Name: Recherche fondamentale en médecine Plasma - une approche de débit des liquides aux cellules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Découvrez un protocole haut débit pour le traitement par plasma froid de liquides et cellules en médecine. Cette méthode semi-automatisée utilise des plaques 96 puits et la cytométrie en flux pour analyser la viabilité cellulaire et l'expression de la calréticuline dans les mélanomes.

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Financé par le ministère fédéral allemand de l’éducation et la recherche (BMBF Don 03Z22DN12 et numéros 03Z22DN11) tient à reconnaître.

1. plasma espèces surveillance et installation de traitement
<ol><li>
Surveillance des espèces de plasma
	<ol>
<li>Utiliser un jet de plasma de la pression atmosphérique et un maximum de deux litres par minute que se nourrissent des débits de gaz standard.</li>
		<li>Perpendiculaire à l’axe du panache, positionner le jet en face d’un spectrophotomètre d’émission optique et photoémission record et la longueur d’onde (200-1 000 nm) à l’aide dédiée logiciel.</li>
		<li>Mélangez 0,5 % d’azote ou d’oxygène au gaz d’alimentation soit sec ou humidifié (5 %).</li>
		<li>Répétez spectroscopie optique d’émission pour chaque condition de gaz.</li>
		<li>Analyser avec le logiciel approprié pour l’affichage graphique des données.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Installation de traitement plasma
	<ol>
<li>Difficulté le jet vers une table xyz pilotés par ordinateur.</li>
		<li>Identifier la position des puits et générer un script ordinateur pour déplacer le jet s’est joint à la table, avec le temps de traitement approprié, au-dessus du centre de chaque puits.</li>
		<li>Ajouter 104 de n’importe quel type de cellules de mammifères adhérentes dans 100 µL de milieu de culture cellulaire complet (RPMI1640 avec 10 % FCS, glutamine 2 % et 1 % la pénicilline/streptomycine) dans plusieurs puits sous une hotte à flux laminaire.</li>
		<li>Permettre l’adhésion cellulaire se produisent pendant une nuit à 37 ° C en atmosphère humidifiée avec 5 % de dioxyde de carbone.</li>
		<li>Traiter les cellules avec du plasma pour 20 s à différentes hauteurs (axe z) intervalles de 250 µm.</li>
		<li>Ajouter 25 µL de l’iodure de propidium dans un milieu de culture cellulaire dans chaque puits.</li>
		<li>Les cellules au microscope pour déterminer la hauteur spécifique qui n’induit pas de nécrose cellulaire due à l’alimentation de gaz en poussant le milieu de culture sur le dessus des cellules à côté de l’image. Remarque : Pour des temps de traitement plus longs, identifier évaporation liquide à cette hauteur particulière, dans le plasma et hors mode, en pesant la plaque avant et après traitement au plasma pour déterminer la quantité de microlitres de doubledistilled l’eau nécessaire pour rétablir la homéostasie osmotique dans les puits traitées.</li>
		<li>Préparer un protocole final pour la table xyz avec des temps de traitement respectifs (ici : 20 s, 40 s, de 60 s plasma et de contrôle de gaz s 60) et bien des positions, et avoir prêts pipettes multicanaux et réservoirs destinés à la manipulation de liquides des plaques de 96 puits lors d’essais ultérieurs.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. analyse des principaux éléments réactifs en liquides traités Plasma
<ol><li>
Analyse du Plasma traité de peroxyde d’hydrogène
	<ol>
<li>Traiter 100 µL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec du plasma en trois exemplaires, plaques à 96 puits à fond plat.</li>
		<li>Préparer un mélange maître en chargeant 100 µL de PBS avec 10 U de la peroxydase de raifort et 5 µM de réactif de détection de peroxyde d’hydrogène (suffisant pour un bien, évoluer en conséquence).</li>
		<li>Ajouter 95 µL du mélange maître dans chaque puits. Remarque : L’étape précédente doit être effectuée sous un banc propre ou dans une pièce séparée de celle de la source de plasma comme l’ozone de l’air ambiant peut diminuer la sensibilité du test.</li>
		<li>Dans une assiette, préparer une série de double dilution d’eau oxygénée dans du PBS avec une concentration supérieure de 100 µM dans 100 µL de PBS.</li>
		<li>Ajouter 5 µL d’échantillons ou de normes de peroxyde d’hydrogène aux puits contenant le réactif de détection.</li>
		<li>Inclure les puits contenant le réactif de détection que pour la soustraction du fond après la lecture.</li>
		<li>Incuber la plaque dans l’obscurité à température ambiante pendant 15 minutes.</li>
		<li>Placer la plaque dans le lecteur de microplaque mesure de fluorescence à λex 535 nm et λem 590 nm. Remarque : Si des concentrations élevées de peroxyde sont attendues dans les échantillons, la dilution de l’échantillon doit être augmentée ou lectures doivent être faits avec des temps d’incubation plus courts afin d’éviter la saturation du dosage.</li>
		<li>Soustraire des valeurs vides de tous les échantillons, calculer la courbe d’étalonnage peroxyde et quantifier les concentrations de peroxyde échantillon inconnu de cette courbe de référence.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analyse du Plasma traité Nitrite
	<ol>
<li>Traiter 100 µL de PBS avec le plasma en trois exemplaires, des plaques de 96well flatbottom.</li>
		<li>Préparer un mélange maître de solution de détection des nitrites en ajoutant 1 µL de réactif de quantification à 99 µL de doubledistilled eau (suffisant pour un bien, évoluer en conséquence).</li>
		<li>Ajouter 100 µL / puits d’une plaque de 96well clair, flatbottom. S’intensifier si nécessaire pour le nombre de puits.</li>
		<li>Préparer une série de dilutions de normes de nitrite dans l’eau doubledistilled.</li>
