Name: Knockdown conditionnel de l’Expression génique dans les lignées de cellules cancéreuses pour étudier le recrutement des Monocytes/Macrophages pour le microenvironnement tumoral (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Découvrez le knockdown conditionnel de l'expression génique dans les lignées de cellules cancéreuses pour étudier le recrutement des monocytes et macrophages dans le microenvironnement tumoral.

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Les auteurs tiennent à remercier Jacqueline Rosenberg pour la relecture du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le US Department of Health and Human Services/National Institutes of Health grâce à une subvention à YA DeClerck (Don 5R01 CA 129377) et la Fondation de Martell TJ. MH Kubala est le récipiendaire d’une bourse de développement de carrière de chercheur de l’Institut de recherche de Saban à la Hospital de Los Angeles de l’enfance.

La section protocole qui utilise des monocytes humains obtenus à partir des volontaires en bonne santé suit les directives de hôpital Los Angeles Human Research Ethics Committee l’HME et a été approuvée par l’Institutional Review Board sous le matériel humain Numéro de protocole : CCI 08-00208.
1. préparation des lignées de cellules cancéreuses avec réglé par la tétracycline shARN Expression
<ol><li>Clonage de shARN PAI-1 en vecteur de Tet-pLKO-puro 8 , 9<ol>
<li>Concevoir des oligomères de shARN qui contiennent l' âgedu site EcoRI clivage et j’ai à l’extrémité 5', la séquence de sens, une boucle de 6 séquences de nucléotides et la séquence anti-sens. Remarque : Les oligonucléotides typiques sont conçues comme suit : oligo avant : CCGG - bp 19-21 5' sens - CTCGAG - 19-21 bp antisens - TTTTT, oligo Reverse : 5' AATTAAAAA-19-21 bp sens - CTCGAG - 19-21 antisens de bp 3'. On trouvera un protocole détaillé pour la conception de l’oligomère dans 8. Dans cette étude, 3 séquences de shARN contre PAI-1 ont été testés pour l’effet plus silencieux : shARN 132, shRNA 2, shRNA 333et brouillés33 figurent dans le tableau 1.</li>
		<li>Recuire les oligomères de shARN et brouillés shARN oligomères.<ol>
<li>Reconstituer les oligonucléotides à 100 µM dans l’eau et mélanger oligonucléotide avant de 1 µL, oligonucléotide inverse de 1 µL et 8 µL H2O.</li>
			<li>Pour recuire les oligonucléotides, mélanger ce qui suit : 1 mélange d’oligonucléotide µL, 5 µL tampon 10 mM Tris (hydroxyméthyl) aminométhane (Tris) pH 7.5, 50 mM, 10 mM du chlorure de Sodium (NaCl), le chlorure de magnésium (MgCl2), 1 mM dithioérythritol (DTE) et 44 µL H 2 O.</li>
			<li>Incuber le mélange dans un thermocycleur PCR (amplification) de polymérase à 95 ° C pendant 5 min, éteindre l’appareil et attendez que la température ambiante (RT) est atteint.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Des oligonucléotides recuits précipitées en ajoutant 5 µL 3M acétate de Sodium pH 5,2 à 50 µL recuit oligonucléotides.<ol>
<li>Ajouter 100 µL froide 100 % d’éthanol (EtOH) et incuber 30 min à-80 ° C. Centrifuger dans une centrifugeuse de paillasse à vitesse maximale pendant 30 min à 4 ° C.</li>
			<li>Retirer le surnageant, ajouter 500 µL froid 70 % EtOH, centrifuger pendant 30 min, retirez le surnageant et dissoudre les granulés dans 20 µL H2O.</li>
			<li>Évaluer la concentration des oligonucléotides recuits par spectrophotométrie, mesurer l’absorbance à 260 nm. Oligonucléotides diluées à la concentration finale de 1 ng/µL.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Préparer le milieu Luria Bertani (LB) et des plaques de gélose LB.<ol>
<li>Pour milieu LB, dissoudre 10 g tryptone, 5 g Extrait de levure, 10 g de NaCl dans 1 L d’eau. Ajuster le pH du milieu à pH 7.0 à l’aide de 1 N NaOH et autoclave.</li>
			<li>Pour les boîtes de gélose LB, ajouter 15 g/L d’agar dans un milieu LB. Autoclave et laissez refroidir à 50 ° c environ. Ajouter des antibiotiques et versez les plaques.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ensemencer les bactéries transduites avec un vecteur Tet-pLKO-puro (voir la Table des matières) sur LB gélosé complété avec de l’ampicilline 100 µg/mL et incuber pendant la nuit (O/N) à 37 ° C.</li>
		<li>Ensemencer le milieu LB 100 mL avec de l’ampicilline µg/mL 100 (LB/ampicilline) avec 1 colonie de la plaque et grandir O/N avec agitation à 37 ° C.</li>
		<li>IsolateTet-pLKO-puro de culture bactérienne 100 mL à l’aide d’un kit d’isolation de plasmide.</li>
		<li>Préparer la réaction de restriction pour le vecteur de Tet-pLKO-puro avec des enzymes de restriction EcoRI et AgeI comme suit : 1 µL EcoRI, 1 µL AgeI, 5 µL de tampon de x 10, 1 µL l’ADN plasmidique (1 µg), 42 µL H2O. Incuber 1 h à 37 ° C. Pour obtenir assez de vecteur clivé, préparer des réactions jusqu'à 5 x 50 µL.</li>
		<li>Gel d’agarose à 1 % permet de purifier clivée vecteur du gel d’agarose à l’aide d’un kit de purification de l’ADN. Pour augmenter le rendement de l’ADN, minimiser l’agarose à rapport d’ADN dans le gel à l’aide d’un peigne de gel d’agarose pour grands puits et en enlevant soigneusement la plupart de l’agarose de la bande à l’aide d’un scalpel.</li>
