Name: Grand Volume, éclairage pertinent sur le plan comportemental pour Optogenetics chez les Primates Non humains (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Découvrez la construction d'un illuminateur tissulaire à grand volume pour l'optogénétique chez les primates non humains. Cette technique permet d'éclairer de larges régions cérébrales avec un minimum de dommages tissulaires.

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LCA reconnaît financé par une bourse NDSEG, la NSF GRFP et les amis de l’Institut de McGovern. EP reconnaît le Harry et Eunice Nohara t fonds, la classe MIT du fonds t 1995 et le MIT t fonds de financement. ESB reconnaît financement de NIH 2R44NS070453-03A1, le prix Harvey de IET et le prix de Fondation-Robertson de cellules souches de New York. RD reconnaît financement du NIH EY017292. Michael Williams a aidé l’équipe à organiser et rassembler les fournitures avant le tournage.

Remarque : toutes les procédures d’animaux étaient selon les directives des NIH et ont été approuvés par le Massachusetts Institute Technology Comité de protection des animaux.
 1. illuminateur Fabrication <ol><li>utiliser une paire de ciseaux tranchants pour couper un tronçon de 250 µm de diamètre en plastique fibre optique qui est supérieure à la longueur désirée illuminateur total d’au moins 10 cm.</li>
	<li>Enlever 15 à 20 cm de gaine de polyéthylène d’une extrémité de la fibre optique en plastique à l’aide d’une pince à dénuder 22 calibre.</li>
	<li>Secure distale plus 3 à 5 cm de l’extrémité dénudée de la fibre dans une pince étau de table.</li>
	<li>Tenez l’extrémité chemisée de la fibre tendue d’une main avec une traction constante constante. La fibre doit être parallèle au sol, perpendiculaire à l’étau. Maintenir cette tension constante sur la fibre tout au long de chauffage et de refroidissement (étapes 1.5 et 1.6 ci-dessous) pour que la fibre reste droite et tendue comme il amincit.</li>
	<li>Au réglage le plus bas d’un pistolet à air chaud température double (570/1 000 ° F), chauffer la partie dénudée de la fibre jusqu'à ce qu’elle est diluée à un diamètre de 60 à 100 μm, ou environ le diamètre d’un cheveu humain.</li>
	<li>Maintenir une tension constante sur la fibre tout en permettant à la fibre refroidir. Incapacité à maintenir la tension peut provoquer la fibre à friser.</li>
	<li>Confirmer le diamètre de l’extrémité amincie sous un microscope à dissection. Alternativement, on peut utiliser les étriers à la place.
	<ol><li>Si la fibre n’est pas assez mince, répétez les étapes 1.4 à 1.6 si nécessaire pour obtenir le diamètre souhaité.</li>
		<li>Facultatif si re-tirer, mettre une petite marque à la partie la plus étroite de la fibre si il sera chauffé à nouveau afin que le centre du pistolet à air chaud vise la partie la plus étroite de la fibre.</li>
		<li>Si la fibre est trop mince, recommencer.</li>
	</ol></li> <li>Une fois que la fibre ait complètement refroidi et le diamètre désiré a été atteint, pincer la fibre 3 cm du point plus étroit de chaque côté. Avec un accès rapide, forte traction dans l’axe de la fibre, séparez les côtés pour créer une pointe effilée.</li>
	<li>Examiner l’extrémité effilée sous une faible puissance (par exemple, 4 X) microscope de dissection. Si la pointe est fourchue ou ondulée ( Figure 1f), jeter la fibre.</li>
	<li>Préparer vers etch l’extrémité effilée en plaçant un morceau de ruban de laboratoire près de l’extrémité de la pointe, laissant les derniers 5 mm exposé. La bande protège la fibre de la gravure ci-dessus la longueur désirée de la luminescence. Cette longueur de pointe a été sélectionnée sur l’épaisseur du cortex des primates dans la région cible. Une durée plus longue ou plus courte pourrait être exposée selon la longueur désirée de l’éclairement. Si vous souhaitez une longueur de pointe différents etch, le bord de la bande de laboratoire peut être rapproché à ou plus loin de l’extrémité effilée.</li>
	<li>Replier un carré petit (~ 1 po x 2 po) de 5 μm feuille rodage de carbure de silicium entre le pouce et l’index. Placer l’extrémité de la fibre entre les deux côtés de la feuille de rodage et etch délicatement la fibre à l’aide de petits mouvements circulaires, comme si un BB de roulement entre le pouce et l’index. Souvent tourner la fibre afin que tous les côtés sont gravées uniformément. L’extrémité de la fibre apparaît &#8220; rugueuse &#8221; à le œil nu dans des zones qui ont été gravés, tandis que les zones non gravées apparaissent généralement lisses.</li>
	<li>Répéter l’étape 1.11 avec un oxyde d’aluminium de 3 μm rodage feuille.</li>
	<li>, Apposer un connecteur à l’extrémité de l’illuminateur en face de la pointe gravée. Cela permet l’illuminateur pour se connecter à un câble optique ou laser. 
	Remarque : Cette méthode diffère de la méthode préférée pour la fixation de verre / fibres optiques silice dans les bagues. Parce que la virole de métal est plus dur que la fibre optique en plastique, polissage de la fibre et une bague en tant qu’unité après que collage peut endommager la fibre optique en plastique comme de minuscules éclats de métal produit pendant le processus de polissage peut intégrer eux-mêmes en fibre plat clivée.
	<ol><li>Retirer environ 5 mm de la gaine de polyéthylène du côté opposé de l’illuminateur à l’aide d’une pince à dénuder 22 calibre.</li>