		<li>Ajouter 10 µL de normes ou d’échantillons dans le master mix en plaques 96well.</li>
		<li>Incuber la plaque dans l’obscurité pendant 10 min à température ambiante.</li>
		<li>Ajouter 5 µL de solution de nitrite de quantification développeur dans chaque puits.</li>
		<li>Lire la fluorescence dans un lecteur de microplaques à λex 365 nm et λem 450 nm.</li>
		<li>Soustraire des valeurs vides de tous les échantillons, calculer la courbe standard de nitrite et quantifier les concentrations de nitrite échantillon inconnu de cette courbe de référence.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analyse du Plasma traité superoxyde
	<ol>
<li>Faire un mélange maître du cytochrome oxydé (1 mg/mL) et de la catalase (20 µg/mL) dans du PBS.</li>
		<li>Ajouter 100 µL du mélange maître sur les puits d’une plaque à 96 puits claire, fond plat.</li>
		<li>Traiter les master mix avec du plasma en triple exemplaire par la condition de traitement.</li>
		<li>Lire l’absorbance à 550 nm en utilisant un lecteur de microplaques ; le graphique de ces données.</li>
		<li>Calculer la quantité de radicaux superoxyde généré à l’aide du coefficient d’extinction molaire du cytochrome C et de la longueur du trajet optique de liquide dans un puits.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. la réaction biologique des cellules exposées au Plasma
<ol><li>
Lecture multidimensionnelle des cellules traitées à Plasma : activité métabolique
	<ol>
<li>Utiliser une hotte à flux laminaire pour toutes les procédures suivantes.</li>
		<li>Cellules de4 graines 10 (mélanomes murins B16) en milieu de culture cellulaire 100 µL entièrement complétée par puits dans les plaques de 96 puits à fond plat.</li>
		<li>Permettre à adhésion cellulaire pendant la nuit à 37 ° C dans l’atmosphère humidifiée de l’incubateur avec 5 % de dioxyde de carbone.</li>
		<li>À l’aide de la table xyz, traiter des puits à plasma ou gaz seulement selon un schéma prédéfini et ajoute les cellules dans l’incubateur pendant 20 h. Remarque : Si vous le souhaitez, enlever les surnageants après 20 h pour analyser les produits extracellulaires ; Ajouter 100 µL de milieu frais par la suite.</li>
		<li>Dans chaque puits, ajouter 25 µL de milieu de culture cellulaire contenant 500 µM résazurine (concentration finale 100 µM) ; préparer trois puits contenant résazurine seul dans le milieu de culture cellulaire sans cellules pour la soustraction du fond.</li>
		<li>Incuber pendant 3 heures dans l’incubateur.</li>
		<li>Lecture de fluorescence à λex 535 nm et λem 590 nm dans un lecteur de microplaques.</li>
		<li>Soustraire la fluorescence de fond de tous les échantillons et de normaliser les données aux valeurs témoins.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lecture multidimensionnelle des cellules traitées à Plasma : analyse d’Image
	<ol>
<li>Utilisez la plaque bien de 3.1.7 et jeter le surnageant.</li>
		<li>Ajouter 100 µL de milieu de culture de cellules fraîches contenant 1 iodure de propidium µg/mL.</li>
		<li>Mettre la plaque sous un microscope avec une platine motorisée à l’image de chaque puits. Remarque : L’imagerie détails dépendent de la question expérimentale ; ici, un objectif 20 X a été utilisé dans un appareil d’imagerie de haute teneur pour lire 3 x 3 champs de vision dans chaque puits dans un champ lumineux canal, canal de contraste de phase numérique et canal (iodure de propidium) de fluorescence, utilisant des émissions et la lumière d’excitation appropriée filtres.</li>
		<li>Utilisation logiciel d’analyse quantitative d’image pour déterminer la superficie totale cytosolique dans les images de contraste de phase numérique de tous les champs de vision imagée dans chaque puits. NOTE : Analyser des paramètres supplémentaires si vous le souhaitez, par exemple, le nombre de cellules viables et/ou morts ou l’activité mitochondriale à l’aide de taches dédiés. Si vous utilisez les autres taches que celles décrites dans cet ouvrage, veillez à ce que les taches utilisés pour la microscopie de fluorescence ne se chevauchent pas spectralement avec les fluorochromes utilisés dans des expériences de cytométrie en flux ultérieurs.</li>
		<li>Graphique des données et si vous le souhaitez, tester pour la corrélation avec les valeurs obtenues pour l’activité métabolique.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lecture multidimensionnelle des cellules traitées à Plasma : cytométrie en flux
	<ol>
<li>Pour cette analyse, utilisez la plaque bien de l’étape 3.2.5.</li>
		<li>Jeter le surnageant et laver deux fois avec 200 µL de PBS contenant du calcium et du magnésium (0,9 mM et 0,5 mM, respectivement). NOTE : Difficulté et/ou permeabilize des cellules à ce stade encore biologiques lectures non couverts dans cette contribution, tels que la coloration des analyse intracellulaire de l’antigène ou le cycle cellulaire.</li>
		<li>Dans chaque puits, ajouter 50 µL de PBS avec le calcium et le magnésium contenant 50 anticorps monoclonaux de anti-souris calréticuline ng/mL.</li>
		<li>Incuber pendant 15 minutes dans l’incubateur.</li>
		<li>Laver deux fois avec 200 µL d’entièrement complétée de milieu de culture cellulaire et jeter le liquide dans la plaque.</li>
		<li>Ajouter 100 µL de solution de détachement cellulaire dans chaque puits et incuber pendant 20 min dans l’incubateur.</li>
		<li>Utiliser un autre ensemble de non-colorées B16 cellules en suspension pour le protocole d’acquisition de cytométrie en flux, gating stratégie et les gains et les tensions de photodétecteurs.</li>
		<li>Charger la plaque dans un cytomètre en flux équipé d’un échantillonneur automatique pour plaques 96 puits.</li>