		<li>Préparer le mélange de réaction de ligature comme suit : 1 oligonucléotides ng recuit, 50 ng clivées vecteur, 2 µL de tampon de ligase x 10, 1 ligase µL et de l’eau jusqu'à 20 µL. ligaturer le vecteur avec des oligonucléotides de shARN recuit à 16 ° C O/N.<ol>
<li>Préparer par ailleurs, une réaction de contrôle négatif sans oligonucléotides pour tenir compte de vecteur clivé, partiellement clivé et individu-ligaturé qui se traduira par des colonies positifs fausses.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilisant les techniques de transformation standard, transformer des mélanges de ligature des cellules bactériennes chimiquement compétents visant à empêcher la recombinaison des vecteurs LENTIVIRAUX contenant des répétitions directes.</li>
		<li>Cultiver des bactéries sur les plaques avec de l’ampicilline O/N à 37 ° C. Remarque : En cas de croissance des colonies satellites, répéter la transformation et croissance des bactéries à 30 ° C pour ralentir la croissance et donc d’empêcher les colonies satellites.</li>
		<li>Pour vérifier la ligature réussie, choisir entre 10-20 colonies individuelles, inoculer mL 2 LB/ampicilline cultures et une plaque d’ampicilline comme une plaque de stock (pour être utilisé comme un clone positif plus tard). Cultiver des cultures liquides avec agitation O/N à 37 ° C. Incuber la plaque O/N à 37 ° C.</li>
		<li>Sceller la plaque avec parafilm et magasin à 6 ° C.</li>
		<li>Isoler l’ADN plasmidique des cultures liquides à l’aide d’un kit d’isolation de plasmide.</li>
		<li>Effectuer l’analyse de l’ADN plasmidique isolée de colonies résistantes à l’ampicilline avec XhoI enzyme de restriction. Pour chaque clone, préparer le mélange de la réaction suivante : 0,5 µL XhoI, 2,5 µL de tampon de x 10, 1 µL l’ADN plasmidique (0,5 µg) et 21 µL H2O. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C. Analyser le résultat de la réaction de restriction en exécutant la réaction sur un gel d’agarose à 1 %. Remarque : L’analyse de Restriction du vecteur WT clivé par XhoI va générer 3 fragments : 8 447, 1 800 et 200 bp. La séquence de stuffer en Tet-pLKO-puro vecteur de 1 800 bp n’est pas présent dans les clones positifs contenant shARN-PAI-1 et le digest XhoI se traduira par des fragments d’ADN de taille : 8 447, 190 et 130 bp. Tel qu’illustré à la Figure 1, les 2 000 PB ne se trouve pas dans l’ADN isolé du nombre de colonies résistantes à l’ampicilline : 3, 8 et 11. Selon la conception d’oligonucléotides, la longueur et le nombre de fragments obtenus dans l’ADN de colonies positives peuvent varier.</li>
		<li>Vérifier l’insertion correcte des séquences shARN dans le vecteur de Tet-pLKO-puro par séquençage8,9.</li>
		<li>Ensemencer 100 mL culture LB/ampicilline avec la colonie contenant le clone correct et croître O/N à 37 ° C.</li>
		<li>Isoler l’ADN de plasmide à l’aide d’un kit d’isolation de plasmide.</li>
	</ol></li>
	<li>Génération de particules lentivirus.
	<ol>
<li>Enduire un plat de culture de tissu de 15 cm avec la Poly-L-Lysine en recouvrant la surface du plat avec une solution d’eau stérile de 0,01 % Poly-L-Lysine et en incubant à RT pendant 15 min. Retirer la solution par aspiration et sécher la vaisselle.</li>
		<li>Semences 5 x 106 293 de rein embryonnaire humain cellules (HEK293) dans le plat de la Poly-L-Lysine-enduit de 15 cm, et la culture dans un milieu d’aigle modifié de Dulbecco Medium (DMEM) additionné de 10 % de SVF et 1 % mélange de pénicilline/streptomycine (Pen/Strep) à 37 ° C, 5 % CO 2 avant d’avoir atteint 70 % confluence.</li>
		<li>Pour produire des particules virales, transfecter les cellules HEK293 avec imprimante pLKO-Tet-sur-shARN 25 µg, 25 µg psPAX, (emballage plasmide) et 5 µg pMD2.G plasmides (plasmide exprimant son enveloppe) utilisant le réactif de transfection. Remarque : les plasmides psPAX et pMD2.G sont un cadeau du laboratoire Didier Trono (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne, Suisse).</li>
		<li>Induire les cellules HEK293 le lendemain en changeant le milieu DMEM additionné de 10 mM de sodium butyrate et 20 mM HEPES pH 7,2 et culture pendant 8 h.</li>
		<li>Laver les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et ajouter 25 mL de frais DMEM moyen contenant 20 mM 4 acide-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES) pH 7,2. Après incubation à 37 ° C pendant 48 h, soigneusement recueillir le milieu contenant du virus en pipettant également ; éviter les déversements.</li>
		<li>Le support collecté de filtration à travers un filtre de seringue de 0,45 µM pour éliminer les cellules HEK293. Le support contenant des particules virales peut être utilisé immédiatement ou stocké à-80 ° C pour une utilisation ultérieure.</li>
	</ol></li>
	<li>Génération de cellules transfectées stablement
	<ol>