		<li>Couper l’autre extrémité plate avec un couteau chaud pour lisser la surface.</li>
		<li>Polonais à l’autre extrémité plate avec rodage successivement plus fines feuilles : 5 µm, 3 μm, 1 μm et 0,3 µm.</li>
		<li>Insérer l’appartement en face de l’extrémité dans une virole d’acier inoxydable de diamètre intérieur 260 µm jusqu'à ce qu’il affleure de l’extrémité de la ferrule.</li>
		<li>Confirmer visuellement que l’extrémité opposée est facilement et uniformément polie avec un microscope de fibre.</li>
		<li>Retirer l’embout de la fibre et l’embout verticalement sur le bord d’une table de bande avec la fibre vers le bas.</li>
		<li>Remplir une seringue de 1 mL avec de l’époxy en plastique et fixer une aiguille de 18 calibre émoussé à la seringue.</li>
		<li>Utiliser l’aiguille pour enduire vers le bas dans la virole. L’embout se remplir complètement avec de l’époxy.</li>
		<li>Insérer l’embout de la fibre.</li>
		<li>Essuyer tout excès époxy de surface polie de la fibre avec un chiffon non pelucheux humide avant séchage si nécessaire. Dans le cas contraire, excès époxy peut être enlevé après 12 à 24 h.</li>
		<li>Conserver la fibre doucement jusqu'à l’étalonnage et placer un capuchon sur l’embout.</li>
	</ol></li></ol> 2. Illuminateur d’étalonnage et de contrôle de la qualité Remarque : ces méthodes pour l’étalonnage évaluer pour la non-linéarité à différentes distances de l’extrémité de la fibre de sortie de lumière. Inégale répartition de la lumière résulte généralement d’un &#8220; bosselé &#8221; ou &#8220; ondulé &#8221; cône.
<ol><li>Créer un blindage léger diaphragme pour le haut de la sphère intégrant l’aide absorbant léger grille ( Figure 2). 
	Remarque : Portez des gants lorsque manipulation lumière absorbant aluminium pour empêcher la peau huiles de la création de légères taches réfléchissantes.
	<ol><li>Pli a 2 &#8221; de 4 &#8221; morceau de lumière absorbant aluminium au-dessus sur lui-même pour former un 2 &#8221; x 2 &#8221; square. une autre méthode consiste à couper un 2 &#8221; x 2 &#8221; carré avec une lumière absorbante côté et un feu qui reflète le côté (c.-à-d. un côté de papier d’aluminium standard) ; Toutefois, la méthode pliable est plus sûre parce qu’il fournit un bord terne pour la manipulation du diaphragme dans la prochaine étape.</li> <li>plier le ruban de laboratoire ou du ruban isolant sur les bords de la place pour lier les bords non plié. Cela cimente les côtés et protège contre les coupures d’arêtes vives.</li>
		<li>Percer un trou dans le centre de la place à l’aide d’une aiguille de 26 calibre.</li>
		<li>Supprimer la grosse vis sur le cap de la sphère d’intégration et couvrir l’ouverture avec le diaphragme. Recouvrir le trou au centre. Si la membrane a été créée avec une lumière absorbante et une lumière réfléchie côté, placer la lumière absorbant côté vers le haut et la lumière réfléchie vers le bas, vers l’intérieur de la sphère d’intégration. 
		Remarque : Pour empêcher la poussière et les débris de pénétrer dans la sphère d’intégration et pour garder le trou centré, fixer le diaphragme à l’extérieur de la sphère d’intégration avec du ruban adhésif lab.</li>
	</ol></li> <li>Mesure lumière sortie le long de la pointe par incréments de 500 µm à l’aide d’un micromanipulateur ou un bras et une sphère d’Ulbricht. 
	Remarque : Lunettes de protection de la longueur d’onde appropriée devraient être portés à chaque fois que le laser est sur.
	<ol><li>Reliez l’autre extrémité de la fibre à un laser ou une lumière source, mais ne déclenchent pas de lumière de sortie encore.</li>
		<li>Garantir l’illuminateur à un titulaire stéréotaxique (prefeRahab avec du ruban adhésif lab) avec la pointe 7-10 mm au dessous du fond du support à.</li>
		<li>Vis du support stéréotaxique dans l’ARM stéréotaxiques.</li>
		<li>Alignez la pointe de l’illuminateur avec le trou dans le centre du diaphragme. Zéro le micromanipulateur lorsque la pointe est au même niveau que le diaphragme exact.</li>
		<li>Tourner à éteindre les lumières de la pièce et la sphère d’intégration à zéro.</li>
		<li>Déclencher le laser (ou autre source lumineuse) et mesurer la puissance lumineuse totale de sortie à l’aide de la sphère d’intégration. 
		Remarque : Utilisez la sortie de lumière le plus bas possible pour les essais d’étalonnage.</li>
		<li>Abaisser la fibre 500 µm dans l’intégration sphère et répéter étape 2.2.6.</li>
		<li>Continuer à abaisser la fibre dans la sphère d’intégration et puissance lumineuse totale 500 µm par incréments de mesure jusqu'à ce que les niveaux de puissance lumineuse totale OFF. 
		Mise en garde : Puissance lumineuse totale doit se stabiliser lorsque la pointe entière est dans le domaine. Ne continuez pas à abaisser la fibre plus de 1-2 mm par rapport à la gravé Astuce longueur. Si la pointe touche la partie inférieure de la sphère d’intégration, il peut faire fondre ou ruiner la sphère d’intégration.</li>
	</ol></li> <li>Confirmer une fibre uniformément gravée en traçant la puissance lumineuse totale de sortie comme une fonction de dans quelle mesure la fibre a été abaissée dans la sphère d’intégration pour confirmer la linéarité.</li></ol>
 3. in Vivo de l’Illumination
 Remarque : ici, ces méthodes sont indiquées à l’aide d’un modèle en plastique plutôt qu’un primate non-humain.
