Recherche fondamentale en médecine Plasma - une approche de débit des liquides aux cellules

L’objectif global de ces tests de séquençage multipuits est de mieux comprendre les effets du plasma physique froid sur les oxydants, sur les réponses biologiques in vitro, en utilisant la spectroscopie d’émissions optiques, l’analyse liquide et l’activité cellulaire, la microscopie et les tests de cytométrie en flux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la médecine du plasma, en particulier en ce qui concerne les espèces directives dérivées du plasma, importantes pour l’induction de la mort immunogène des cellules cancéreuses. Le principal avantage de cette technique est son approche semi-automatisée.

Il utilise 96 plaques de puits, pour augmenter la vitesse et la productivité de la recherche. Les implications de cette technique s’étendent aux futures thérapies plasmatiques, comme en dermatologie ou en oncologie. Et, comme ils fournissent les moyens d’identifier les espèces directives dérivées du plasma, qui sont pertinentes pour les réponses biologiques.

Felix Niessner, un technicien de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour la surveillance des espèces de plasma, positionnez un jet de plasma atmosphérique devant un spectrophotomètre d’émissions optiques, perpendiculaire à l’axe du panache, et utilisez le logiciel dédié pour enregistrer la photoémission et la longueur d’onde de chaque condition de gaz, à deux litres standard par minute de flux de gaz d’alimentation. Pour l’analyse des superoxydes traités au plasma, établissez un protocole final pour la table XYZ, avec les temps de traitement respectifs et les positions de puits appropriés.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de mélange maître fraîchement préparé dans les puits d’une plaque claire à fond plat à 96 puits en trois exemplaires, et utilisez un lecteur de micro-plaques, pour mesurer l’absorbance à 550 nanomètres. Pour analyser les effets du traitement au plasma sur les réponses métaboliques cellulaires, dans une hotte à flux laminaire, ensemencez une fois 10 aux quatre cellules d’intérêt dans 100 microlitres de milieu de culture cellulaire entièrement supplémenté, par puits, dans une plaque à fond plat de 96 puits, et incubez pendant la nuit. Après une culture d’une nuit dans un incubateur de culture cellulaire, utilisez la table XYZ pour traiter les puits avec du plasma ou du gaz seul, selon l’analyse expérimentale, et retournez les cellules dans l’incubateur pendant encore 20 heures.

À la fin de la deuxième incubation, ajoutez 25 microlitres de milieu de culture cellulaire frais, complété par 500 micromolaires de résazurine aux cellules, ainsi qu’aux trois puits de contrôle de fond de résazurine uniquement. Retournez les cellules dans l’incubateur, pour une incubation de trois heures. Ensuite, mesurez la fluorescence dans un lecteur de microplaques.

Pour l’imagerie des cellules traitées au plasma, après lecture de la fluorescence, remplacer les surnageants par 100 microlitres de milieu de culture cellulaire frais, complété par un microgramme par millilitre d’iodure de propidium. Placez la plaque sur une platine de microscope motorisée, et sélectionnez l’objectif 20x pour imager les cellules. Ensuite, utilisez le logiciel d’analyse d’images quantitatives approprié pour déterminer la zone cytosolique totale dans les images numériques à contraste de phase, de tous les champs de vision imagés dans chaque puits.

Pour l’analyse cytométrique en flux des cellules traitées au plasma, après l’imagerie, laver les cellules de chaque puits deux fois avec 200 microlitres de PBS, complété par du calcium et du magnésium par lavage, suivi d’un marquage, avec 15 anagrammes par millilitre d’anticorps monoclonal anti-calréticuline de souris, dans 50 microlitres de PBS, plus du calcium et du magnésium par puits. Après 15 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire, lavez les cellules deux fois avec 200 microlitres de milieu de culture cellulaire complet et ajoutez 100 microlitres de solution de détachement cellulaire dans chaque puits pendant 20 minutes, à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules se sont détachées, chargez la plaque sur le cytomètre en flux et acquérez un minimum de 1 000 événements dans la population à diffusion directe et latérale, généralement associée à des cellules viables.

Ensuite, utilisez le logiciel d’analyse de cytométrie en flux approprié pour identifier la population d’intérêt et déterminer l’intensité moyenne de fluorescence de l’expression de la calréticuline. La spectroscopie d’émissions optiques peut être utilisée pour suivre les pics distincts liés aux composants réactifs du plasma dans différentes conditions de gaz d’alimentation. Pour le traitement au plasma des liquides, l’évaporation causée par le gaz argon et le plasma d’argon est déterminée en premier, les conditions donnant des résultats d’évaporation différents, car le plasma exerce également des effets sur la température.

À l’instar des résultats de la spectroscopie d’émissions optiques pour les radicaux hydroxyles, les dépôts de peroxyde d’hydrogène diminuent considérablement avec l’apport d’oxygène ou d’azote, mais augmentent avec le gaz d’alimentation humidifié. De plus, l’ajout d’azote au gaz d’alimentation entraîne des concentrations de nitrate nettement plus élevées par rapport aux liquides traités au plasma d’argon. La plupart des superoxydes sont produits dans des conditions sèches de gaz argon, avec des adjuvants d’oxygène et/ou d’azote qui ralentissent considérablement la production de superoxyde, sauf en présence de plasma argon-oxygène humidifié.

Les intensités de fluorescence des cellules traitées à la résazurine et au plasma sont similaires aux changements physiques observés visuellement sur les surnageants des cultures cellulaires, confirmant les effets cytotoxiques d’un traitement plasmatique prolongé. Une diminution de la surface cellulaire totale est également observée dans les puits d’échantillons de traitement au plasma, en particulier dans des conditions de gaz d’alimentation humidifié, avec une régulation globale à la hausse de la coloration à la calréticuline sur les cellules de mélanome miren, en réponse à des expositions plus courtes au traitement au plasma. S’ils sont effectués correctement, les tests cellulaires mytoplex et la lecture peuvent être terminés en quelques heures seulement.

Après cette procédure, d’autres méthodes peuvent également être effectuées, telles que la co-culture avec des cellules immunitaires, ou l’analyse de surnageants de culture cellulaire. Cela permet de répondre à des questions supplémentaires, sur la libération de mères, de clients cyto ou de protéines redux, ainsi que sur la reconnaissance immunitaire des cellules de mélanome traitées au plasma. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à d’autres recherches sur les cycles du mélanome, par exemple avec des sphéroïdes tumoraux en 3D.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer des recherches fondamentales en médecine du plasma, de la phase gazeuse plasmatique, en passant par les molécules réactives et les liquides, jusqu’aux réponses biologiques dans les cellules de mélanome.