<li>HCT116 cellules de cancer du côlon et les cellules MDA-MB-231 mammaires cancéreuses à 50 000 cellules/puits dans le milieu DMEM additionné de 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % de semences Pen/Strep dans une plaque de 12 puits. Incuber à 37 ° C à 5 % de CO2 jusqu'à ce que les cellules soient confluente de 60-70 %.</li>
		<li>Laver les cellules avec du PBS et ajouter 1 mL de contenant le virus moyen au cancer des cellules et incuber O/N à 37 ° C à 5 % de CO2. Comme contrôle, ajouter 1 mL de milieu DMEM frais additionné de 10 % de SVF et 1 % Pen/Strep à 2 puits avec les cellules cancéreuses.</li>
		<li>Retirer délicatement le milieu contenant du virus par aspiration. Laver les cellules avec du PBS et modifier le milieu DMEM avec 10 % (v/v) exempt de tétracycline FBS (Tet-libre) et 1 % Pen/Strep.</li>
		<li>Après 72 h, laver les cellules avec du PBS et remplacez le milieu DMEM 10 % exempt de Tet FBS 1 % Pen/Strep, puromycine de 1 µg/mL pour la sélection des cellules transfectées virus.<ol>
<li>Selon la lignée cellulaire utilisée, ajuster la concentration de puromycine pour une sélection optimale en testant la gamme des concentrations de puromycine (0,1, 0,5, 1, 2 et 5 µg/mL) dans les cellules non-transduites et choisir la plus faible concentration où ne survivre aucune cellule de contrôle après 3 jours de culture.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sélectionnez les cellules transduites-virus en cultivant des cellules en présence de puromycine de 3 à 14 jours. En tant que contrôles, préparer deux puits supplémentaires avec les cellules non-transduites, une avec un milieu contenant la puromycine et l’autre sans la puromycine. Observer partielle mise à mort des cellules par la puromycine dans le puits avec cellules transduites-virus par rapport aux puits de contrôle. Remarque : Les cellules transduites Non ne croîtront pas en présence de la puromycine.</li>
		<li>Vérifier l’efficacité de la KD conditionnelle dans le cancer du côlon de HCT116 résistant à la puromycine et les cellules MDA-MB-231 mammaires cancéreuses. Remarque : La concentration efficace de doxycycline variera selon la lignée cellulaire utilisée et doit être titrée (typiquement de 100 ng/mL à 2 µg/mL).<ol>
<li>Déterminer la concentration de doxycycline qui n’est pas toxique pour les cellules mais efficace dans la diminution de l’expression de la protéine d’intérêt. Dans ce protocole, 1 µg/mL a été avec succès utilisés in vitro.</li>
			<li>La culture des cellules pendant 72 h en présence et en absence de doxycycline µg/mL 0,1, 1 et 2. Vérifier le niveau d’expression de la protéine diminuée (en l’occurrence, PAI-1) dans le lysat cellulaire par Western blot analyse. Comparer les cellules HCT116 et MDA-MB-231 conditionnellement exprimant shARN d’hématies brouillés.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation du milieu conditionné
	<ol>
<li>Semences 1 x 106 cellules transfectées de façon stable avec la doxycycline réglé lentivirus contenant pLKO-shARN dans les plats de 10 cm.</li>
		<li>Cultiver des lignées de cellules dans un milieu de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) avec 10 % exempt de Tet FBS et 1 % Pen/Strep en absence et en présence de 1 doxycycline µg/mL pendant 72 h à 37 ° C à 5 % de CO2, ajout de doxycycline frais tous les jours. Remarque : Milieu RPMI est compatible avec les conditions de culture des monocytes. La doxycycline est un léger composé sensible. Protéger les cultures cellulaires de la lumière en revêtement de papier d’aluminium et éviter de travailler sous l’exposition à la lumière directe.</li>
		<li>Recueillir le milieu en pipettant également, filtrer sur un filtre de 0,45 µm et congeler à-80 ° C dans les parties aliquotes.</li>
	</ol></li>
</ol>2. isolement des Monocytes du sang humain
<ol><li>Isoler les monocytes du sang périphérique humain. Remarque : Des monocytes humains primaires sont isolées de 7 mL de globules blancs concentrés dans un filtre de leucocytes provenant de donneurs de plaquettes en bonne santé. Selon le donateur, un filtre de leucocyte se produit entre 1 x 109 et 2 x 109 de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC), environ 10 %, qui constituent des monocytes.<ol>
<li>Préparer le poste de travail dans le flux laminaire.</li>
		<li>Stériliser les ciseaux et le flux laminaire avec la lumière ultraviolette (UV) pendant 30 min.</li>
		<li>Vaporiser le filtre de leucocytes avec 70 % EtOH et séchage à l’air à l’intérieur du flux laminaire.</li>
		<li>Couper les deux extrémités du filtre leucocytes avec des ciseaux et vider le contenu du filtre dans un tube de 50 mL.</li>
		<li>Diluer à 90 mL en ajoutant PBS contenant 1 % (v/v) de SVF (PBS/BF).</li>
		<li>Préparer les tubes de 3 x 50 mL avec 15 mL de solution gradient de densité. Couche lentement 30 mL de sang de PBS/FBS dilué sur la densité de gradient solution utilisant un pipeteur mises sur le flux gravitationnel pour éviter le mélange des couches.</li>
		<li>Centrifuger à un rotor de swing à 400 x g à RT sans freins pendant 25 min.</li>