<ol><li>Implant une chambre d’enregistrement de 25 mm de diamètre a été implantée sur la zone de cerveau d’intérêt avant expérimentation.</li>
	<li>Exécuter anatomique imagerie de résonance magnétique (IRM) avant l’expérimentation. Placer une grille d’enregistrement personnalisé dans la chambre et le remplir avec un lubrifiant chirurgical stérile permettant de la visualisation de la grille et la détermination du niveau des structures cérébrales dura et cible.</li>
	<li>Préparer un tour micro-disque avant chaque séance de test.
	<ol><li>Affixe serre-un tube de guidage de 25 calibre avec pointe biseautée au milieu et en bas sur le disque. Deux pinces servent à s’assurer que le tube de guidage reste droit. Deux de ces colliers peuvent être déplacés manuellement si vous le souhaitez. 
		Remarque : Le tube de guidage peut être époxy ou soudé au bornier.</li>
		<li>Fixer l’illuminateur de grand volume dans la bride du haut sur le même lecteur. Cette pince est attachée à la motorisation.</li>
		<li>Visser l’illuminateur de grand volume à travers le tube de guidage complétement et confirmer que la pointe de l’illuminateur s’étend au-delà de l’extrémité de la gaine. 
		Remarque : La longueur de l’illuminateur qui va passé l’extrémité de la gaine est égale à la distance entre la dure-mère et la marge inférieure de la région cible du cerveau, comme déterminé par MRI.</li>
		<li>Faire tremper le tube de guidage et illuminateur dans une solution antiseptique (p. ex., chlorhexidine) pour stériliser.</li>
	</ol></li> <li>, Placer une grille personnalisée stérilisée à l’intérieur de la chambre propre et attachez une orientation pré-spécifié avec une vis sur le côté de la chambre. La grille ci-contre a espacement 1 mm ; Toutefois, l’espacement peut être personnalisé selon les besoins. 
	Remarque : Cela devrait être identique à la grille et l’orientation utilisée dans l’IRM anatomique.</li>
	<li>Fixer le support de micro-lecteur stéréotaxique sur la chambre d’enregistrement dans une orientation pré-déterminé.</li>
	<li>Se rétracter l’illuminateur stérilisé de la gaine en tirant l’illuminateur à l’aide de la pince stérile et arrondi. La pointe de l’illuminateur est 5 à 10 mm au-dessus de l’extrémité du tube de guidage. 
	Remarque : L’illuminateur incline vers l’extérieur entre le tube de guidage et la bride. Cela n’endommagera pas l’illuminateur flexible.</li>
	<li>Fixer le micro-drive au titulaire et placer le tube de guidage dans le trou de grille cible.</li>
	<li>Abaisser la scène micro-lecteur jusqu'à ce que le tube de guidage est juste à travers le niveau de la dure-mère. 
	Remarque : Si vous le souhaitez, un second micro-disque avec une électrode peut être placé sur la scène et plongé dans un trou de grille différente. Le champ local potentiel sur cette électrode montrera un artefact léger dépendant de la distance, qui peut être utilisé pour confirmer le placement illuminateur.</li>
	<li>Essayez la bas l’illuminateur manuellement avec une pince stérile.
	<ol><li>Si il n’y a aucune résistance, rétracter l’illuminateur 5 - 10 mm, attendre 10 min pour permettre le tissu pour s’installer, puis réessayez.</li>
		<li>S’il y a encore la résistance à la deuxième tentative, rentrer la pointe de l’illuminateur dans le tube-guide, plus bas le guide tube 0,25 mm, puis réessayez.</li>
		<li>Répéter jusqu'à ce que la glisse illuminateur à travers le tube de guidage sans aucune résistance.</li>
		<li>Abaisser l’illuminateur jusqu'à ce qu’elle est bien tendue. 
		Mise en garde : Ne pas pousser l’illuminateur avec force contre résistance. Dans ces cas le tube de guidage généralement n'a pas pénétré la dure-mère entièrement. En poussant la fibre avec force les fera plier sur lui-même, empêchant les fibres de pénétrer dans le cerveau et éventuellement détruire la pointe ( Figure 1 g).</li>
	</ol></li> <li>Connectez l’embout à l’autre bout de l’illuminateur à l’agrandissement optique mis en place ou le laser.</li>
	<li>Veiller à ce qu’aucune lumière n’est visible par les primates non humains.
	<ol><li>Utiliser occultants blindage ou lumière absorbant aluminium pour entièrement couvrir les tours enregistrement.</li>
		<li>Placer toutes les connexions optiques dans des enveloppes blindés faits de la lumière absorbant clinquant.</li>
		<li>Protéger tous les câbles de raccordement soit lumière absorbant la feuille ou du ruban isolant noir.</li>
		<li>Comme une précaution supplémentaire, placez une banque de diodes électroluminescentes (LED) de leurre de la même couleur de lumière utilisée pour l’expérience derrière le primate non-humain et clignoter les LED en permanence à 2,5 Hz. Cela empêche les yeux de réglage entièrement à l’obscurité. S’il y avait une fuite légère par inadvertance, cette lumière clignotante contribuerait à prévenir la fuite comme un déclencheur comportemental.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Alors que les outils d’optogenetic sont largement utilisés pour étudier la maladie et la physiologie chez les rongeurs, le défi technique de volumes de gros cerveau éclairante a limité l’utilisation des optogenetics chez les primates non humains. Pionnier des études chez le singe utilisé des densités de grande puissance lumineuse (~ 100 mW/mm2 à 20 L/mm2) pour illuminer de petits volumes, peut-être &#60; 1 mm3et effets comportements modestes rapportés avec excitateurs opsines dans le cort...

