Name: Protocole en une étape pour l’évaluation du Mode de la radio-induite de cellules clonogéniques mort en microscopie par Fluorescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Découvrez un protocole rapide en une étape pour évaluer les modes de mort cellulaire clonogénique radio-induite par microscopie à fluorescence avec coloration DAPI. Cette méthode permet d'identifier simultanément l'apoptose, la catastrophe mitotique et la sénescence.

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Nous remercions Mme Akiko Shibata pour l’assistance technique. Ce travail a été soutenu par subventions depuis le ministère de l’éducation, Culture, Sports, Science et technologie du Japon pour les programmes pour Leading Graduate Schools, cultivant des Leaders mondiaux en Heavy Ion Therapeutics et en génie.

1. préparation des matériaux <ol><li>les lamelles Autoclave.
	<ol><li>Placer les lamelles dans une carafe en verre.</li>
		<li>Couvrir le bécher en verre avec feuille.</li>
		<li>Autoclave à 121 ° C à 15 lb/po2 pendant 20 min.</li>
		<li>Sec à 50 ° C. magasin à la température ambiante sous une hotte à culture.</li>
	</ol></li> <li>Préparer la Solution de Fixation : paraformaldéhyde 3 % + 2 % de saccharose en solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
	<ol><li>Dans une bouteille de verre de 1 000 mL, ajouter 700 mL de PBS et paraformaldéhyde 30 g. 
		ATTENTION : Paraformaldéhyde est corrosif, porter des gants appropriés.</li>
		<li>Paraformaldéhyde dissoudre complètement par chauffage à 80 ° C à l’aide d’un four à micro-ondes. 
		ATTENTION : Paraformaldéhyde vapeurs sont toxiques, porter un masque.</li>
		<li>Laisser à température ambiante pendant la nuit.</li>
		<li>Ajouter 20 g de saccharose.</li>
		<li>PBS ajouter pour rendre le volume total de 1 L.</li>
		<li>Partie aliquote dans 50 mL tubes. Solution de fixation peut être conservée pendant 3 ans à-20 ° C ou 3 mois à 4 ° C.</li>
	</ol></li></ol> 2. Préparation de Culture cellulaire Remarque : ces procédures doivent être effectuées sous une hotte à culture.
<ol><li>Culture et passage U2OS ostéosarcome humain cellules pour maintenir la croissance logarithmique 5. 
	Remarque : Autres types de cellules peuvent être utilisés après avoir déterminé la dose d’irradiation optimale.</li>
	<li>Essuyer un scalpel avec du papier essuie-tout humidifié avec de l’éthanol à 70 %. En utilisant le scalpel, placez une lamelle couvre-objet sur une boîte de Petri 35 mm cellule (dénommé ci-après simplement &#34; le plat &#34;). 
	Remarque : Le nombre de lamelles dans un plat peut être augmenté selon l’experimental design (voir Discussion).</li>
	<li>Ajouter 1 mL de milieu de culture : DMEM additionné de 10 % sérum de veau fœtal. 
	Remarque : Les autres médias peuvent être utilisés selon le type de cellule choisie.</li>
	Pinces <li>essuyer avec du papier absorbant humidifié avec de l’éthanol à 70 %. À l’aide de la pince, tenez délicatement le centre de la lamelle couvre-objet. Aspirer les milieux de culture du plat complètement, tout en conservant une emprise sur la lamelle couvre-objet. 
	&#8203; Remarque : cette étape favorise l’immobilisation de la lamelle couvre-objet pour le plat.</li>
	<li>Détacher les cellules adhérentes cultivées à l’aide de la trypsine 5.
	<ol><li>Aspirer des milieux de culture de la capsule.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de PBS et secouez le plat.</li>
		<li>PBS aspirer de la capsule.</li>
		<li>Ajouter trypsine 1 mL [0.25w/v% EDTA trypsine-1mmol/L] dans le plat à.</li>
		<li>Laisser incuber pendant 5 min à 37 ° C dans une atmosphère contenant 5 % de CO 2.</li>
		<li>Ajouter 9 mL de milieu de culture dans le plat à.</li>
		<li>à l’aide d’une micropipette μL de 1000, préparer une suspension monocellulaire.</li>
	</ol></li> <li>Compter les cellules 5.
	<ol><li>Dans un tube de 1,5 mL, ajouter la suspension cellulaire 0,9 mL et mL 0,1 0,4 % solution de bleu de Trypan.</li>
		<li>Appliquer 10 μL d’un hémocytomètre.</li>
		<li>Examiner le nombre de non souillées enregistré (p. ex., live) des cellules sous un microscope inversé triphasé.</li>
	</ol></li> <li>Dans un tube de 15 mL, préparer la suspension cellulaire 3 mL dans les milieux de culture à une densité de 0,5 x 10 5 cellules/mL. 