		<li>Jeter la couche supérieure et transférer la couche intermédiaire contenant les PBMC à un tube frais 50 mL.</li>
		<li>Ajouter QUE PBS/FBS jusqu'à 50 mL et centrifuger à x 120 g à RT pendant 10 min. Retirez le surnageant contenant des plaquettes. Répétez cette étape deux fois plus.</li>
		<li>Resuspendre le culot dans 50 mL de PBS/FBS et compter les PBMC utilisant un hémocytomètre. Centrifuger à 120 g à RT et Resuspendre le culot dans PBS/FBS contenant 1 mM d’acide tétraacétique (EDTA) (PBS/FBS/EDTA) à une concentration finale de 5 x 107 cellules/mL.</li>
		<li>Utiliser un kit de sélection négative pour enrichir les monocytes par épuisement des cellules non-monocytaire. Remarque : Le kit de sélection négative utilise un cocktail d’anticorps (CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123 et glycophorine A) T cellules NK cellules, neutrophiles, B cellules, granulocytes et érythrocytes. Les complexes anticorps se lient à la surface de ces cellules non-monocytaire et les particules magnétiques de dextran. Lorsque le tube est placé dans un aimant, les perles adhérant aux parois du tube et retirer les cellules non-monocytaire de la solution.<ol>
<li>Ajouter 50 µL de l’anticorps cocktail dans 1 mL de 5 x 107 PBMC/mL, mélanger avec une pipette et incuber pendant 10 min à billes magnétiques de RT. Ajouter 50 µL des PBMC avec l’anticorps cocktail, mélanger avec une pipette et incuber pendant 10 min à température ambiante.</li>
			<li>Ajouter PBS/FBS/EDTA jusqu'à 25 mL et lieu le mélange PBMC dans un aimant qui peut recevoir un tube de 50 mL. Incuber pendant 10 min à RT. magnétique perles vont adhérer aux parois du tube et séquestrer les cellules non-monocytaire de la solution.</li>
		</ol>
</li>
		<li>À l’aide d’une pipette 25 mL, supprimer la solution contenant les monocytes du tube dans l’aimant. Veillez à ne pas toucher les parois du tube à l’aide de la pipette.</li>
		<li>Centrifuger la solution à 250 x g à RT, éliminer le surnageant et Resuspendre le culot contenant les monocytes dans le milieu RPMI contenant 10 % exempt de Tet FBS et 1 % Pen/Strep.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Boyden chambre Migration test
<ol><li>Préparer la solution d’albumine sérique bovine (BSA) 1 % (p/v) dissoudre 1 g de BSA dans 100 mL d’eau ultrapure et filtrer à travers une taille de pores de 0,2 µm pour stériliser.</li>
	<li>Incuber les inserts membrane poreuse en solution de BSA stérile 1 % O/N pour une meilleure adhérence des macrophages à la membrane. Pour les monocytes/macrophages, utilisez 5-8 µm pore taille insertions.<ol>
<li>Remplir une boîte de Petri stérile tissu avec la solution de BSA 1 % et placer les inserts dans le plat. Appliquer 200 µL de solution de BSA 1 % à l’intérieur de l’insert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laver les plaquettes deux fois en les plaçant dans un plat rempli de PBS stérile et PBS s’appliquant à l’intérieur du filtre.</li>
	<li>40 000 cellules HCT116 ou MDA-MB-231 dans un milieu RPMI 0,5 mL contenant 10 % exempt de Tet FBS et 1 % de semences Pen/Strep / puits, dans une plaque 24 puits, en trois exemplaires. Sinon, placer 0,5 mL de milieu conditionné généré précédemment dans le puits comme source de facteur chimiotactique.</li>
	<li>Le lendemain, monocytes plaque 8 000 dans les préparés insérer en volume de 0,3 mL du milieu RPMI contenant 10 % exempt de Tet FBS et 1 % Pen/Strep, en triple exemplaire et incuber à 37 ° C à 5 % de CO2.</li>
	<li>Recueillir les inserts après 48 h. Remarque : La longueur d’une expérience doit être optimisée selon les conditions spécifiques et les cellules utilisées, en effectuant une expérience temporelle où les insertions sont collectées à des moments différents de l’incubation.<ol>
<li>Secouez l’excès du milieu et de glisser avec précision la surface intérieure avec un coton-tige pour éliminer les cellules qui n’ont pas migré.</li>
		<li>Colorer le côté extérieur des inserts à l’aide de la méthode Wright-Giemsa.</li>
		<li>Soigneusement monter 3 inserts/lame dans une huile d’immersion de microscope de haute viscosité, en vous assurant que le côté du filtre avec des macrophages migrés vers le haut.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Les diapositives à l’aide d’un microscope optique avec objectif 20 X de l’image. Prendre des photos des champs 9/filtre. Compter des macrophages migrés dans 9 domaines/filtre.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Composé d’une variété de types de cellules, le TME est crucial pour le développement du cancer. Afin de déterminer les conditions optimales de croissance, les cellules cancéreuses attirent les monocytes par sécrétion de facteurs chimiotactiques. Nous présentons ici un protocole pour l’étude du mécanisme de recrutement de monocytes par des cellules tumorales in vitro. À cette fin, une combinaison de système d’expression de gène inductible, purification des monocytes humains primaires et à titre d’exemple d’un tes...