Optogenetic outils, qui permettent un contrôle neuronal milliseconde-précis et axée sur la lumière sont largement utilisés pour étudier la physiologie fonctionnelle et le comportement des rongeurs et des invertébrés. Toutefois, des défis techniques ont limité l’utilisation d’optogenetics dans le cerveau de primate non humain, qui a un volume ~ 100 x plus grand que le cerveau de rongeurs 1.
Pour faciliter les études d’optogenetics chez les primates non humains, enlumineur a été conçu pour répondre à deux objectifs contradictoires : illumination de grand volume et dommages de pénétration minimale. Les tentatives précédentes pour relever l’un de ces préoccupations sont venus à la coûteuse de l’autre. Faisceaux de fibres s’allument plus grands volumes mais avec diamètre augmenté et, par conséquent, dommages2,3. Fibre de verre coniques réduire les dommages de pénétration, mais étroitement mise au point de lumière émettant des surfaces &#60; 100 µm2 4,5. Illumination de cerveau externe à travers une vitre dans la dure-mère contourne le défi des dommages de la pénétration et peut permettre pour l’éclairage de volume important, mais il seulement peut être utilisé pour quelques de zones cérébrales superficielles6.
Pour créer un illuminateur de grand volume, petit diamètre (Figure 1 a), la pointe d’un plastique optique fibre est conique de la chaleur et le noyau et le revêtement sont gravés (Figure 1 bc). Contrairement à d’autres fibres coniques qui se concentrent la lumière à un point précis, la gravure permet à la lumière de s’échapper uniformément sur les côtés de la pointe, ainsi, distribuer la lumière largement sur une grande surface (Figure 1 de). Parce que les dommages de pénétration sont proportionnel au diamètre de la pénétration, ce projecteur a aucun dommage de pénétration plus qu’une fibre conventionnelle, pourtant, il a &#62; 100 x la lumière émettant une lumière de zone et livre surface plus large avec 1/100e la puissance lumineuse densité dans un cerveau fantôme (1,75 % d’agarose) (Figure 1e). Un modèle Monte Carlo (Figure 1f) illustre la différence dans la propagation de lumière entre une fibre conventionnelle et l’illuminateur de grand volume lorsqu’ils ont des densités de puissance lumineuse égale comme leur éclairantes. Chaque projecteur est calibré individuellement à l’aide d’une sphère d’Ulbricht (Figure 2 a, b) pour assurer la distribution même la lumière le long de la pointe (Figure 2c).
Ce projecteur grand volume a été validé avec optogenetic manipulation du comportement et de décharge neuronale chez les primates non humains. La longueur de pointe de fibre peut-être être personnalisée à une zone du cerveau et au mappage de champ réceptif individuels de chaque animal. L’illuminateur peut être couplé avec une électrode pénétrante pour les enregistrements neuronales qui s’étendent sur la durée de l’éclairement. En outre, parce que la fibre peut porter n’importe quelle couleur de la lumière visible, il peut être couplé avec n’importe lequel des molécules disponibles optogenetic disponibles.