		<li>Acquérir un minimum de 1 000 cellules dans vers l’avant et de la population de nuages de points de côté généralement associés à des cellules viables.</li>
		<li>Utiliser un logiciel dédié pour l’analyse de la cytométrie en flux, fichiers .fcs à la porte de la population visée et déterminer l’intensité de fluorescence moyenne de la calréticuline.</li>
		<li>Graphique des données et si vous le souhaitez, tester pour la corrélation avec les valeurs obtenues pour les dépôts d’oxydant, imagerie et/ou l’activité métabolique.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La recherche fondamentale est essentielle pour développer une compréhension de l’efficacité d’et les mécanismes qui sous-tendent la médecine plasma en recherche clinique et préclinique. Recherche fondamentale favorise également l’étude de nouvelles applications pour les traitements. Alors qu’il est bien établi que les plasmas véhiculent leurs effets biologiques via une génération de réactives de l’oxygène et azote espèces19, il y a toujours trois défis principaux dans le domaine. Tout d’abord, quelles espèces sont importantes ? Cela peut être partiellement répondu en modulant la composition du gaz d’alimentation des plasmas avec diagnostics optiques et afficheurs biologiques. 20 Deuxièmement, quels sont les effets sont visibles dans des cibles biologiques telles que les cellules ? C’est, au moins en partie, adressée à l’aide d’expériences de culture cellulaire et un certain nombre d’épreuves. Dans les cellules eucaryotes, les effets sont pléiotropes y compris cycle cellulaire arrestation21, apoptose22,23de nécrose et peau cellule stimulation24,25,26, ainsi qu’un support ou la diminuent des cellules la motilité ou activité métabolique27,28,29. Le troisième défi, relatives à ces effets pléiotropiques, est d’identifier des molécules clés qui déterminent la réponse cellulaire aux oxydants dérivés du plasma pour expliquer les effets différents, souvent vus dans différents types de cellules. Cela peut être fait par omics techniques30,31,32 et/ou vers le haut ou diminution de l’expression des gènes de cible à l’aide de siARN (redox) signalisation des inhibiteurs, des antioxydants et des enzymes antioxydantes, ainsi que modulation de la production d’espèces réactives de plasma. 33 , 34 , 35 c’est pourquoi, protocoles de dosage simplifié sont nécessaires à plus grands ensembles d’échantillons avec un grand nombre d’itérations de test.
Cette étude illustre un workflow efficace expérimental, de la physique à la biologie, recherche médicale plasma en ce qui concerne les défis susmentionnés. Détails sur les aspects techniques de la source de plasma et de la génération d’un plasma ont été décrits avant. 36 , 37 , 38 tous ces tests sont réalisés en plaques de 96well, qui a un certain nombre d’avantages. Par exemple, les échantillons tels que les surnageants de culture de cellules peuvent être facilement portés de dosage à plaques collectrices à étudier, par exemple, les concentrations de protéine par enzyme---analyse d’immunosorbant. S’il dispose des équipements scientifiques capables de lecture directement à partir de 96 puits, une telle approche minimise les coûts par échantillon et handsontime et maximise les résultats par multiplexage des différentes épreuves du même échantillon. L’utilisation du multicanal pipettes en outre accélère la manipulation des échantillons. En principe, l’essai décrit ici peut effectueé en utilisant des formats de plaque bien avec des diamètres de puits, bien que cela nécessiterait de pipetage supplémentaires dans d’autres tubes et bateaux pour des dosages en aval. Types de plaque plus petits tels que des plaques de 384, cependant, ne présentent pas la géométrie appropriée pour la recherche biomédicale plasma utilisant des jets avec les flux de gaz d’alimentation grande. Plus précisément, il ne peut être garantie que seul mais non adjacents de puits sont touchés lors d’un traitement.
Analyse de liquide est essentiel pour étudier les dépôts espèces par le plasma. En expertises, une configuration parallèle des différentes épreuves peut caractériser plasmatreated liquides en ce qui concerne les différents oxydants en même temps. Ce multiplexage permet de développer une image différenciée des espèces ont. L’approche décrite est très sensible pour enquêter sur les concentrations de peroxyde d’hydrogène39, qui est souvent nécessaire, mais pas toujours suffisante pour expliquer les effets plasma. 40 , 41 , 42 effets biologiquement pertinentes peuvent également être évalués dans les liquides avec un dosage de glutathion non inclus ici. 43 le dosage spécifique nitrite est fortement préférable à Griess-essais conventionnels en raison de la sensibilité plus élevée 10fold (données non présentées). Plasmatreated liquides peuvent également être étudiées pour la formation d’acide hypochloreux DTNB-essai sur. Pourtant, les résultats antérieurs n’indiquaient pas la formation de cette espèce avec notre source de plasma. 19 , 39 , 44 après traitement au plasma, détérioration de l’espèce se déroule au fil du temps. Réagit de nitrite en nitrate ; en outre, le peroxyde est consommé au fil du temps. Toutefois, ces processus prennent plusieurs heures. 35 l’absorption de cytochrome c est stable pendant plusieurs heures de plus. Donc, si le processus se produisent au cours des 30 premières minutes après le traitement, la variation des concentrations des espèces vivaces décrites ici sont négligeables. Cependant, il faut lors de l’enquête sur certains types de supports (p. ex., milieu d’Eagle modifié de Dulbecco) comme ingrédients peut piéger jusqu'à à 90 % de peroxyde de moins de 1 h (données non présentées) conduisant à une sous-estimation des dépôts peroxyde de plasma dans liquides.
