Knockdown conditionnel de l’Expression génique dans les lignées de cellules cancéreuses pour étudier le recrutement des Monocytes/Macrophages pour le microenvironnement tumoral

L’ensemble de ce protocole consiste à utiliser l’inhibition conditionnelle de l’expression génique dans les cellules cancéreuses pour étudier le recrutement des monocytes et des macrophages dans le microenvironnement tumoral in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du microenvironnement tumoral concernant la nature du stock croisé entre les cellules cancéreuses et les cellules du système immunitaire. Le principal avantage de cette technique est que le système utilisé ici nécessite un clonage à vecteur unique, permet la génération rapide de plusieurs clones et présente de très faibles niveaux d’épaisseur.

Une méthode de purification des monocytes humains sans contact direct avec des anticorps a également été démontrée, ce qui permet d’éviter l’activation accidentelle tout en permettant d’obtenir une population de monocytes humains purs à plus de 95 %. Pour produire des particules virales, transfectez 70 % de boîtes confluentes de 150 millimètres de cellules HEK-293 avec 25 microgrammes de shRNA pLKO-tet-on, 25 microgrammes du plasmide d’emballage psPAX et cinq microgrammes du plasmide exprimant l’enveloppe pMD2. G en utilisant le réactif de transfection conformément aux protocoles standard.

Ajoutez le mélange dans les plats de 150 millimètres. Le lendemain, induisez la production de lentiviral dans les cellules en changeant le milieu en DMEM complété par 10 millimolaires de butyrate de sodium et 20 millimolaires HEPES. Cultiver pendant huit heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Après huit heures, lavez les cellules avec du PBS et ajoutez 25 millilitres de milieu DMEM frais avec 20 millimolaires d’HEPES et sans butyrate de sodium. Après une incubation de 48 heures, prélever soigneusement le milieu contenant le virus à l’aide d’une pipette. Pour générer des lignées cellulaires stables, commencez par ensemencer des cellules cancéreuses du côlon HCT-116 et des cellules cancéreuses du sein MDA-MB-231 dans une plaque à 12 puits et 50 000 cellules par puits.

Incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Lorsque les cellules sont confluentes à 60-70 %, lavez-les avec du PBS et ajoutez un millilitre de milieu contenant le virus dans chaque puits. Le lendemain, retirez soigneusement le milieu contenant le virus par aspiration.

Ensuite, après avoir lavé les cellules avec du PBS, ajoutez un milieu contenant du FBS sans tétracycline. Après 72 heures, laver les cellules comme précédemment et ajouter un milieu complété par un microgramme par millilitre de puromycine pour la sélection des cellules transfectées par le virus. Sélectionner des cellules transduites par le virus en cultivant des cellules en présence de puromycine pendant trois à 14 jours.

Observez la destruction partielle des puits par la puromycine dans les cellules avec des cellules transduites par le virus. Les cellules non transduites ne se développeront pas en présence de puromycine. Lorsque ces cellules témoins sont mortes, continuez la culture des lignées cellulaires régulées conditionnellement pendant deux semaines en présence d’antibiotiques pour créer les lignées cellulaires régulées conditionnellement.

Vérifiez l’efficacité de l’inactivation conditionnelle dans les cellules cancéreuses du côlon HCT-116 résistantes à la puromycine et MDA-MB-231 du cancer du sein en ajoutant un milieu avec différentes concentrations de doxycycline et en cultivant les cellules pendant 72 heures. Après avoir préparé le lysat cellulaire, vérifiez le niveau d’inactivation par transfert Western. Les niveaux de PAI-1 sont indiqués ici.

Pour isoler les monocytes du sang périphérique, préparez d’abord trois tubes de 50 millilitres contenant 15 millilitres de solution à gradient de densité. Ensuite, utilisez un contrôleur de pipette réglé sur le flux gravitationnel pour superposer lentement 30 millilitres de sang dilué sur la solution à gradient de densité. Centrifugeuse dans un rotor oscillant à 400 g à température ambiante sans interruption pendant 25 minutes.

Après la centrifugation, éliminez la couche supérieure et transférez la couche intermédiaire contenant les cellules mononucléées du sang périphérique dans un tube frais de 50 millilitres et ajoutez du PBS complété par FBS jusqu’à 50 millilitres. Centrifuger à 120 g à température ambiante pendant 10 minutes. Après l’essorage, retirez le surnageant contenant des plaquettes.

Après la centrifugation finale et la collecte, remettre en suspension la pastille dans 50 millilitres de PBS complété par FBS et compter les cellules mononucléées du sang périphérique à l’aide d’un hémocytomètre. Après avoir centrifugé les cellules à 120 g, remettre en suspension la pastille dans du PBS supplémenté en FBS contenant un EDTA millimolaire jusqu’à une concentration finale de 50 millions de cellules par millilitre. Ensuite, commencez à enrichir les monocytes en ajoutant 50 microlitres de cocktail d’anticorps à sélection négative pour chaque millilitre de suspension cellulaire et mélangez.

Incuber 10 minutes à température ambiante. Après l’incubation, ajoutez 50 microlitres de billes magnétiques par millilitre, mélangez et incubez pendant encore 10 minutes. Ajoutez ensuite du PBS avec FBS et EDTA jusqu’à 25 millilitres et placez le mélange mononucléaire de sang périphérique dans un aimant pouvant accueillir un tube de 50 millilitres.

Après une incubation de 10 minutes à température ambiante, les billes magnétiques vont adhérer aux parois du tube et séquestrer les cellules non monocytaires de la solution. À l’aide d’une pipette de 25 millilitres, prélevez la solution contenant des monocytes du tube en prenant soin de ne pas toucher les côtés du tube avec la pipette. Après centrifugation et élimination du surnageant, remettre en suspension la pastille contenant des monocytes dans un milieu RPMI contenant 10 % de FBS sans TET et 1 % de pen-streptocoque.

Commencer l’essai en ensemenceant 40 000 cellules HCT-116 ou MDA-MB-231 dans un volume de 0,5 millilitre dans les puits d’une plaque de 24 puits en trois exemplaires. Le lendemain, ajoutez un filtre dans le puits. Ensuite, plaquez 8 000 monocytes dans un volume de 0,3 millilitre sur un insert de membrane poreuse traité BSA placé sur le dessus des cellules cancéreuses et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Récupérez les inserts après 48 heures. Secouez l’excès de milieu et balayez avec précision la surface intérieure avec un applicateur à bout de coton pour éliminer les cellules qui n’ont pas migré. Teindre la face extérieure de l’insert à l’aide de la méthode Wright-Giemsa.

Après avoir monté les filtres avec les macrophages migrés vers le haut, imagez les lames à l’aide d’un microscope optique avec un objectif de puissance 20. Prenez des photos de neuf champs par filtre et comptez les macrophages migrés dans tous les champs. Le test de la chambre de Boyden a été utilisé pour quantifier la migration des monocytes vers les cellules cancéreuses.

En présence de cellules cancéreuses du sein MDA-MB-231, la migration des monocytes a été inhibée de 33 % après l’ajout de doxycycline à la co-culture pour réguler à la baisse PAI-1. Cette inhibition de la migration des monocytes était plus prononcée en présence de cellules cancéreuses du côlon HCT-116 où l’inactivation de PAI-1 par l’administration de doxycycline réduisait la migration des monocytes de 74 %. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser un système tet-on fonctionnel pour l’inactivation de l’expression génique dans les lignées cellulaires cancéreuses humaines afin d’étudier l’effet chimioattractant de la protéine sécrétée PAI-1 dérivée du cancer sur les monocytes humains.