Macrophages (EAPV) de la tumeur associée contribuent au développement de la tumeur en favorisant la croissance des tumeurs, métastases et régulation de la réponse immunitaire2. Monocytes inflammatoire recrue, qui infiltrent la tumeur et se différencient en pro-tumorigènes TAMs3en cellules cancéreuses. Infiltration de la tumeur avec TAMs est en corrélation avec des résultats cliniques pauvres et a été liée au rôle immunosuppresseur sur les macrophages4,5. Cependant, les mécanismes du recrutement de macrophages à la tumeur ne sont pas bien explorés et une meilleure compréhension des voies impliquées est cruciale pour davantage d’avancement du champ et de thérapies prometteuses. Un des défis dans l’étude des interactions entre cellules tumorales et des cellules normales dans le microenvironnement tumoral (TME) est la complexité des mécanismes et des cellules impliquées, nécessitant des approches in vitro permettant la dissection de la diaphonie. Nous présentons ici une méthodologie polyvalente qui peut être appliquée à l’étude de l’effet paracrine d’un cancer en culture cellulaire, la protéine sécrétée sur la migration des autres types de cellules comme les macrophages, in vitro. En utilisant un système où l’expression de la shARN contre une protéine de culture cellulaire du cancer impliquée dans le recrutement des monocytes est sous le contrôle du promoteur inductible tétracycline, l’effet paracrine de la protéine sécrétée sur des monocytes est quantifié. Dans ce protocole, clonage des séquences de shARN dans la tétracycline réglementée vecteur est présenté suivie de génération de lignées cellulaires cancéreuses stable. En outre, la purification des monocytes humains primaires et un dosage de chambre de Boyden servent à analyser l’effet paracrine d’une protéine dérivée de cellules cancéreuses sur la migration des monocytes.
Diminution de l’expression des gènes de codage de protéine est couramment appliquée par des techniques siRNA et shARN, mais non sans restrictions dans son utilisation. La précipitation à long terme (KD) des gènes peut-être déclencher des réactions adaptatives secondaires de cellules qui interfèrent avec les résultats expérimentaux. Absence de contrôle temporel sur l’expression génique rend difficile d’étudier le rôle dynamique d’une protéine avec le temps ou le rôle d’une protéine cruciale pour la survie des cellules. Cette question est particulièrement importante dans in vivo des paramètres, où le rôle d’une protéine dans le développement de tumeurs et la progression peut nécessiter une diminution de l’expression de la protéine d’intérêt seulement après que tumeur est établie. KD conditionnel présente l’avantage d’éviter un effet létal trop tôt de la KD sur les cellules et pour permettre l’analyse du rôle de la protéine dans les différentes étapes de la croissance de la tumeur, tandis que KD inconditionnelle pourrait entraîner en l’absence de développement de la tumeur.
Un certain nombre de systèmes de KD conditionnels ont été développé pour traiter les restrictions de KD stable. Les systèmes d’expression de gène conditionnelle incluent inductibles par l’Ecdysone surexpression systèmes, le Cytochrome P-450 induction système1, et tétracycline régulé systèmes d’expression de gène. Les systèmes d’expression génique réglé par la tétracycline permettent un contrôle sur l’expression de la shARN lors de l’addition de l’antibiotique tétracycline (ou son analogue plus stable - doxycycline). Dans les systèmes de Tet-ON, l’expression des shARN est induite en présence de tétracycline/doxycycline, résultant en une expression de gène KD, tandis que dans les systèmes de Tet-OFF, l’expression de shARN est supprimée en présence de tétracycline, ayant pour résultat l’expression des gènes. Un inconvénient du système inductible par la tétracycline est rapportés précédemment à faibles niveaux d’expression des shARN en l’absence de doxycycline - perméabilité dite6,7. Dans le Tet-ON système décrit ici, par voie de tétracycline, la liaison de la protéine de répresseur (Tite) tétracycline constitutivement exprimé à la séquence d’éléments (TRE) Tet-sensible dans le H1 est de la région promotrice de la shARN d’intérêt supprimée. Cela se traduit par l’expression de shARN et inhibition de la traduction de la protéine d’intérêt dans une façon dépendante de la tétracycline8,9.
Autres systèmes de Tet-ON disponibles incluent simultanée knock-in de la TetO séquence entre boîte TATA et élément de séquence proximale (PSE) et entre la transcription et de la boîte TATA start site développé par Chan et al.. 10 ce système nécessite moins de doses toxiques de tétracycline pour réguler l’expression de shARN, toutefois, soumis à l’état non induite, de faibles niveaux de shARN sont exprimés. La boîte Krüppel-associés (KRAB) fondé Tet-ON système11 comprend KRAB, une protéine de doigt de zinc, qui sujets gènes situés dans un rayon de 3 Ko de l’accepteur KRAB à répression transcriptionnelle. La protéine chimère tTRKRAB pouvez lier à TetO, et en raison de la large-gamme de capacité contrôlable de l’ADN, TetO ne doivent être limité entre la transcription démarrer le site et le promoteur et ont faible impact sur l’activité du promoteur. En vertu de l’état non induite, ce système de brouillage de RNA contrôlable a été signalé à montrer un niveau inférieur d’expression fuite de shARN11,12; Cependant, elle nécessite une approche séquentielle, deux vecteurs de clonage. Par rapport aux systèmes KD développés antérieurement conditionnelles comme l’Ecdysone inductibles par système de surexpression ou système d’induction du Cytochrome P-450, le système réglé par la tétracycline a l’avantage de sa robustesse et de la réversibilité et par conséquent est les plus couramment utilisés système13. Le système utilisé dans le présent protocole a l’avantage sur la TetO knock-in bicourant et système KRAB Tet-ON que requiere clonage avant droite, seul vecteur, ce qui permet la génération rapide de plusieurs clones, et il présente des niveaux très bas de perméabilité dans le absence de doxycycline.
TME est essentiel pour le développement du cancer. Pour faciliter la croissance de la tumeur, les cellules cancéreuses recrutent des monocytes inflammatoires en sécrétant des protéines chimiotactiques. Monocytes recrutés s’infiltrer dans la tumeur et se différencient en pro-tumorigènes TAMs qui contribuent à la croissance des tumeurs et des métastases. Des études in vitro du recrutement des cellules immunitaires utilisent les tests de migration, avec Boyden, test de chambre étant largement utilisé14,15,16,17. Dans ce test, la source de protéine facteur chimiotactique, par exemple, les cellules cancéreuses, ou une protéine purifiée, est placée dans le bas du réservoir. Les cellules immunitaires sont placés dans la chambre haute, séparée par une membrane poreuse du compartiment inférieur. Migrer vers la pente croissante du facteur chimiotactique et ceux que l'on trouve sur la face inférieure de la membrane des cellules sont colorées et comptés sous le microscope. Ici, nous testons la fonction de facteur chimiotactique des PAI 1 (PAI-1) sur les monocytes en générant des lignées cellulaires de cancer stable, inductible où expression de PAI-1 est régulée par l’addition de la doxycycline. Nous utilisons des monocytes humains primaires dans le test de migration de chambre de Boyden pour évaluer le rôle de PAI-1 dans la migration des monocytes. Différences entre des monocytes humains primaires et lignées monocytaire largement utilisé comme THP1 ont été signalés et incluent l’expression de différentes cytokines modèles18; par exemple, 5 à 10 fois plus dans les niveaux d’expression de TNF-α par les cellules THP1 par rapport aux monocytes humains19. Les cellules THP1 proviennent des cellules de la leucémie humaine monocytaire, sont faciles à entretenir et se multiplient avec une moyenne de temps de 50-19 h20. Au contraire, les monocytes humains sont caractérisés par une durée de vie courte en l’absence de facteurs de croissance. Étant donné que les monocytes sont purifiées à partir de sang de donneurs, une bonne quantité de variabilité se produit entre les individus et selon la méthode de purification, contamination avec les autres types de cellules peut se produire. Néanmoins, monocytes primaires sont pertinentes et il a été recommandé d’utiliser ou de confirmer les résultats obtenus avec les lignées monocytaire utilisant des monocytes primaires dans la recherche biologique,19. Nous décrivons ici un protocole pour la purification des humains primaires monocytes du sang périphérique. Autres méthodes de purification de monocyte incluent les protocoles adhésion et gradient de densité et de la procédure en deux étapes avec seul gradient de Ficoll-Hypaque suivie d’un gradient de Percoll21. La pureté de la population de monocyte obtenue par ces gammes de méthodes entre 70 et 90 %. La méthode décrite ici utilise un gradient de densité, suivi d’une sélection immunitaire négative22 et permet la purification des monocytes humains sans contact direct avec des anticorps, ainsi pour éviter leur activation accidentelle et résultant en un > 95 % population pure des monocytes.
Le protocole présenté ici est utilisé pour la mise en place d’un système fonctionnel de Tet-ON pour l’expression des gènes KD en lignées cellulaires cancéreuses humaines pour étudier l’effet chimiotactique de la protéine sécrétée dérivé du cancer PAI-1 sur les monocytes. PAI-1 est surexprimé par une variété de tumeurs et de son expression paradoxalement en corrélation avec des résultats cliniques pauvres23,24. Le rôle de pro-tumorigène de PAI-1 est le résultat de ses pro-angiogénique et anti-apoptotique fonctions25,26. PAI-1 s’est avéré contribuent à l’inflammation en favorisant le recrutement de macrophages sur le site de l’inflammation,27. PAI-1 a été montré pour promouvoir le muscle lisse cellmigration28,29 et de participer à la Mac-1 charge macrophage migration30. Surexpression de PAI-1 a été également démontrée à améliorer considérablement le recrutement de macrophages Raw 264.7 dans B16F10 mélanome tumeurs31. Cependant, le rôle de PAI-1 dans la migration de TAM n'a pas été étudié en détail. Le protocole décrit nous permet de répondre à la question de savoir si PAI-1 attire les monocytes, cellules cancéreuses. Cette méthodologie permettant une dissection de la diaphonie entre la tumeur et TME en faisant taire la protéine sécrétée dans les cellules cancéreuses et en analysant les composants de la TME.