Un essai multiplex est présenté qui va d’enquêter sur une activité métabolique sur zone (morphologie) de la cellule à l’expression du marqueur de surface cellulaire. Une combinaison de ces essais peut-être révéler des résultats intéressants. Par exemple, nous avons déjà montré dans les monocytes THP1 que métaboliques comtes d’activité et de la cellule ne diminuent pas de façon linéaire après une exposition au plasma. 45 plutôt, avec le temps de traitement plasma, les cellules ont été observées qui ont augmenté en taille et avait une masse mitochondriale plus élevée, ce qui conduit à des taux métaboliques plus élevés sur une base percell. Essentiellement, la combinaison de lecteur multidisque, microscopie et cytométrie multiplexes d’informations sur les réponses cellulaires après traitement au plasma. Dans les cellules de mélanome, nous nous concentrons ici sur les effets cytotoxiques et leur immunogénicité médiée par la calréticuline. 46 en principe, beaucoup d’autres questions peut être adressées à cette approche, qui relie l’activité métabolique avec imagerie et écoulement cytometry résultats. Par exemple, la différenciation cellulaire (p. ex. polarisation de macrophage), potentiel de membrane mitochondrial, analyse du cycle cellulaire, la motilité cellulaire, biomécanique ou la formation de micronoyaux pour l’analyse de la génotoxicité peut également être étudiée dans cellules traitées au plasma. Cytométrie en flux multicolor permet plus d’applications dans différentes populations cellulaires en même temps. Cela inclut, par exemple, l’analyse de l’état de phosphorylation de protéines telles que les facteurs de transcription, quantification de l’ARNm, mesure des cytokines intracellulaires, et/ou évaluation des thiols réduits totales sur un niveau unicellulaire de signalisation. Des informations biologiquement pertinentes supplémentaires qui sont disponibles pour chaque échantillon contribue à développer l’image des effets de redox de plasma afin de mieux comprendre les applications actuelles et futures de plasma.

Espèces réactives sont des régulateurs de l’oxydo-réduction importante dans les maladies, y compris de cicatrisation anormale1 et le cancer. 2 ce qui est important, ces espèces sont impliqués dans la pathologie ainsi que sa résolution thérapeutique. 3 , 4 froid physique plasma est un gaz ionisé qui expulse des espèces réactives de toutes sortes. 5 depuis l’avènement de ce que l'on appelle plasmas froids qui fonctionnent à la température de corps6, plasmas froids peuvent être appliquées aux cellules et tissus sans dommage thermique. En démontrant l’efficacité et l’application sûre des dispositifs de plasma dans les observations précliniques et cliniques, trois ont reçu l’accréditation comme des dispositifs médicaux en Allemagne. 7 en particulier en ce qui concerne la sécurité génotoxique, plusieurs études ont montré l’absence d’événements mutagènes en utilisant le premier appareil, un jet de plasma d’argon la pression atmosphérique. 8 , 9 , 10 les deux autres appareils sont des rejets de ce qu’on appelle barrière diélectrique (DBD), qui opèrent par l’intermédiaire de jet plasma un principe différent. Plus précisément, jets permettent pour bistouri comme traitement des surfaces et des cavités alors que DBD plasmas sont efficaces dans le traitement des zones de tissu plus grand mais plutôt plat. Exploitant d’oxydoréduction cellulaire signalisation11, le but de la technique est d’utiliser des espèces réactives plasma généré pour des applications biomédicales. 12 une demande particulièrement prometteur de la thérapie clinique plasma est le support de la cicatrisation des plaies. 13 , 14 , 15 en outre, plasma s’est avéré avoir des effets anticancéreux dans les modèles animaux. 16 , 17 , 18
Avant de valider l’efficacité et la sécurité des applications de plasma dans des modèles animaux ou même des humains, standardisé en vitro besoins de recherche à effectuer avec les dispositifs de plasma. Ces expériences sont essentiels à la découverte des applications plasma et pour délimiter les mécanismes à le œuvre. En outre, la recherche fondamentale est nécessaire pour comprendre l’impact de la composition des espèces réactives et effets biologiques ultérieures. Cette étude démontre comment le plasma peut être intégré à la recherche biomédicale pour mieux comprendre et contrôler ses effets sur les cellules. Il décrit l’accordage de la composition des gaz d’alimentation, suivi de la production d’espèces réactives, les applications du plasma à liquides, cellules, tissus et les résultats chimiques et biologiques qui en résulte. En outre, les exemples sont fournis qui instruire sur la normalisation du traitement au plasma et des dosages biologiques en aval, avec un accent mis sur la recherche médicale plasma faite en plaques de 96 puits. Cette approche a des avantages distincts : i) minimisation du nombre de cellules nécessaires par l’État, les coûts de réactif et pratique temps par échantillon ; II) indemnité d’une plus grande exactitude des résultats que les traitements en doubles ou en triple peuvent être mis en place avec facilité ; et iii) facilitation de dosage en aval sans faille dans le lecteur de plaques de 96 puits format, d’images et des expériences de cytométrie en flux.

<table><tbody>kit de détection <tr><td>accutase</td><td>BioLegend</td><td>423201</td><td></td></tr><tr><td>amplex Ultra Red (comprend la peroxydase de raifort et H2O2)</td><td>Thermo</td><td>A36006</td><td></td></tr><tr><td>gaz argon</td><td>Air Liquide</td><td>N50</td><td></td></tr><tr><td>B16F10 cellules de mélanome murin</td><td>ATCC</td><td>CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td>catalase</td><td>Sigma</td><td>C30</td><td></td></tr><tr><td>incubateur</td> <td>de culture cellulaireLiant</td><td>CB210</td><td></td></tr><tr><td>plastique de culture cellulaire</td><td>NUNC</td><td>156545</td><td></td></tr><tr><td>cytochrome c, oxydé</td><td>Sigma</td><td>C2037</td><td></td></tr><tr><td>analyse de données</td><td>GraphPad prisme</td><td>7.03</td><td></td></tr><tr><td>sérum bovin fœtal</td><td>Sigma</td><td></td><td>testé par lots</td></tr><tr>à<td>échelle</td><td></td><td></td> fine <td>n’importe quelle