<table><tbody><tr><td>Fibre optique en plastique</td><td>Fibre optique industrielle</td><td>SK-10</td><td>250 microns de diamètre, ligne Super Eska</td></tr><tr><td>Dénudeuse</td><td>Klein Tools</td><td>11047</td><td>Pince</td></tr><tr><td>d’étau</td> de calibre 22 <td>Wilton</td><td>11104</td><td>Pince d’étau générique pour montage sur table</td></tr><tr><td>Pistolet thermique à double température</td><td>Milwaukee</td><td>8975-6</td><td>570 / 1 000 &deg ; F</td></tr><tr><td>Marqueur de laboratoire</td><td>VWR</td><td>52877</td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>VistaVision</td><td>82027-156</td><td>Stéréomicroscope avec double lumière incandescente, grossissement 2X/4X, disponible chez VWR</td></tr><tr><td>Ruban de laboratoire</td><td>VWR</td><td>89097-972</td><td>Paquet de 4 de couleur violette ; cependant, la couleur du ruban n’a pas d’importance</td></tr><tr><td>Feuille de rodage en carbure de silicium</td><td>ThorLabs</td><td>LF5P</td><td>grain de 5 microns, paquet de 10</td></tr><tr><td>Feuille de rodage en oxyde d’aluminium</td><td>ThorLabs</td><td>LF3P</td><td>grain 3 microns, paquet de 10</td></tr><tr><td>Feuille de rodage en oxyde d’aluminium</td><td>ThorLabs</td><td>LF1P</td><td>grain 1 micron, paquet de 10</td></tr><tr><td>Feuille de rodage en alumine calcinée</td><td>ThorLabs</td><td>LF03P</td><td>grain 0,3 micron, paquet de 10</td></tr><tr><td>Couteau chaud</td><td>Fibre optique industrielle</td><td>IF370012</td><td>60 Watt, portée</td></tr> <tr><td></td><td>d’inspection de la fibre robusteThorLabs</td><td>FS201</td><td>en option</td></tr><tr><td>Virole en acier inoxydable</td><td>Fibre optique de précision</td><td>MM-FER2003SS-265</td> Seringue de <td>265 microns de diamètre intérieur</td></tr><tr><td>de 1 mL</td><td>BD</td><td>14-823-30</td><td>L’embout Luer-lok est préférable pour réduire le risque de fuite, mais n’est pas strictement nécessaire</td></tr><tr><td>Époxy plastique</td><td>Fibre optique industrielle</td><td>40 0005</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille émoussée de calibre 18</td><td>BD</td><td>305180</td><td>Lingette non pelucheuse de 1,5 pouce</td></tr><tr><td>de longueur (KimWipe)</td><td>ThorLabs</td><td>KW32</td><td>disponible auprès de nombreux fournisseurs</td></tr><tr><td>Feuille absorbante légère</td><td>ThorLabs</td><td>BKF12</td><td></td></tr><tr><td>Ruban isolant</td><td>3M</td><td>Temflex 1700</td><td>En option, peut remplacer d’autres marques / modèles</td></tr><tr><td>Aiguille pointue de calibre 26&nbsp ;</td><td>BD</td><td>305111</td><td>d’une longueur de 0,5 pouce</td></tr><tr><td>Le micromanipulateur</td><td>Siskiyou</td><td>70750000E</td><td>peut remplacer d’autres marques/modèles</td></tr><tr><td>Le bras stérétactique</td><td>Kopf</td><td>1460</td><td>peut remplacer d’autres marques/modèles</td></tr><tr><td>Lunettes de sécurité laser</td><td>KenTeK</td><td>KCM-6012</td><td>doit être sélectionné en fonction de la couleur du laser utilisé, exemple donné ici</td></tr><tr><td>Laser ou autre source lumineuse</td><td>vortran</td><td>Stradus 473-50</td><td>exemple de laser bleu</td></tr><tr><td>Sphère d’intégration</td><td>ThorLabs</td><td>S142C</td><td>Capteur de puissance attaché, également disponible chez ThorLabs, article #PM100D</td></tr><tr><td>Chambre d’enregistrement Ultem Instrument</td><td>Crist entreprise</td><td>6-ICO-J0</td><td>Personnalisé avec encoche d’alignement</td></tr><tr><td>Micro-entraînement tour avec pinces</td><td>NAN</td><td>DRTBL-CMS</td><td></td></tr><tr><td>Tube de guidage Personnalisé</td><td></td><td>N/A</td><td>Fabriqué à partir d’une aiguille spinale (BD) de calibre 25 ou d’un tube émoussé</td></tr><tr><td>Système d’entraînement NAN</td><td>NAN</td><td>NANDrive</td><td></td></tr><tr><td>Conception de grille personnalisée</td><td></td> Plans <td>personnalisés</td><td>disponibles sur demande</td></tr><tr><td>Pince émoussée</td><td>FischerScientific</td><td>08-875-8A</td><td>Pince émoussée générique en acier inoxydable</td></tr><tr><td>Étriers numériques</td><td>Neiko</td><td>01407A</td><td>Disponible sur amazon.com. Sélectionner, s’il y a lieu, un pied à coulisse de résolution plus fine pour des mesures plus précises.</td></tr><tr><td>Câble de raccordement</td><td>ThorLabs</td><td>FG200LCC-custom</td><td>Ceci est un exemple de nombreux câbles de raccordement possibles. Tant que le diamètre de la fibre est inférieur ou égal au diamètre de la fibre de l’illuminateur grand volume et tant que les connecteurs s’interfacent, tout câble de raccordement (en verre ou en plastique, acheté par le vendeur ou fabriqué en laboratoire) convient à cette application.</td></tr><tr><td>Capuchons anti-poussière en plastique transparent</td><td>ThorLabs</td><td>CAPF</td><td>Paquet de 25</td></tr><tr><td>manchons d’accouplement fendus en céramique</td><td>Precision Fiber Products, Inc.</td><td>SM-CS1140S</td><td></td></tr></tbody></table>