<table><tbody><tr><td>Vecteur lentiviral Tet-pLKO-puro</td><td>Addgene</td><td>21915</td><td></td></tr><tr><td>FBS (sans tétracycline)</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-15</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>10771-500ML</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Kit d’enrichissement de monocytes humains</td><td>StemCell</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>StemCell</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI HF</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>AgeI HF</td><td>NEB</td><td>R3552S</td><td></td></tr><tr><td>Cut Smart buffer</td><td>NEB</td><td>B7200S</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System</td><td>PROMEGA</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>psPAX vector</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G vector</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl3 Chimiquement compétent E. coli</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>Hema 3 kit de coloration pour protocole de coloration Wright-Giemsa</td><td></td><td>123-869</td><td></td></tr><tr><td>cellules HEK293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Enzyme de restriction XhoI</td><td>NEB</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tampon Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R1021</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>The Big Easy" EasySep</td><td>Magnet Stem Cell</td><td>18001</td><td></td></tr><tr><td>0,1 % Poly-L-Lysine solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Acétate</td><td>de sodium Sigma-Aldrich</td><td>S7670</td><td></td></tr><tr><td>Butyrate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu ; Filtres à seringue M</td><td>VWR International</td><td>28145-479</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500g</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris)</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-5 kg</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td>dithioérythritol (DTE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8255-5g</td><td></td></tr><tr><td>éthanol (EtOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792780</td><td></td></tr><tr><td>tryptone</td><td>Amresco</td><td>J859-500g</td><td></td></tr><tr><td>extrait de levure</td><td>Fluka</td><td>70161-500g</td><td></td></tr><tr><td>Bacto</td><td>agar BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>ampicilline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9393-5g</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>puromycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620</td><td></td></tr><tr><td>Hyclate de doxycycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-25g</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R1021</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Support perméable pour plaque à 24 puits avec 8,0&mu ; m Membrane PET Transparente</td><td>Becton Dickinson</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>Albumine Sérique Bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Applicateur à pointe de coton&nbsp ;</td><td>Medline</td><td>MDS202000</td><td></td></tr><tr><td>Protocol Hema 3 STAT pack&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>123-869</td><td></td></tr><tr><td>Huile d’immersion Resolve, haute viscosité</td><td>Richard Allan Scientific</td><td>M4004</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr></tbody></table>