avec une résolution de 0,01 mg</td></tr><tr><td>cytomètre en flux</td><td>Beckman-Coulter</td><td>CytoFlex S analyse des</td><td></td></tr><tr><td>données de cytométrie en flux</td><td>Beckman-Coulter</td><td>Kaluza 1.5a</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>logiciel de quantification d’imagerie</td><td>PerkinElmer</td><td>Harmony 4.5</td><td></td></tr><tr><td>hotte à flux laminaire</td><td>Thermo</td><td>Maxisafe 2020</td><td></td></tr><tr><td>régulateur de débit massique</td><td>MKS</td><td>G-series</td><td></td></tr><tr><td>Measure-iT kit de détection de nitrites</td><td>Thermo</td><td>M36051</td><td></td></tr><tr><td>microscope</td><td>PerkinElmer</td><td>Operetta CLS</td><td></td></tr><tr><td>spectroscopie optique à emssion</td><td>Avantes</td><td>AvaSpec-DDDD-2-USB2</td><td></td></tr><tr><td>péniciline/streptomycine</td><td>Thermo</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pipettes</td><td>Eppendorf/Marque</td><td>mono/multi canaux</td><td></td></tr><tr><td>lecteur de plaques</td><td>Tecan</td><td>M200pro</td><td></td></tr><tr><td>iodure de propidium</td><td>BioLegend</td><td>421301</td><td></td></tr><tr><td>resazurin</td><td>VWR</td><td>B21187.06</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 milieux de culture cellulaire</td><td>PanbioTech</td><td>P04-16500</td><td></td></tr><tr><td>xyz table</td><td>CNC step</td><td>HIGH-Z S-400/T&nbsp ;</td><td></td></tr></tbody></table>

recherche fondamentale en médecine plasma - une approche de débit des liquides aux cellules

Basic Research in Plasma Medicine - A Throughput Approach from Liquids to Cells

En médecine de plasma, gaz ionisés dont la température proche de celle des systèmes de vertébrés sont appliqués aux cellules et tissus. Les plasmas froids génèrent des espèces réactives signales par oxydoréduction régulent les processus biologiques dans la santé et la maladie. Les données précliniques et cliniques pointe vers les effets bénéfiques du traitement au plasma dans la guérison de l’ulcère chronique de la peau. Autres sujets émergents, comme le traitement du cancer plasma, suscitent un intérêt croissant. Recherche médicale plasma a besoin de compétences interdisciplinaires en physique, chimie et la biomédecine. Un des buts de recherche plasma sont de caractériser les cellules traitées au plasma dans une variété d’applications spécifiques. Cela inclut, par exemple, nombre de cellules et viabilité, oxydation cellulaire, l’activité mitochondriale, cytotoxicité et le mode de la mort cellulaire, analyse du cycle cellulaire, cellule expression du marqueur de surface et la libération de cytokines. Cette étude décrit l’équipement essentiel et flux de travail nécessaires à ces recherches en biomédecine de plasma. Il décrit le fonctionnement d’un jet plasma argon de la pression atmosphérique, plus précisément suivi sa base des spectres d’émission et paramètres de gaz pour moduler la production d’espèces réactives d’alimentation. En utilisant une table xyz de haute précision et les logiciels, le jet est survolé en précision à la milliseconde les cavités des plaques de 96 puits en micromètre-précision de reproductibilité maximale. Dosages en aval pour analyse de liquide des actifs en oxydoréduction molécules apparaissent, et les cellules cibles sont imprégnées par le plasma. Plus précisément, les cellules du mélanome sont analysés dans une séquence efficace des différentes épreuves consécutives, mais en utilisant les mêmes cellules : mesure de l’activité métabolique, superficie totale de cellules et l’expression de marqueur de surface de la calréticuline, une molécule importante pour la immunogènes de l’apoptose des cellules cancéreuses. Ces tests de récupérer des informations biologiques riches en contenu sur effets plasma d’une seule plaque. Au total, cette étude décrit les étapes essentielles et les protocoles de recherche médicale de plasma.

Dans cette étude, un flux de travail simplifié a été décrite pour la recherche médicale sur les effets du plasma. L’approche multidisciplinaire utilisée ici analyse le profil de base d’émission optique du jet de plasma, les principaux composants réactifs dans le liquide, et les réponses biologiques des cellules traitement avec du plasma (Figure 1).
Pour effectuer ce flux de travail, un certain nombre de composantes est nécessaires pour configurer correctement la source de plasma (Figure 2). Les différents gaz (ici principalement argon, oxygène et azote) ont été fournis aux et contrôlé par plusieurs contrôleurs de débit massique. Un panneau central permettait d’ajuster numériquement les contrôleurs de débit massique pour les flux de gaz d’alimentation prédéterminé. Pour obtenir des compositions spécifiques gaz d’alimentation, les gaz étaient physiquement mixtes utilisant un panel de vannes qui combinait des gaz provenant de plusieurs contrôleurs de débit massique (Figure 2A). La source de plasma a été allumée, et l’effluent du plasma a été mis en place en face d’un USB-spectrophotomètre (Figure 2B) avec une portée optique de 200 nm à 1 000 nm. Pour le traitement des liquides et des cellules, un workflow efficace a été décrite à l’aide de plaques de 96 puits. Cupules multiples ont été maintenus en place à l’aide d’un cadre en plastique qui a été fixé sur la plaque de base avec insertions mis en correspondance avec ses trous imprimés (Figure 2C). L’installation entière fut placée sous une hotte à flux laminaire (Figure 2D). Cette configuration a inclus un xyz-tableau sur lequel la pièce à main du jet de plasma a été installée. Les éléments de commande du moteur peuvent être situées en dehors de l’audience, si ce dernier a câble suffisamment grand ports d’et vers la table xyz. Ce qui est important, le tableau a été commandé par ordinateur et peut être programmé pour survoler le jet au centre de chaque puits avec une précision micrométrique pour la durée désirée. En outre, la position de départ (comme dans notre configuration, puits A1) a été choisie librement (Figure 2E). Avec le support de plaque en plastique, ceci permettait à un traitement plasma reproductible avec les variations quotidiennes liées uniquement à la configuration des expériences biologiques et de liquides.