	Remarque : Cellule densité peut être modifiée selon expérimentale nécessaire (voir Discussion).</li>
	<li>Doucement ajouter 2 mL de la suspension cellulaire dans le plat à.</li>
	<li>Incuber une nuit à 37 ° C dans une atmosphère contenant 5 % de CO 2.</li>
</ol> 3. Irradiation attention : gérer l’irradiateur de rayons x avec soin selon le fabricant &#39; instructions de s.
<ol><li>Examiner les cellules au microscope inversé-phase. Confirmer que les cellules sont fixées sur la lamelle couvre-objet et en vie.</li>
	<li>Irradient le plat avec 6 Gy x-rays (1,4 Gy/min, 300 KVP, 20 mA).</li>
	<li>Incuber pendant 72 h à 37 ° C dans une atmosphère contenant 5 % de CO 2. 
	Remarque : La période d’Incubation peut être modifiée selon l’experimental design (voir Discussion).</li>
</ol> 4. Fixation <ol><li>aspirer des milieux de culture de la capsule.</li>
	<li>à l’aide de ciseaux, couper l’extrémité d’une micropipette μL 1 000 pointe 5 mm de la fin. 
	Remarque : L’extrémité coupée contribue à bien appliquer la Solution de Fixation.</li>
	<li>à l’aide de la pointe coupée, ajouter 1 mL de Solution de Fixation (préparée à l’étape 1.2) pour le plat de la paroi latérale du plat. 
	Remarque : Cette étape est sensible au temps et doit donc être effectuée sans changer les conseils d’une micropipette lors de la manipulation des échantillons multiples. Application de la Solution de Fixation directement au fond du plat peut endommager les cellules.</li>
	<li>Placer le plat dans un plat carré de culture. Secouer la boîte de Pétri carrée doucement pour répartir la Solution de Fixation sur la lamelle couvre-objet.</li>
	<li>Laisser incuber pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Solution de Fixation aspirer de la capsule.</li>
	<li>Ajouter 2 mL de PBS au plat de la paroi latérale du plat. 
	Remarque : La demande de PBS directement au fond du plat peut endommager les cellules.</li>
	<li>PBS aspirer de la capsule.</li>
	<li>Répéter les étapes 4.7 et 4.8 deux fois. 
	Remarque : Le plat peut être conservé pendant 1 semaine à 4 ° C avec les lamelles baignées dans 2 mL de PBS.</li>
</ol> 5. La coloration DAPI <ol><li>à un verre de diapositive, appliquer 5 μL 1 μg/mL DAPI coloration réactif. 
	Remarque : Le DAPI coloration réactif est stable pendant 6 mois abri de la lumière égale ou inférieure à -20 ° C.</li>
	<li>à l’aide d’un scalpel, retirer le plat de la lamelle couvre-objet.</li>
	<li>Retirer l’excès PBS sur la lamelle couvre-objet en touchant le bord de la lamelle couvre-objet avec du papier essuie-tout.</li>
	<li>Monter la lamelle couvre-objet à l’envers sur la goutte de DAPI coloration réactif sur la vitre de la diapositive, afin que les cellules sont exposées à DAPI coloration réactif. 
	Remarque : Cette étape est sensible au temps. Séchage de la DAPI coloration réactif peut conduire à coloration sous-optimaux.</li>
	<li>Les échantillons peuvent être conservés pendant 1 an à -20 ° C.</li>
</ol> 6. Acquisition d’images <ol><li>examiner l’échantillon sur un microscope à fluorescence. Les noyaux sont visualisées à l’aide du filtre DAPI. 
	Remarque : Soit 20 X ou une lentille de huile 60 X peut être utilisés, selon le chercheur &#39; intérêt s. Lorsque vous utilisez un objectif de huile 60 X, ajoutez une goutte d’huile sur la lamelle couvre-objet. Veillez à ce que les échantillons ne touchent pas la lentille ; dans le cas contraire, la lentille peut être endommagée.</li>
	<li>Acquisition d’images de noyaux à l’aide d’une caméra CCD et logiciel d’acquisition des images numériques avec les paramètres et les paramètres suivants : filtre DAPI, images de monocouche, gain de 1 X et l’exposition automatique.</li>
	<li>Finition image acquisition : essuyer le 20 X lentille avec un papier essuie-tout imbibé de nettoyant pour lentille. Essuyez le 60 X lentille d’huile avec un papier essuie-tout imbibé de chloroforme.</li>
</ol> 7. Évaluation du Mode de mort cellulaire clonogénique <ol><li>dans les images choisies au hasard, compter le nombre de noyaux qui répondent aux critères de l’apoptose, catastrophe mitotique et la sénescence cellulaire jusqu'à ce que le nombre total de noyaux comptés atteint 300. Effectuer cette étape en trois exemplaires pour chaque paramètre expérimental.
