Fabrication et Validation d’un système d’orgue-on-chip avec électrodes intégrées à quantifier directement transendothéliale résistance électrique

L’objectif général de cette vidéo est de montrer comment fabriquer et utiliser des puces microfluidiques avec des électrodes intégrées pour les mesures de résistance électrique transendothéliale ou transépithéliale, ou mesures TEER. Ceci est démontré à l’aide d’une barrière hémato-encéphalique dans la puce microfluidique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des organes sur puce en permettant de mesurer directement la fonction barrière, par exemple, du tissu de la barrière hémato-encéphalique à l’aide d’électrodes intégrées.

Le principal avantage de notre technique est que les électrodes s’intègrent facilement dans les systèmes d’organe sur puce et que les résultats de celle-ci peuvent être comparés entre les différents systèmes. Les implications de cette technologie s’étendent à la compréhension de la fonction de la barrière hémato-encéphalique dans la santé et la maladie, la découverte de médicaments et la médecine personnalisée. Bien que cette méthode puisse être utilisée pour donner un aperçu de la fonction de la barrière hémato-encéphalique, elle peut également être utilisée dans le contexte d’autres systèmes d’organes sur puce tels que le poumon sur puce et l’intestin sur puce.

Pour commencer cette procédure, mélangez soigneusement 27 grammes d’agent de base PDMS et 2,7 grammes d’agent de durcissement. Ensuite, dégazez le mélange dans un dessiccateur pendant environ 45 minutes pour éliminer les bulles d’air. Pendant ce temps, préparez le moule pour le mélange liquide PDMS en collant du ruban adhésif transparent autour du moule, ou placez le moule dans un porte-plaquette approprié.

Versez le mélange PDMS dégazé sur le moule. Ensuite, faites durcir le mélange PDMS dans un four à 60 degrés Celsius pendant quatre heures et laissez-le refroidir par la suite. Dans une hotte à flux croisé, retirez le PDMS durci du moule.

Découpez la réplique du PDMS en parties supérieures et inférieures distinctes à l’aide de lignes de coupe dans le PDMS. Ensuite, percez quatre trous dans les parties supérieures à l’aide d’un poinçon de biopsie pointu d’un millimètre de diamètre pour former des entrées et des sorties. Perforez de l’intérieur vers l’extérieur pour empêcher les débris PDMS de s’accumuler dans la puce.

Ensuite, couvrez les pièces de la puce avec du ruban adhésif transparent pour les protéger de la poussière. Par la suite, coupez les membranes en polycarbonate des inserts transwell en carrés d’environ trois millimètres carrés. Après cela, assemblez une membrane poreuse sans fuite entre deux pièces PDMS afin d’assembler un dispositif à deux couches interfacé avec une membrane poreuse.

À cette fin, préparez un mortier de toluène PDMS en utilisant 0,7 gramme d’agent de base PDMS, 07 grammes d’agent de durcissement et 540 microlitres de toluène. Tourbillonnez le mortier à fond, puis faites pivoter 200 microlitres de mortier sur une lamelle en verre à 1500 tr/min pendant 60 secondes pour obtenir une couche mince et uniforme de mortier. Ensuite, transférez une fine couche de mortier de la lamelle sur la partie inférieure de la puce à l’aide d’un rouleau encreur.

Mettez la partie inférieure dans un plat allant au four, puis transférez le mortier sur la partie supérieure de la chips. À l’aide d’une pince à épiler, trempez les bords d’une membrane dans le mortier à revêtement rotatif et placez-le soigneusement au milieu de la partie inférieure. Ensuite, placez soigneusement la partie supérieure sur la partie inférieure tout en faisant attention à l’alignement.

Couvrez les entrées de copeaux avec du ruban adhésif transparent pour empêcher la poussière de pénétrer dans les copeaux et faites-les cuire à 60 degrés Celsius pendant trois heures. Être prudent est très important dans cette étape. N’exercez pas de pression sur le copeau et ne faites pas glisser la partie supérieure sur la partie inférieure, afin d’éviter que le mortier ne pénètre dans les canaux et n’obstrue la membrane.

Pour intégrer des électrodes dans les canaux latéraux, coupez un fil de platine en morceaux de deux centimètres de long. Ensuite, plongez-les dans de l’acétone pendant 30 minutes. Ensuite, rincez-les à l’eau et à l’éthanol et laissez-les sécher.

Dans une hotte à flux croisé, placez une puce sur un plat en plastique. Insérez quatre fils de platine dans les canaux d’électrode de la puce à l’aide d’une pince à épiler et pliez-les sur le plat en plastique pour permettre la fixation sur le plat à l’étape suivante. Insérez les fils de 0,7 à un millimètre dans le canal de culture au-delà de la jonction du canal en forme de T.

Ensuite, appliquez une goutte de colle durcissable aux UV à l’entrée du canal de l’électrode et laissez la colle remplir le canal par capillarité. Ensuite, allumez l’UV et durcissez la colle lorsqu’elle atteint l’extrémité du canal de l’électrode. Fixation des quatre électrodes intégrées sur la parabole en plastique à l’aide d’un adhésif époxy à deux composants.