Spectrométrie d’émission optique (OES) a été utilisé pour suivre les pics distincts liés aux composants réactifs plasma dans des conditions de différents gaz d’alimentation (Figure 3A). Par exemple, le second système positif de l’azote avec des pics de 330 nm à 380 nm représenté azote réactif espèces et le pic à 309 nm représenté les radicaux hydroxyles (flèche dans la Figure 3A). Comparativement au gaz argon seul, la présence des espèces azotées a augmenté avec un mélange d’azote dans le gaz d’alimentation, tandis que l’ajout d’oxygène ou l’humidité diminuée ou réduit, respectivement. En revanche, la présence de radicaux hydroxyle est diminuée avec l’oxygène ou d’azote mais augmente de façon marquée si humidifié argon a été utilisé comme gaz d’alimentation. Traitement au plasma de liquides, l’évaporation causée par le gaz argon et plasma d’argon a été déterminée premier (Figure 3B). Ce qui est important, ces deux conditions n’ont pas donné des résultats similaires parce que plasma exerce aussi des effets sur la température. Conformément aux résultats des radicaux hydroxyles OES, dépôts de peroxyde d’hydrogène a significativement diminuent avec un mélange d’oxygène ou d’azote mais augmentent avec gaz humidifié d’alimentation (Figure 3-C). En outre, l’ajout d’azote dans le gaz d’alimentation conduit à des concentrations de nitrites significativement plus élevées par rapport aux liquides d’imprégnées par le plasma argon (Figure 3D). Ce flux de travail peut-être également être employée pour étudier l’impact du plasma sur les liquides avec des compositions différentes. Par exemple, les concentrations de peroxyde d’hydrogène semblent être indépendante de la présence de sérum de veau foetal dans PBS et RPMI1640 milieu de culture cellulaire (Figure 3E). Dans les mêmes échantillons, la présence de sérum diminue les concentrations de nitrite dans PBS et cellule de milieu de culture par rapport à leurs homologues contenant non-sérum (Figure 3-F). La plupart de superoxyde a été produit dans les conditions du gaz argon sec avec des adjuvants d’oxygène ou d’azote trempe significativement la production de superoxydes, à l’exception du plasma d’argon-oxygène humidifié (Figure 3G).
Pour traitement plasma des cellules dans les cupules multiples, la plaque contenant des cellules ensemencées la veille a été retirée de l’incubateur et ajoute le support en plastique. Un modèle de traitement programmé a été appliqué et la plaque a été replacée dans l’incubateur pendant 20 h Note qu’après l’incubation, les surnageants de culture cellulaire pourraient avoir été compilé en une plaque à 96 puits vide et conservé à - évaporation est compensée 80 ° C pour l’évaluation de protéines d’intérêt. Ensuite, résazurine a été ajouté aux cellules de chaque puits. Chiffre d’affaires de résazurine non fluorescent à résorufine fluorescent a été seulement facilitée par des enzymes actives générateur de NADPH et était corrélée à l’activité métabolique général (Figure 4A). Intensités de fluorescence ressemblaient à la perception visuelle de la plaque et a indiqué les effets cytotoxiques de traitement plasma prolongée (Figure 4B). Conditions de gaz humidifié étaient plus nocifs que les conditions de gaz sec. Les mêmes cellules de la plaque ont été utilisés pour des analyses plus loin en aval. Au microscope, les cellules dans la plaque sont étudiés (Figure 4C). Plusieurs puits de la plaque à l’aide de logiciels d’imagerie, ont été examinés pour comparaison qualitative (Figure 4D). Logiciel permis la quantification de la surface totale couverte par les cellules dans les champs de vue acquis dans chaque puits et les données obtenues ont été normalisées à leurs témoins respectifs (Figure 4E). Une diminution de la superficie totale de cellules a été vu dans les échantillons de traitement plasma, surtout avec les conditions du gaz d’alimentation humidifié. Après l’imagerie, les cellules ont été lavés, colorées avec les anticorps anti-souris calréticuline, détachés et analysés par cytométrie en flux (Figure 4F). Moyenne de fluorescence des intensités de la calréticuline coloration de cellules viables (Figure 4G) ont été calculées et comparées entre les échantillons (Figure 4H). Traitement au plasma induit une augmentation de la calréticuline sur surface de cellules de mélanome murine, qui correspondait à la durée du traitement plasma appliquée aux conditions de gaz d’alimentation sèche. Pour humidifier les conditions de gaz d’alimentation, 20 s et 40 s de traitement induit une plus forte exposition de la calréticuline par rapport à la plus meurtrière de 60 s de temps de traitement. Ceci suggère qu’il y avait un règlement non linéaires d’exposition de la calréticuline en ce qui concerne la quantité d’antioxydants introduit dans les cellules.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56331/56331fig1.jpg"> Figure 1 : Flux de travail de la recherche médicale de plasma de la physique à la biologie. La production d’espèces réactives du jet de plasma argon la pression atmosphérique est à l’écoute en modulant le gaz d’alimentation. Certaines molécules en phase gazeuse plasma sont surveillées à l’aide de la spectroscopie. Le plasma est utilisé pour traiter les liquides et enquêter sur les dépôts de l’oxydant. Les cellules cultivées en microplaques sont imprégnées par le plasma, et lectures biologiques sont effectués. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56331/56331fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56331/56331fig2.jpg"> Figure 2 : Installation du banc plasma recherche. (A) le gaz différents en acier inoxydable tuyaux est enfoncés dans plusieurs contrôleurs de débit massique qui sont contrôlées par un panneau central. La composition du gaz d’alimentation individuel est mélangée par la suite en utilisant un panel de vannes. (B) certains composants réactifs du plasma peuvent être surveillés à l’aide de la spectroscopie d’émission optique pour étudier les différences entre les diverses compositions de gaz d’alimentation. (C) pour la recherche de haut débit plasmatique, Microplaque 96 puits est utilisés. Afin d’assurer une constante, point de départ pour traitement plasma programmables et automatisés, la plaque est ajoutée à un cadre garantissant la même position absolue des plaques de jour en jour. (D) le jet de plasma est fixé à un contrôlé par ordinateur xyz-table située sous une hotte à flux laminaire. Tous les 96 emplacements exacts et le temps d’arrêt du plasma sur chaque bien est écrit dans un fichier de programme pour guider le mouvement de la source de plasma. Le boitier de l’appareil de jet de plasma ainsi que les commandes du moteur sont situés à proximité. (E) automatisé de traitement plasma d’une plaque de 96 puits. