Grand Volume, éclairage pertinent sur le plan comportemental pour Optogenetics chez les Primates Non humains

L’objectif global de ce protocole est de créer un illuminateur de tissu de grand volume qui est bien adapté aux manipulations optogénétiques chez les primates non humains. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que comment les populations de neurones dans les différentes régions du cerveau contribuent-elles au comportement, et comment des modèles de décharge neuronale temporellement spécifiques dans une région peuvent-ils affecter une autre région ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise la lumière et permet ainsi la manipulation optogénétique de grands volumes cérébraux pertinents sur le plan comportemental avec un minimum de dommages tissulaires.

Les implications de cette technique s’étendent à la médecine translationnelle en raison des similitudes entre les cerveaux des primates humains et non humains. En général, les personnes qui débutent dans cette méthode auront du mal car il faut un peu de pratique pour appliquer la bonne quantité de pression lors de la traction de ces fibres. Pour commencer cette procédure, utilisez une paire de cisailles tranchantes pour couper une section de fibre optique en plastique de 250 micromètres de diamètre qui est au moins 10 centimètres plus longue que la longueur totale souhaitée de l’illuminateur.

Ensuite, retirez 15 à 20 centimètres de gaine en polyéthylène d’une extrémité de la fibre optique en plastique à l’aide d’une pince à dénuder de calibre 22. Ensuite, fixez les trois à cinq centimètres les plus distaux de l’extrémité dénudée de la fibre dans une pince à étau de table. Tenez l’extrémité gainée de la fibre tendue d’une main, avec une traction constante et régulière.

La fibre doit être parallèle au sol, retirée de l’étau. Maintenez cette tension constante sur la fibre tout au long du chauffage et du refroidissement, de sorte que la fibre reste droite et tendue à mesure qu’elle s’amincit. À l’aide du réglage le plus bas d’un pistolet thermique à double température, chauffez la partie dénudée de la fibre jusqu’à ce qu’elle soit amincie à un diamètre de 60 à 100 micromètres, soit environ le diamètre d’un cheveu humain.

Maintenez la tension constante sur la fibre tout en la laissant refroidir. Le fait de ne pas maintenir la tension ou la surchauffe de la fibre peut entraîner une courbure et/ou une rupture de la fibre. Pour aider à maintenir une tension constante sur la fibre pendant que vous la chauffez, utilisez votre main non dominante afin de ne pas avoir à lâcher prise lorsque vous utilisez le pistolet thermique.

De plus, vous pouvez enrouler doucement la fibre autour de votre paume pour obtenir une prise encore meilleure. Une fois que la fibre a complètement refroidi et que le diamètre souhaité a été atteint, pincez la fibre à trois centimètres du point le plus étroit des deux côtés. Avec une traction rapide et nette le long de l’axe de la fibre, séparez les côtés pour créer une pointe effilée.

Ensuite, examinez l’extrémité effilée à faible puissance sous un microscope de dissection. Si la pointe est fourchue ou enroulée, jetez la fibre. Même avec beaucoup de pratique, environ un tiers des fibres auront des pointes fourchues ou recourbées.

Nous nous débarrassons simplement de ces fibres plutôt que d’essayer de les réparer, car il est si rapide et peu coûteux d’en tirer une autre. Préparez la gravure de la pointe effilée en plaçant un morceau de ruban adhésif de laboratoire près de l’extrémité de la pointe, en laissant la longueur de pointe souhaitée exposée. Ici, les cinq derniers millimètres sont exposés.

Le ruban protège la fibre de la gravure au-delà de la longueur souhaitée d’émission de lumière. Après cela, pliez un petit carré de feuille de rodage en carbure de silicium de cinq micromètres entre le pouce et l’index. Placez la pointe de la fibre entre les deux côtés de la feuille de rodage et gravez doucement la fibre à l’aide de petits mouvements circulaires.

Faites pivoter fréquemment la fibre de manière à ce que tous les côtés soient gravés uniformément. Ensuite, retirez environ cinq millimètres de la gaine en polyéthylène de l’extrémité opposée de l’illuminateur à l’aide d’une pince à dénuder de calibre 22. Ensuite, coupez l’extrémité opposée à plat avec un couteau chaud pour lisser la surface.