knockdown conditionnel de l’expression génique dans les lignées de cellules cancéreuses pour étudier le recrutement des monocytes/macrophages pour le microenvironnement tumoral

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

siARN et médiation shARN démantelez méthodes (KD) de régulation de l’expression des gènes sont des outils précieux pour comprendre la fonction de gènes et des protéines. Toutefois, dans le cas que le KD de la protéine d’intérêt a un effet létal sur les cellules ou les effets anticipés de la KD sont dépendante du temps, inconditionnels des méthodes KD ne conviennent pas. Conditionnelles systèmes conviennent mieux dans ces cas et ont fait l’objet de beaucoup d’intérêt. Il s’agit de systèmes de surexpression inductible par l’Ecdysone, Cytochrome P-450 induction système1, et la tétracycline régulé systèmes d’expression de gène.
Le système d’expression de gène tétracycline réglementé permet contrôle réversible surexpression de la protéine par induction de l’expression de shARN en présence de tétracycline. Dans ce protocole, nous présentons un modèle expérimental à l’aide de système fonctionnel de Tet-ON dans les lignées cellulaires cancéreuses humaines conditionnelle règlement d’expression de gène. Ensuite, nous montrent l’utilisation de ce système dans l’étude de l’interaction cellule-monocyte tumeur.

Trois séquences de shARN ont été testés pour le KD plus efficace de PAI-1. Pour ce faire, séquences de shARN contre PAI-1 et brouillés (tableau 1) ont été clonées dans le vecteur d’expression de Tet-pLKO-puro suivant le protocole décrit ci-dessus. La lignée de cellules HT-1080 Fibrosarcome a été transfectée stablement avec constructions générées et les cellules ont été traitées avec la doxycycline pendant 3 jours. L’expression du PAI-1 a été vérifiée par Western Blot <str...

Ce protocole sert un régime pour la mise en place d’un système fonctionnel de Tet-ON dans les lignées cellulaires cancéreuses et leur utilisation ultérieure, en particulier pour étudier le rôle des protéines de culture cellulaire tumorale dans le recrutement des monocytes/macrophages pour le microenvironnement tumoral.

Knockdown conditionnel de l’Expression génique dans les lignées de cellules cancéreuses pour étudier le recrutement des Monocytes/Macrophages pour le microenvironnement tumoral