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56331/56331fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56331/56331fig3.jpg"> Figure 3 : Jet de plasma et le liquide analyse. (A) spectroscopie d’émission optique des conditions des différents gaz d’alimentation est montrée. Le second système positif de l’azote (330 nm à 380 nm) a été augmentée avec mélange d’azote, absent en cas de mélange de l’oxygène et une réduction marquée avec argon humidifié (panneaux de gauche). Le pic de radicaux hydroxyles à 309 nm (flèche) a diminué dans des conditions d’azote et d’oxygène, mais augmente de façon marquée avec argon humidifié par rapport au gaz argon seul. Gaz (B) l’exposition des liquides entraîne l’évaporation. La quantité d’évaporation par puits dans une plaque de 96well par traitement avec du plasma et argon gaz seul a été déterminée par pesée la plaque avant et après traitement à l’aide d’une échelle fine. Évaporation dans des échantillons de plasmatreated a été plus élevée comparée à celle dans les échantillons de gastreated d’argon. (C) la génération de peroxyde d’hydrogène dans les liquides plasmatreated dans une certaine mesure en corrélation avec la 309 nm crête de radicaux hydroxyles (a). Humidifié plasma d’argon (5 %) augmentation des concentrations de peroxyde d’environ 4fold. (D) Nitrite était élevée lorsque l’azote a été ajouté à un gaz, et cet effet a été renforcé avec le plasma d’argon humidifié. L’addition d’oxygène diminue de génération de nitrite, mais pas de façon significative. (E, F) Les concentrations de hydrogène peroxyde et le nitrite est montré dans différents types de liquides, à savoir RPMI1640 milieu de culture cellulaire avec (R10F) et sans (R0F) ainsi que de PBS avec et sans sérum de veau foetal (FCS). Niveaux de peroxyde ne différaient pas entre les différents médias (E) alors que les nitrites ont considérablement diminué en présence de sérum. (G) la production de superoxyde était la plus élevée pour les gaz argon sec alimentation gaz ; mélange d’azote, d’oxygène ou argon humidifié a donné plus faible dépôt de superoxyde dans le liquide. Données présentées (G-B) sont la moyenne + SEM de deux ou trois expériences. L’analyse statistique a été réalisée (C, D) à l’aide d’analyse de variance en comparant les moyens de tout le groupe de conditions de gaz d’alimentation sèche ou humide contre le contrôle respectif (** p &lt; 0,01 ; *** p &lt; 0,001). En outre, des conditions uniquement gaz plasma argon ont été comparées en utilisant la moyenne de l’ensemble du groupe et le t-test (### p &lt; 0,001). Outre analyse statistique (F) a été réalisée à l’aide de tests t en comparant les valeurs de chaque traitement au plasma et condition moyenne dans les échantillons avec FCS et sans FCS (* p &lt; 0,05 ; ** p &lt; 0,01) ; en outre, FCS ou solutions contenant non FCS ont été comparées dans chaque délai de traitement plasma en utilisant le test t (# p &lt; 0,05 ; ## p &lt; 0,001). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56331/56331fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56331/56331fig4.jpg"> Figure 4 : Traitement au plasma et son impact sur les cellules. (A) les cellules ont été exposées au plasma et résazurine a été ajouté après 20 h pour évaluer l’activité métabolique. (B) l’activité a été significativement réduite dans les échantillons de plasmatreated par rapport aux commandes de gaz. Une diminution marquée a été vu avec humidification d’un gaz alors que l’addition d’oxygène ou d’azote mène à toxicité dans les deux conditions de gaz argon sèches et humides. (C) un milieu contenant de l’iodure de propidium (PI) a été ajouté. (D), un aperçu s’affiche des puits de la plaque avec contraste de phase numérique (orange) qui représente la fraction cytosolique de chaque cellule et PI (vert) pour identifier les cellules mortes. Outils d’imagerie a permis la quantification de la surface totale dans le champ de vision de chaque bien recouverte de cellules. (F) les cellules ont été ensuite lavés et incubées avec l’anticorps ou d’autres marqueurs de cellules pour caractériser les effets biologiques de plasma à l’aide de cytométrie en flux. (G) Gating stratégies ont été utilisées et analyse ponctuelle a été effectué et comparée entre les échantillons. Données présentées (B, E, H) indiquent la moyenne + SEM d’un représentant de trois expériences indépendantes. Echelle = 200 µm (D). Comparaison statistique a été réalisée en utilisant l’analyse bidirectionnelle des variances (B, H), en comparant, pour chaque condition de gaz, chaque traitement plasma son contrôle gaz respectifs (* p &lt; 0,05 ; ** p &lt; 0,01 ; *** p &lt; 0,001). En outre, les valeurs pour chaque condition d’adjuvants d’azote ou d’oxygène ont été comparées aux valeurs de plasma de gaz argon pour les produits secs et humides séparément les conditions (analyse bidirectionnelle des variances ; ### p &lt; 0,001). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56331/56331fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Un protocole de traitement plasma physique froid haut débit des liquides et des cellules s’affiche. Il consiste à mettre en place des compositions de différents gaz d’alimentation pour l’allumage de plasma, mesurant les spectres d’émission de plasma et l’analyse subséquente des liquides et l’activité cellulaire après traitement au plasma.

Recherche fondamentale en médecine Plasma - une approche de débit des liquides aux cellules

In plasma medicine, ionized gases with temperatures close to that of vertebrate systems are applied to cells and tissues. Cold plasmas generate reactive ...