Fixez un connecteur à l’extrémité de l’illuminateur à l’opposé de la pointe gravée. Cela permet à l’illuminateur de se connecter à un câble optique ou à un laser. Ensuite, polissez l’extrémité opposée à plat avec des feuilles de rodage de plus en plus fines.

Par la suite, insérez l’extrémité opposée plate dans une virole en acier inoxydable de 260 micromètres de diamètre intérieur jusqu’à ce qu’elle affleure l’extrémité de la virole. Confirmez visuellement que l’extrémité opposée est polie en douceur et uniformément à l’aide d’un microscope à fibre. Collez la virole verticalement sur le bord de la table avec la plus petite ouverture de la virole pointant vers le bas.

Ensuite, remplissez une seringue d’un millilitre d’époxy plastique et fixez une aiguille émoussée de calibre 18 à la seringue. Ensuite, utilisez l’aiguille pour appliquer de l’époxy dans la virole. Remplissez complètement la virole d’époxy.

Insérez la fibre dans la virole de manière à ce qu’elle affleure le bas de la virole. Si nécessaire, essuyez tout excès d’époxy de la surface polie de la fibre avec une lingette humide non pelucheuse avant le séchage. Dans cette étape, préparez un microdisque tour avant chaque session de test.

Fixez ensuite un tube de guidage de calibre 25 avec une pointe biseautée sur la pince inférieure de l’entraînement. Fixez l’illuminateur de grand volume dans la pince supérieure du même entraînement. Cette pince est fixée au moteur d’entraînement.

Ensuite, enfilez complètement l’illuminateur de grand volume dans le tube de guidage et vérifiez que la pointe de l’illuminateur dépasse de la pointe du tube de guidage. Alternativement, du ruban de laboratoire peut être appliqué sur la fibre afin que le ruban, plutôt que la fibre elle-même, soit serré, pour protéger la fibre. Ensuite, trempez le tube de guidage et l’illuminateur dans une solution antiseptique pour la stérilisation.

Placez une grille stérilisée personnalisée avec un espacement d’un millimètre à l’intérieur de la chambre blanche et fixez-la à une orientation prédéfinie avec la vis sur le côté de la chambre. Rétractez l’illuminateur stérilisé du tube de guidage en tirant l’illuminateur vers le haut à l’aide d’une pince émoussée stérile. La pointe de l’illuminateur doit être de cinq à 10 millimètres au-dessus de la pointe du tube de guidage.

Fixez le microdisque au support et placez le tube de guidage dans le trou de la grille cible. Ensuite, abaissez l’étage du micro-entraînement jusqu’à ce que le tube de guidage passe juste au niveau de la dure-mère. Dans le même temps, abaissez l’illuminateur manuellement avec une pince stérile.

S’il y a une résistance, rétractez l’illuminateur de cinq à 10 millimètres, attendez 10 minutes et réessayez. S’il y a encore de la résistance lors de la deuxième tentative, rétractez l’embout de l’illuminateur dans le tube de guidage, abaissez le tube de guidage de 0,25 millimètre et réessayez. Connectez la virole à l’autre extrémité de l’illuminateur à la configuration optique plus grande ou au laser.

Cette figure montre que les taux d’erreur augmentent considérablement avec l’éclairage. Et les graphiques matriciels montrent ici l’inhibition des neurones couvrant les 2,5 millimètres d’épaisseur du cortex. Et le potentiel de champ local montrant l’artefact lumineux s’étendant sur 4,5 millimètres.

Une fois maîtrisé, un illuminateur de grand volume peut être construit à l’aide de cette technique en 10 à 15 minutes, plus le temps de séchage de l’époxy. L’étalonnage ajoute environ une demi-heure supplémentaire, donc pour maximiser l’efficacité, nous fabriquons généralement plusieurs illuminateurs à la fois. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que de nombreux illuminateurs ne répondront pas aux normes de contrôle de la qualité.

Ce n’est pas grave. S’ils échouent à l’inspection des pointes, nous les jetons. Mais s’ils échouent à l’étalonnage, nous les repolissons généralement et répétons l’étalonnage.

Après son développement, cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine des neurosciences d’utiliser l’optogénétique pour supprimer l’activation neuronale et moduler le comportement chez les primates non humains. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la construction d’un illuminateur de tissus de grand volume.