grand volume, éclairage pertinent sur le plan comportemental pour optogenetics chez les primates non humains

Large Volume, Behaviorally-relevant Illumination for Optogenetics in Non-human Primates

Ce protocole décrit un illuminateur de grand volume, qui a été développé pour des manipulations d’optogenetic dans le cerveau de primate non humain. L’illuminateur est une fibre optique à mis à jour le plastique avec embout gravé, tels que la superficie d’émettant de la lumière est &#62; 100 fois celui d’une fibre conventionnelle. En plus de décrire la construction de l’illuminateur de grand volume, ce protocole détaille l’étalonnage de contrôle de la qualité utilisé pour assurer la distribution même la lumière. De plus, ce protocole décrit des techniques pour insérer et retirer l’illuminateur de grand volume. Les structures superficielles et profondes peuvent être éclairés. Ce projecteur grand volume n’a pas besoin d’être physiquement couplée à une électrode, et parce que l’éclairage est fait de plastique, pas de verre, il se pliera simplement dans des circonstances, lorsque des fibres optiques traditionnelles serait briser. Car cet illuminateur distribue la lumière sur les volumes de tissus pertinents sur le plan comportemental (≈ 10 mm3) sans dommage de pénétration supérieure à une fibre optique conventionnelle, il facilite les études comportementales chez les primates non humains à l’aide d’optogenetics.

L’éclairage des volumes de gros cerveau chez les primates non humains permet pour une manipulation optogenetic pertinentes sur le plan comportemental. Acker et al. (2016) utilisé cette illuminateur de grand volume avec le Halorhodopsin décalée vers le rouge, Jaws 7 pour étudier la contribution temporelle du champ œil frontal (FEF) pour mémoire guidée par saccades dans deux singes rhésus. Plus précisément, les neurones FEF ont été injectés avec un vecteur viral contenant des mâchoires et p...