L’objectif global de ces tests de séquençage multipuits est de mieux comprendre les effets du plasma physique froid sur les oxydants, sur les réponses biologiques in vitro, en utilisant la spectroscopie d’émissions optiques, l’analyse liquide et l’activité cellulaire, la microscopie et les tests de cytométrie en flux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la médecine du plasma, en particulier en ce qui concerne les espèces directives dérivées du plasma, importantes pour l’induction de la mort immunogène des cellules cancéreuses. Le principal avantage de cette technique est son approche semi-automatisée.Il utilise 96 plaques de puits, pour augmenter la vitesse et la productivité de la recherche. Les implications de cette technique s’étendent aux futures thérapies plasmatiques, comme en dermatologie ou en oncologie. Et, comme ils fournissent les moyens d’identifier les espèces directives dérivées du plasma, qui sont pertinentes pour les réponses biologiques.Felix Niessner, un technicien de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour la surveillance des espèces de plasma, positionnez un jet de plasma atmosphérique devant un spectrophotomètre d’émissions optiques, perpendiculaire à l’axe du panache, et utilisez le logiciel dédié pour enregistrer la photoémission et la longueur d’onde de chaque condition de gaz, à deux litres standard par minute de flux de gaz d’alimentation. Pour l’analyse des superoxydes traités au plasma, établissez un protocole final pour la table XYZ, avec les temps de traitement respectifs et les positions de puits appropriés.Ensuite, ajoutez 100 microlitres de mélange maître fraîchement préparé dans les puits d’une plaque claire à fond plat à 96 puits en trois exemplaires, et utilisez un lecteur de micro-plaques, pour mesurer l’absorbance à 550 nanomètres. Pour analyser les effets du traitement au plasma sur les réponses métaboliques cellulaires, dans une hotte à flux laminaire, ensemencez une fois 10 aux quatre cellules d’intérêt dans 100 microlitres de milieu de culture cellulaire entièrement supplémenté, par puits, dans une plaque à fond plat de 96 puits, et incubez pendant la nuit. Après une culture d’une nuit dans un incubateur de culture cellulaire, utilisez la table XYZ pour traiter les puits avec du plasma ou du gaz seul, selon l’analyse expérimentale, et retournez les cellules dans l’incubateur pendant encore 20 heures.À la fin de la deuxième incubation, ajoutez 25 microlitres de milieu de culture cellulaire frais, complété par 500 micromolaires de résazurine aux cellules, ainsi qu’aux trois puits de contrôle de fond de résazurine uniquement. Retournez les cellules dans l’incubateur, pour une incubation de trois heures. Ensuite, mesurez la fluorescence dans un lecteur de microplaques.Pour l’imagerie des cellules traitées au plasma, après lecture de la fluorescence, remplacer les surnageants par 100 microlitres de milieu de culture cellulaire frais, complété par un microgramme par millilitre d’iodure de propidium. Placez la plaque sur une platine de microscope motorisée, et sélectionnez l’objectif 20x pour imager les cellules. Ensuite, utilisez le logiciel d’analyse d’images quantitatives approprié pour déterminer la zone cytosolique totale dans les images numériques à contraste de phase, de tous les champs de vision imagés dans chaque puits.Pour l’analyse cytométrique en flux des cellules traitées au plasma, après l’imagerie, laver les cellules de chaque puits deux fois avec 200 microlitres de PBS, complété par du calcium et du magnésium par lavage, suivi d’un marquage, avec 15 anagrammes par millilitre d’anticorps monoclonal anti-calréticuline de souris, dans 50 microlitres de PBS, plus du calcium et du magnésium par puits. Après 15 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire, lavez les cellules deux fois avec 200 microlitres de milieu de culture cellulaire complet et ajoutez 100 microlitres de solution de détachement cellulaire dans chaque puits pendant 20 minutes, à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules se sont détachées, chargez la plaque sur le cytomètre en flux et acquérez un minimum de 1 000 événements dans la population à diffusion directe et latérale, généralement associée à des cellules viables.Ensuite, utilisez le logiciel d’analyse de cytométrie en flux approprié pour identifier la population d’intérêt et déterminer l’intensité moyenne de fluorescence de l’expression de la calréticuline. La spectroscopie d’émissions optiques peut être utilisée pour suivre les pics distincts liés aux composants réactifs du plasma dans différentes conditions de gaz d’alimentation. Pour le traitement au plasma des liquides, l’évaporation causée par le gaz argon et le plasma d’argon est déterminée en premier, les conditions donnant des résultats d’évaporation différents, car le plasma exerce également des effets sur la température.À l’instar des résultats de la spectroscopie d’émissions optiques pour les radicaux hydroxyles, les dépôts de peroxyde d’hydrogène diminuent considérablement avec l’apport d’oxygène ou d’azote, mais augmentent avec le gaz d’alimentation humidifié. De plus, l’ajout d’azote au gaz d’alimentation entraîne des concentrations de nitrate nettement plus élevées par rapport aux liquides traités au plasma d’argon. La plupart des superoxydes sont produits dans des conditions sèches de gaz argon, avec des adjuvants d’oxygène et/ou d’azote qui ralentissent considérablement la production de superoxyde, sauf en présence de plasma argon-oxygène humidifié.Les intensités de fluorescence des cellules traitées à la résazurine et au plasma sont similaires aux changements physiques observés visuellement sur les surnageants des cultures cellulaires, confirmant les effets cytotoxiques d’un traitement plasmatique prolongé. Une diminution de la surface cellulaire totale est également observée dans les puits d’échantillons de traitement au plasma, en particulier dans des conditions de gaz d’alimentation humidifié, avec une régulation globale à la hausse de la coloration à la calréticuline sur les cellules de mélanome miren, en réponse à des expositions plus courtes au traitement au plasma. S’ils sont effectués correctement, les tests cellulaires mytoplex et la lecture peuvent être terminés en quelques heures seulement.Après cette procédure, d’autres méthodes peuvent également être effectuées, telles que la co-culture avec des cellules immunitaires, ou l’analyse de surnageants de culture cellulaire. Cela permet de répondre à des questions supplémentaires, sur la libération de mères, de clients cyto ou de protéines redux, ainsi que sur la reconnaissance immunitaire des cellules de mélanome traitées au plasma. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à d’autres recherches sur les cycles du mélanome, par exemple avec des sphéroïdes tumoraux en 3D.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer des recherches fondamentales en médecine du plasma, de la phase gazeuse plasmatique, en passant par les molécules réactives et les liquides, jusqu’aux réponses biologiques dans les cellules de mélanome.

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