	<ol><li>Critères d’apoptose : présence d’apoptose organismes (p. ex., noyaux condensés et fragmentés) 6 , 7.</li>
		<li>Critères de catastrophe mitotique : présence de noyaux montrant deux lobes distincts ou micronuclIE 8 , 9 , 10.</li>
		<li>Critères de sénescence cellulaire : présence de foyers hétérochromatiques associée à la sénescence (SAHF) (c.-à-d., ADN nucléaire contenant des foyers lumineux et denses de 30-50) 2 , 11.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wouters, B. G. Cell death after irradiation: how, when and why cells die. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWouters%2C+BG+%22Basic+Clinical+Radiobiology.+4th+ed%22">Basic Clinical Radiobiology. 4th ed</a>. Joiner, M. C., van der Kogel, A. J. , Hodder Education. London. 27-40 (2009).</li>
<li>Aird, K. M., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+senescence-associated+heterochromatin+foci+%28SAHF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF).</a> Methods Mol. Biol. 965, 185-196 (2013).</li>
<li>Kobayashi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+catastrophe+is+a+putative+mechanism+underlying+the+weak+correlation+between+sensitivity+to+carbon+ions+and+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Mitotic catastrophe is a putative mechanism underlying the weak correlation between sensitivity to carbon ions and cisplatin.</a> Sci. Rep. 7, 40588(2017).</li>
<li>Amornwichet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon-ion+beam+irradiation+kills+X-ray-resistant+p53-null+cancer+cells+by+inducing+mitotic+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Carbon-ion beam irradiation kills X-ray-resistant p53-null cancer cells by inducing mitotic catastrophe.</a> PLoS One. , 115121(2014).</li>
<li>Masters, J. R., Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+medium+and+passaging+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Changing medium and passaging cell lines.</a> Nat. Protoc. 2, 2276-2284 (2007).</li>
<li>Sawai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+sulforaphane+as+a+radiosensitizer+for+murine+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of sulforaphane as a radiosensitizer for murine osteosarcoma cells.</a> Oncol. Rep. 29, 941-945 (2013).</li>
<li>Cummings, B. S., Wills, L. P., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cell+death+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Measurement of cell death in mammalian cells.</a> Curr. Protoc. Pharmacol. , Suppl. 56, Chapter 12: Unit 12.8 (2012).</li>
<li>Oike, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C646%2C+a+selective+small+molecule+inhibitor+of+histone+acetyltransferase+p300%2C+radiosensitizes+lung+cancer+cells+by+enhancing+mitotic+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother.+Oncol%22%5BJournal%5D)">C646, a selective small molecule inhibitor of histone acetyltransferase p300, radiosensitizes lung cancer cells by enhancing mitotic catastrophe.</a> Radiother. Oncol. 111, 222-227 (2014).</li>
<li>Oike, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+lethality-based+strategy+to+treat+cancers+harboring+a+genetic+deficiency+in+the+chromatin+remodeling+factor+BRG1%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A synthetic lethality-based strategy to treat cancers harboring a genetic deficiency in the chromatin remodeling factor BRG1.</a> Cancer Res. 73, 5508-5518 (2013).</li>
<li>Russo, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+radiosensitization+of+glioblastoma+cells+by+the+poly+%28ADP-ribose%29+polymerase+inhibitor+E7016%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo radiosensitization of glioblastoma cells by the poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor E7016.</a> Clin. Cancer Res. 15, 607-612 (2009).</li>
<li>Di Micco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+oncogene-induced+DNA+damage+response+and+heterochromatin+in+senescence+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer.</a> Nat. Cell Biol. 13, 292-302 (2011).</li>
<li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nat. Protoc. 1, 2315-2319 (2006).</li>
<li>Vakifahmetoglu, H., Olsson, M., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+through+a+tragedy%3A+mitotic+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Death through a tragedy: mitotic catastrophe.</a> Cell Death Differ. 15, 1153-1162 (2008).</li>
<li>Imreh, G., Norberg, H. V., Imreh, S., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+breaks+during+mitotic+catastrophe+trigger+%CE%B3H2AX-ATM-p53-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Chromosomal breaks during mitotic catastrophe trigger γH2AX-ATM-p53-mediated apoptosis.</a> J. Cell Sci. 129, 1950(2016).</li>