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

L’ensemble de ce protocole consiste à utiliser l’inhibition conditionnelle de l’expression génique dans les cellules cancéreuses pour étudier le recrutement des monocytes et des macrophages dans le microenvironnement tumoral in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du microenvironnement tumoral concernant la nature du stock croisé entre les cellules cancéreuses et les cellules du système immunitaire. Le principal avantage de cette technique est que le système utilisé ici nécessite un clonage à vecteur unique, permet la génération rapide de plusieurs clones et présente de très faibles niveaux d’épaisseur.Une méthode de purification des monocytes humains sans contact direct avec des anticorps a également été démontrée, ce qui permet d’éviter l’activation accidentelle tout en permettant d’obtenir une population de monocytes humains purs à plus de 95 %. Pour produire des particules virales, transfectez 70 % de boîtes confluentes de 150 millimètres de cellules HEK-293 avec 25 microgrammes de shRNA pLKO-tet-on, 25 microgrammes du plasmide d’emballage psPAX et cinq microgrammes du plasmide exprimant l’enveloppe pMD2. G en utilisant le réactif de transfection conformément aux protocoles standard.Ajoutez le mélange dans les plats de 150 millimètres. Le lendemain, induisez la production de lentiviral dans les cellules en changeant le milieu en DMEM complété par 10 millimolaires de butyrate de sodium et 20 millimolaires HEPES. Cultiver pendant huit heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.Après huit heures, lavez les cellules avec du PBS et ajoutez 25 millilitres de milieu DMEM frais avec 20 millimolaires d’HEPES et sans butyrate de sodium. Après une incubation de 48 heures, prélever soigneusement le milieu contenant le virus à l’aide d’une pipette. Pour générer des lignées cellulaires stables, commencez par ensemencer des cellules cancéreuses du côlon HCT-116 et des cellules cancéreuses du sein MDA-MB-231 dans une plaque à 12 puits et 50 000 cellules par puits.Incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Lorsque les cellules sont confluentes à 60-70 %, lavez-les avec du PBS et ajoutez un millilitre de milieu contenant le virus dans chaque puits. Le lendemain, retirez soigneusement le milieu contenant le virus par aspiration.Ensuite, après avoir lavé les cellules avec du PBS, ajoutez un milieu contenant du FBS sans tétracycline. Après 72 heures, laver les cellules comme précédemment et ajouter un milieu complété par un microgramme par millilitre de puromycine pour la sélection des cellules transfectées par le virus. Sélectionner des cellules transduites par le virus en cultivant des cellules en présence de puromycine pendant trois à 14 jours.Observez la destruction partielle des puits par la puromycine dans les cellules avec des cellules transduites par le virus. Les cellules non transduites ne se développeront pas en présence de puromycine. Lorsque ces cellules témoins sont mortes, continuez la culture des lignées cellulaires régulées conditionnellement pendant deux semaines en présence d’antibiotiques pour créer les lignées cellulaires régulées conditionnellement.Vérifiez l’efficacité de l’inactivation conditionnelle dans les cellules cancéreuses du côlon HCT-116 résistantes à la puromycine et MDA-MB-231 du cancer du sein en ajoutant un milieu avec différentes concentrations de doxycycline et en cultivant les cellules pendant 72 heures. Après avoir préparé le lysat cellulaire, vérifiez le niveau d’inactivation par transfert Western. Les niveaux de PAI-1 sont indiqués ici.Pour isoler les monocytes du sang périphérique, préparez d’abord trois tubes de 50 millilitres contenant 15 millilitres de solution à gradient de densité. Ensuite, utilisez un contrôleur de pipette réglé sur le flux gravitationnel pour superposer lentement 30 millilitres de sang dilué sur la solution à gradient de densité. Centrifugeuse dans un rotor oscillant à 400 g à température ambiante sans interruption pendant 25 minutes.Après la centrifugation, éliminez la couche supérieure et transférez la couche intermédiaire contenant les cellules mononucléées du sang périphérique dans un tube frais de 50 millilitres et ajoutez du PBS complété par FBS jusqu’à 50 millilitres. Centrifuger à 120 g à température ambiante pendant 10 minutes. Après l’essorage, retirez le surnageant contenant des plaquettes.Après la centrifugation finale et la collecte, remettre en suspension la pastille dans 50 millilitres de PBS complété par FBS et compter les cellules mononucléées du sang périphérique à l’aide d’un hémocytomètre. Après avoir centrifugé les cellules à 120 g, remettre en suspension la pastille dans du PBS supplémenté en FBS contenant un EDTA millimolaire jusqu’à une concentration finale de 50 millions de cellules par millilitre. Ensuite, commencez à enrichir les monocytes en ajoutant 50 microlitres de cocktail d’anticorps à sélection négative pour chaque millilitre de suspension cellulaire et mélangez.Incuber 10 minutes à température ambiante. Après l’incubation, ajoutez 50 microlitres de billes magnétiques par millilitre, mélangez et incubez pendant encore 10 minutes. Ajoutez ensuite du PBS avec FBS et EDTA jusqu’à 25 millilitres et placez le mélange mononucléaire de sang périphérique dans un aimant pouvant accueillir un tube de 50 millilitres.Après une incubation de 10 minutes à température ambiante, les billes magnétiques vont adhérer aux parois du tube et séquestrer les cellules non monocytaires de la solution. À l’aide d’une pipette de 25 millilitres, prélevez la solution contenant des monocytes du tube en prenant soin de ne pas toucher les côtés du tube avec la pipette. Après centrifugation et élimination du surnageant, remettre en suspension la pastille contenant des monocytes dans un milieu RPMI contenant 10 % de FBS sans TET et 1 % de pen-streptocoque.Commencer l’essai en ensemenceant 40 000 cellules HCT-116 ou MDA-MB-231 dans un volume de 0,5 millilitre dans les puits d’une plaque de 24 puits en trois exemplaires. Le lendemain, ajoutez un filtre dans le puits. Ensuite, plaquez 8 000 monocytes dans un volume de 0,3 millilitre sur un insert de membrane poreuse traité BSA placé sur le dessus des cellules cancéreuses et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.Récupérez les inserts après 48 heures. Secouez l’excès de milieu et balayez avec précision la surface intérieure avec un applicateur à bout de coton pour éliminer les cellules qui n’ont pas migré. Teindre la face extérieure de l’insert à l’aide de la méthode Wright-Giemsa.Après avoir monté les filtres avec les macrophages migrés vers le haut, imagez les lames à l’aide d’un microscope optique avec un objectif de puissance 20. Prenez des photos de neuf champs par filtre et comptez les macrophages migrés dans tous les champs. Le test de la chambre de Boyden a été utilisé pour quantifier la migration des monocytes vers les cellules cancéreuses.En présence de cellules cancéreuses du sein MDA-MB-231, la migration des monocytes a été inhibée de 33 % après l’ajout de doxycycline à la co-culture pour réguler à la baisse PAI-1. Cette inhibition de la migration des monocytes était plus prononcée en présence de cellules cancéreuses du côlon HCT-116 où l’inactivation de PAI-1 par l’administration de doxycycline réduisait la migration des monocytes de 74 %. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser un système tet-on fonctionnel pour l’inactivation de l’expression génique dans les lignées cellulaires cancéreuses humaines afin d’étudier l’effet chimioattractant de la protéine sécrétée PAI-1 dérivée du cancer sur les monocytes humains.

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Découvrez le knockdown conditionnel de l'expression génique dans les lignées de cellules cancéreuses pour étudier le recrutement des monocytes et macrophages dans le microenvironnement tumoral.

Knockdown conditionnel de l’Expression génique dans les lignées de cellules cancéreuses pour étudier le recrutement des Monocytes/Macrophages pour le microenvironnement tumoral (Vidéo) | JoVE Journal

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