius, dans l’obscurité, toutes les minutes pendant 120 minutes.Enregistrez les données à l’aide d’un logiciel approprié, puis calculez la valeur moyenne des unités de fluorescence comme indiqué dans le protocole texte. Dans cette étude, un test fluorométrique biochimique acellulaire est mis au point pour quantifier la teneur en peroxyde lipidique HDL par milligramme de HDL-C. Ceci est accompli par amplification enzymatique à l’aide de la HRP.Un lecteur de plaques fluorescentes est ensuite utilisé pour mesurer la fluorescence dans l’obscurité, toutes les minutes, pendant 120 minutes. Des données représentatives pour un patient connu pour avoir un HDL dysfonctionnel sont présentées ici, par rapport au contrôle combiné. On constate que le HDL dysfonctionnel a des niveaux de peroxyde lipidique deux fois plus élevés que ceux observés dans le HDL combiné chez les participants en bonne santé.Ensuite, le HDL est isolé et le HDLox est dosé chez 50 sujets sains et 100 patients infectés par le VIH. Les patients infectés par le VIH présentent, en moyenne, une teneur en peroxyde HDL supérieure de 60 % par milligramme de HDL-C à celle des sujets sains. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de six heures si elle est exécutée correctement.Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de préparer tous les réactifs et contrôles à l’avance, d’être cohérent, précis et de toujours inclure le contrôle expérimental approprié dans chaque plaque expérimentale. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler le HDL, de déterminer la teneur en peroxyde lipidique d’une quantité spécifique de HDL et de déprécier notre fonction HDL. N’oubliez pas que travailler avec des échantillons biologiques peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que des gants, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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