Un protocole pour construire un illuminateur pénétration tissulaire pour fournir la lumière au-dessus de grands volumes dont le diamètre minimal est présenté.

Grand Volume, éclairage pertinent sur le plan comportemental pour Optogenetics chez les Primates Non humains

This protocol describes a large-volume illuminator, which was developed for optogenetic manipulations in the non-human primate brain. The illuminator is a ...

L’objectif global de ce protocole est de créer un illuminateur de tissu de grand volume qui est bien adapté aux manipulations optogénétiques chez les primates non humains. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que comment les populations de neurones dans les différentes régions du cerveau contribuent-elles au comportement, et comment des modèles de décharge neuronale temporellement spécifiques dans une région peuvent-ils affecter une autre région ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise la lumière et permet ainsi la manipulation optogénétique de grands volumes cérébraux pertinents sur le plan comportemental avec un minimum de dommages tissulaires.Les implications de cette technique s’étendent à la médecine translationnelle en raison des similitudes entre les cerveaux des primates humains et non humains. En général, les personnes qui débutent dans cette méthode auront du mal car il faut un peu de pratique pour appliquer la bonne quantité de pression lors de la traction de ces fibres. Pour commencer cette procédure, utilisez une paire de cisailles tranchantes pour couper une section de fibre optique en plastique de 250 micromètres de diamètre qui est au moins 10 centimètres plus longue que la longueur totale souhaitée de l’illuminateur.Ensuite, retirez 15 à 20 centimètres de gaine en polyéthylène d’une extrémité de la fibre optique en plastique à l’aide d’une pince à dénuder de calibre 22. Ensuite, fixez les trois à cinq centimètres les plus distaux de l’extrémité dénudée de la fibre dans une pince à étau de table. Tenez l’extrémité gainée de la fibre tendue d’une main, avec une traction constante et régulière.La fibre doit être parallèle au sol, retirée de l’étau. Maintenez cette tension constante sur la fibre tout au long du chauffage et du refroidissement, de sorte que la fibre reste droite et tendue à mesure qu’elle s’amincit. À l’aide du réglage le plus bas d’un pistolet thermique à double température, chauffez la partie dénudée de la fibre jusqu’à ce qu’elle soit amincie à un diamètre de 60 à 100 micromètres, soit environ le diamètre d’un cheveu humain.Maintenez la tension constante sur la fibre tout en la laissant refroidir. Le fait de ne pas maintenir la tension ou la surchauffe de la fibre peut entraîner une courbure et/ou une rupture de la fibre. Pour aider à maintenir une tension constante sur la fibre pendant que vous la chauffez, utilisez votre main non dominante afin de ne pas avoir à lâcher prise lorsque vous utilisez le pistolet thermique.De plus, vous pouvez enrouler doucement la fibre autour de votre paume pour obtenir une prise encore meilleure. Une fois que la fibre a complètement refroidi et que le diamètre souhaité a été atteint, pincez la fibre à trois centimètres du point le plus étroit des deux côtés. Avec une traction rapide et nette le long de l’axe de la fibre, séparez les côtés pour créer une pointe effilée.Ensuite, examinez l’extrémité effilée à faible puissance sous un microscope de dissection. Si la pointe est fourchue ou enroulée, jetez la fibre. Même avec beaucoup de pratique, environ un tiers des fibres auront des pointes fourchues ou recourbées.Nous nous débarrassons simplement de ces fibres plutôt que d’essayer de les réparer, car il est si rapide et peu coûteux d’en tirer une autre. Préparez la gravure de la pointe effilée en plaçant un morceau de ruban adhésif de laboratoire près de l’extrémité de la pointe, en laissant la longueur de pointe souhaitée exposée. Ici, les cinq derniers millimètres sont exposés.Le ruban protège la fibre de la gravure au-delà de la longueur souhaitée d’émission de lumière. Après cela, pliez un petit carré de feuille de rodage en carbure de silicium de cinq micromètres entre le pouce et l’index. Placez la pointe de la fibre entre les deux côtés de la feuille de rodage et gravez doucement la fibre à l’aide de petits mouvements circulaires.Faites pivoter fréquemment la fibre de manière à ce que tous les côtés soient gravés uniformément. Ensuite, retirez environ cinq millimètres de la gaine en polyéthylène de l’extrémité opposée de l’illuminateur à l’aide d’une pince à dénuder de calibre 22. Ensuite, coupez l’extrémité opposée à plat avec un couteau chaud pour lisser la surface.Fixez un connecteur à l’extrémité de