<li>Torres-Roca, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+assay+of+tumor+radiosensitivity%3A+a+roadmap+towards+biology-based+personalized+radiation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Per.+Med%22%5BJournal%5D)">A molecular assay of tumor radiosensitivity: a roadmap towards biology-based personalized radiation therapy.</a> Per. Med. 9, 547-557 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Voici les étapes essentielles au sein du protocole. Tout d’abord, les cellules doivent être cultivées sur le plat de la culture comme une monocouche parce qu’une évaluation morphologique des noyaux colorés au DAPI est difficile pour les cellules multicouches. À cette fin, à l’étape 2.9, transfert minutieuse de la boîte de Petri à un incubateur est recommandée ; agitation de la boîte de Petri génère un tourbillon de cellules suspendus qui mène à la concentration de cellules au centre de la boîte de Pétri. En outre, overconfluence menant aux cellules multicouches doit être évitée. À cette fin, à l’étape 2.7, le nombre de cellules ensemencées sur la boîte de Petri est modifiable basée sur la population doubler le temps et l’intervalle entre l’irradiation et la fixation. Une confluence d’environ 80 au moment de la fixation est recommandée. Deuxièmement, la vitesse est important dans la fixation et coloration DAPI (c.-à-d., les étapes 4 et 5). Incohérence entre l’échantillon en ce qui concerne le temps pris par ces étapes peut conduire à l’hétérogénéité intensité du signal dans les noyaux, qui masquerait l’évaluation morphologique DAPI.
À l’étape 2.2, le nombre de lamelles dans un plat unique de la culture peut être augmenté ; un maximum de quatre lamelles peut être placé dans un plat de 35 mm, et le nombre peut être encore augmenté en utilisant de plus grands plats. Placer plusieurs lamelles dans chaque boîte de Pétri, permet le fonctionnement efficace d’évaluation de cours du temps pour un traitement donné (par exemple, la couverture feuillets peuvent être prélevés sur une boîte de Petri successivement à plusieurs moments d’intérêt).
À l’étape 3.2, la dose d’irradiation peut être modifiée selon l’intérêt des chercheurs. L’application d’une dose conforme à plusieurs lignées cellulaires permet la comparaison de la sensibilité de chaque mode de mort cellulaire clonogénique parmi les lignées de cellules. En revanche, l’utilisation de doses de survie iso-clonogéniques pour chaque lignée cellulaire permet la comparaison des profils de mort de cellules clonogéniques parmi les lignées de cellules. La dose de survie iso-clonogéniques peut être déterminée par le clonogéniques survival test12. La valeur de D10 , la dose qui fournit 10 % clonogénique de survie, est un critère d’évaluation commun pour la dose de survie iso-clonogéniques.
À l’étape 3.3, le temps d’irradiation de fixation peuvent être modifié selon l’intérêt des chercheurs ; Ceci est important car l’heure de pointe pour la sénescence cellulaire, l’apoptose induite par l’IR et catastrophe mitotique varie selon le traitement et la lignée cellulaire. Dans cet article, nous avons utilisé 72 h après l’irradiation comme le point de temps qui serait plus utile pour la présélection de profils de mort cellulaire clonogénique, basé sur plusieurs études de notre groupe et d’autres ont décrit comme suit1,2, 3 , 4 , 8 , 9: (i) X-ray induite par l’apoptose dans les cellules établies à partir des tumeurs solides pour la plupart survient quelques jours après l’irradiation. (ii) X-ray induite par la catastrophe mitotique dans les cellules cancéreuses se produit surtout à la deuxième ou la troisième mitose après la sortie de l’arrestation temporaire cycle cellulaire induite par l’irradiation. La libération produit habituellement environ 24 h après l’irradiation, suivie par mitoses répétées à des intervalles d’environ 24 h. (iii) X-ray – induit la sénescence cellulaire devient évidente après un intervalle dépend de la lignée cellulaire en cause : 2 jours après irradiation pour certains cas précoces et 7 jours après irradiation pour la plupart des lignées de cellules. Après avoir obtenu une vue d’ensemble de la cellule clonogéniques profils de mort de la présélection, le temps des expériences de cours fournira une élucidation plus détaillée de l’heure de pointe pour chaque mode de mort des cellules clonogéniques dans la lignée de cellules spécifiques et/ou de la condition de intérêt4.