Ensuite, couvrez les chips avec du ruban adhésif transparent et faites-les cuire à 60 degrés Celsius pendant deux heures. Laissez-les refroidir et rangez-les à l’abri de la poussière jusqu’à utilisation. Pour enrober les puces afin de favoriser la fixation des cellules, remplissez d’abord les deux canaux avec du PBS avant d’introduire des réactifs.

Vérifiez au microscope s’il n’y a pas de bulles d’air dans les canaux. Si c’est le cas, retirez-les en rinçant avec du PBS supplémentaire. Ensuite, remplissez les deux canaux avec 30 microlitres de 20 microgrammes par millilitre de fibronectine humaine dans PBS.

Incuber-les à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Ensuite, rincez les copeaux avec un milieu de croissance endothélial et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, mesurez le TEER des copeaux vierges pour vous assurer que toutes les électrodes sont en contact direct avec le fluide dans les canaux.

Pour ce faire, prenez une puce de l’incubateur et laissez-la atteindre la température ambiante pendant au moins dix minutes. Retirez tout liquide de la parabole en plastique autour des électrodes pour éviter les ponts électriques à l’extérieur de la puce. Ensuite, prenez le spectre d’impédance de 200 hertz à un mégahertz pour chaque combinaison de deux électrodes, ce qui donne six spectres d’impédance par puce en cinq à dix minutes, à partir desquels le TEER peut être déterminé directement.

Vérifiez si les spectres d’impédance ont les amplitudes et les formes attendues pour valider la mesure TEER. Maintenant, préparez une suspension cellulaire à installer dans le canal supérieur en retirant le milieu de culture d’un ballon de culture avec une monocouche confluente de cellules hcMEC/D3. Après cela, lavez les cellules avec du PBS.

Retirer le PBS, puis ajouter deux millilitres de trypsine EDTA à 05 % et incuber à 37 degrés Celsius pendant deux à cinq minutes jusqu’à ce que les cellules se soient détachées du ballon de culture. Ensuite, désactivez la trypsine avec un milieu de culture complété par 20 % de FBS. Comptez les cellules et calculez leur nombre total en suspension.

Pendant ce temps, centrifugez les cellules hcMEC/D3 à 390 fois g pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans le volume approprié de milieu de croissance endothéliale pour obtenir une concentration de cinq millions de cellules par millilitre correspondant à une densité d’ensemencement de 200 mille cellules par centimètre carré dans la puce. Ensuite, pipetez lentement 30 microlitres de la suspension cellulaire bien mélangée dans le canal supérieur et retirez la pipette de l’entrée dans un mouvement fluide tout en exerçant une pression.

Vérifiez la densité de semis au microscope. Une répartition uniforme des cellules dans tout le canal supérieur doit être obtenue. Ensuite, incubez les copeaux à 37 degrés Celsius et à 5 % de dioxyde de carbone pendant au moins une heure.

Ensuite, rincez toutes les cellules non attachées avec un milieu de culture endothélial. Gardez à l’esprit que TEER est surveillé pendant la période de culture. Il s’agit du spectre d’impédance schématique typique montrant l’amplitude de l’impédance et le déphasage en fonction de la fréquence pour la spectroscopie d’impédance électrique sur des puces sans cellules et avec des cellules.

Il y a quatre régions principales qui sont dominées par la capacité de la double couche au niveau des électrodes, la résistance du milieu de culture, la résistance de la barrière cellulaire ou la capacité de la membrane cellulaire. La région d’intérêt indique où la contribution de la couche cellulaire peut être quantifiée. Et c’est la formule pour calculer TEER à partir des résistances mesurées entre les six combinaisons de quatre électrodes.

Voici le TEER moyen de quatre BHE sur puces pendant la période de culture de trois jours, atteignant un plateau de 22 plus ou moins 1,3 ohm centimètre carré. À des fins de comparaison, les données des puces vierges sont incluses, montrant une variation marginale et un écart par rapport à un centimètre carré de zéro ohm au cours de la même période par rapport à la variation de la valeur TEER des puces avec des cellules. La microcopie à fluorescence des noyaux colorés a révélé une monocouche continue d’endothélium à la fois sur le PDMS et sur la membrane à l’endroit indiqué dans l’encadré.

L’immunofluorescence a révélé la présence de la protéine de jonction serrée zonula occludens, indiquant que les jonctions serrées spécifiques de la BHE entre les cellules donnent lieu à la TEER mesurée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la fabrication et de l’utilisation des puces avec des électrodes intégrées pour les mesures TEER dans les organes sur puces. Cette technique peut être utilisée dans le domaine de la recherche sur la barrière hémato-encéphalique pour étudier l’administration directe et les caractéristiques de la maladie, par exemple dans la maladie d’Alzheimer.

À la suite de cette procédure, la fonction barrière de l’endothélium cérébral différenciée des cellules souches pluripotentes induites dérivées de l’homme peut également être surveillée pour des applications en médecine personnalisée.