l’illuminateur à l’opposé de la pointe gravée. Cela permet à l’illuminateur de se connecter à un câble optique ou à un laser. Ensuite, polissez l’extrémité opposée à plat avec des feuilles de rodage de plus en plus fines.Par la suite, insérez l’extrémité opposée plate dans une virole en acier inoxydable de 260 micromètres de diamètre intérieur jusqu’à ce qu’elle affleure l’extrémité de la virole. Confirmez visuellement que l’extrémité opposée est polie en douceur et uniformément à l’aide d’un microscope à fibre. Collez la virole verticalement sur le bord de la table avec la plus petite ouverture de la virole pointant vers le bas.Ensuite, remplissez une seringue d’un millilitre d’époxy plastique et fixez une aiguille émoussée de calibre 18 à la seringue. Ensuite, utilisez l’aiguille pour appliquer de l’époxy dans la virole. Remplissez complètement la virole d’époxy.Insérez la fibre dans la virole de manière à ce qu’elle affleure le bas de la virole. Si nécessaire, essuyez tout excès d’époxy de la surface polie de la fibre avec une lingette humide non pelucheuse avant le séchage. Dans cette étape, préparez un microdisque tour avant chaque session de test.Fixez ensuite un tube de guidage de calibre 25 avec une pointe biseautée sur la pince inférieure de l’entraînement. Fixez l’illuminateur de grand volume dans la pince supérieure du même entraînement. Cette pince est fixée au moteur d’entraînement.Ensuite, enfilez complètement l’illuminateur de grand volume dans le tube de guidage et vérifiez que la pointe de l’illuminateur dépasse de la pointe du tube de guidage. Alternativement, du ruban de laboratoire peut être appliqué sur la fibre afin que le ruban, plutôt que la fibre elle-même, soit serré, pour protéger la fibre. Ensuite, trempez le tube de guidage et l’illuminateur dans une solution antiseptique pour la stérilisation.Placez une grille stérilisée personnalisée avec un espacement d’un millimètre à l’intérieur de la chambre blanche et fixez-la à une orientation prédéfinie avec la vis sur le côté de la chambre. Rétractez l’illuminateur stérilisé du tube de guidage en tirant l’illuminateur vers le haut à l’aide d’une pince émoussée stérile. La pointe de l’illuminateur doit être de cinq à 10 millimètres au-dessus de la pointe du tube de guidage.Fixez le microdisque au support et placez le tube de guidage dans le trou de la grille cible. Ensuite, abaissez l’étage du micro-entraînement jusqu’à ce que le tube de guidage passe juste au niveau de la dure-mère. Dans le même temps, abaissez l’illuminateur manuellement avec une pince stérile.S’il y a une résistance, rétractez l’illuminateur de cinq à 10 millimètres, attendez 10 minutes et réessayez. S’il y a encore de la résistance lors de la deuxième tentative, rétractez l’embout de l’illuminateur dans le tube de guidage, abaissez le tube de guidage de 0,25 millimètre et réessayez. Connectez la virole à l’autre extrémité de l’illuminateur à la configuration optique plus grande ou au laser.Cette figure montre que les taux d’erreur augmentent considérablement avec l’éclairage. Et les graphiques matriciels montrent ici l’inhibition des neurones couvrant les 2,5 millimètres d’épaisseur du cortex. Et le potentiel de champ local montrant l’artefact lumineux s’étendant sur 4,5 millimètres.Une fois maîtrisé, un illuminateur de grand volume peut être construit à l’aide de cette technique en 10 à 15 minutes, plus le temps de séchage de l’époxy. L’étalonnage ajoute environ une demi-heure supplémentaire, donc pour maximiser l’efficacité, nous fabriquons généralement plusieurs illuminateurs à la fois. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que de nombreux illuminateurs ne répondront pas aux normes de contrôle de la qualité.Ce n’est pas grave. S’ils échouent à l’inspection des pointes, nous les jetons. Mais s’ils échouent à l’étalonnage, nous les repolissons généralement et répétons l’étalonnage.Après son développement, cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine des neurosciences d’utiliser l’optogénétique pour supprimer l’activation neuronale et moduler le comportement chez les primates non humains. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la construction d’un illuminateur de tissus de grand volume.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Behavior

Comportement

Neurones adultes-né du bulbe olfactif peut être contrôlé à l'aide optogenetically Channelrhodopsin2 exprimant l'injection lentiviral dans le flux migratoire et rostrale photostimulation chronique avec une miniature implanté à LED.

Sélective transduction virale des adultes-né pour les neurones olfactifs chronique In vivo Stimulation optogénétique

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