Il est à noter que le DAPI test et le test de survie clonogénique de coloration, une méthode de l’étalon-or pour évaluation de rayonnement de sensibilité, ne sont pas interchangeables. Apoptose et catastrophe mitotique seulement durent des heures. Ainsi, le DAPI dosage pour un moment donné une coloration détecte l’apoptose et catastrophe mitotique qui se produit au moment de l’évaluation. En revanche, les résultats de la survie clonogénique de dosage à un moment donné point comprennent le montant total de l’apoptose et catastrophe mitotique qui avait eu lieu au cours de la période d’incubation généralement 10-14 jours après l’irradiation. Différent d’apoptose et catastrophe mitotique, cellules sénescentes restent sur la boîte de Petri ; ils s’accumulent graduellement au fil du temps après l’irradiation. Par conséquent, les résultats des deux le DAPI souillant le test et le test de survie clonogéniques reflètent le montant total de la sénescence qui ont eu lieu au cours de la période d’incubation. Ce qui est important, la proportion de l’apoptose, catastrophe mitotique et sénescence induite par l’irradiation varie considérablement selon la cellule de dose d’irradiation et de la ligne. Pris ensemble, théoriquement, les résultats d’un test ne peuvent être traduits directement dans ceux de l’autre essai.
Le DAPI test de coloration a quelques limitations. Tout d’abord, il reste controversé si catastrophe mitotique est un mode distinct de la mort cellulaire. Dans le domaine de la radiobiologie, catastrophe mitotique est considéré comme un mode majeur de mort cellulaire induite par l’IR qui se distingue des autres mécanismes de mort des cellules clonogéniques1. En revanche, d’autres soutiennent que cette catastrophe mitotique n’est pas un mode distinct de la mort cellulaire, mais plutôt un processus qui précède la mort des cellules dont l’apoptose et nécrose13,14. Ainsi, l’apoptose et catastrophe mitotique peuvent se chevauchent dans une certaine mesure. Deuxièmement, précédentes études suggèrent que la sénescence cellulaire peut se produire en l’absence de SAHF dans certaines lignées cellulaires et les paramètres de traitement2. À présents, d’autres dosages spécifiquement conçus pour chaque cellules clonogéniques mode de mort doit être utilisé pour augmenter la robustesse des conclusions d’une expérience donnée. Troisièmement, le DAPI souillant le dosage ne peut évaluer les modes de la mort des cellules clonogéniques que l’apoptose, catastrophe mitotique et sénescence cellulaire (p. ex., une nécrose et autophagie). Quatrièmement, l’utilité du DAPI souillant dosage comme un facteur prédictif de la réponse tumorale à la radiothérapie n’a pas été élucidée dans la clinique. De ce point de vue, l’analyse de survie clonogéniques, qui évalue le montant total de la mort des cellules clonogéniques, est supérieure à la DAPI test de coloration car une corrélation a été établie entre SF2, la fraction survivante des cellules irradiées à 2 Gy Rayons x et la réponse de la tumeur à15de la radiothérapie. Néanmoins, il convient de noter que le test de survie clonogéniques n’est pas utilisé largement dans la clinique, principalement en raison de l’exigence d’un degré élevé d’expertise et une longue période de temps (c'est-à-dire14 jours) pour l’acquisition de données. Par comparaison, la procédure pour le DAPI test de coloration est plus simple et prend beaucoup moins de temps, environ 3-4 jours, pour générer des résultats. L’utilité de la souillure de DAPIessai comme un facteur prédictif de la réponse tumorale à la radiothérapie sera testé dans la clinique dans un proche avenir.
En résumé, le DAPI souillant le dosage est un dosage de rentable en une seule étape à évaluer simultanément les trois modes principaux de mort cellulaire induite par l’IR clonogéniques. Cette approche permet de dépister facilement les modes de la mort des cellules clonogéniques pour diverses lignées cellulaires, les paramètres de traitement et points dans le temps, dans le but d’élucider les mécanismes de l’apoptose dans les cellules cibles et conditions d’intérêt.

Rayonnements ionisants (IR) induit des modes multiples de la mort des cellules clonogéniques. Recherche sur la mort cellulaire induite par l’IR clonogéniques est importante pour la compréhension de la toxicité de l’IR pour les tissus normaux, ainsi que pour développer des méthodes pour augmenter l’efficacité des traitements de radiothérapie du cancer. L’apoptose, catastrophe mitotique et sénescence cellulaire sont les principaux modes de clonogéniques la mort cellulaire induite par IR1. L’apoptose est un mode réglementé de mort cellulaire qui est initiée par des dommages d’ADN1. La catastrophe mitotique est mort cellulaire qui se produit en raison de la mitose anormale résultant non réparé de cassures double brin de l’ADN1. Sénescence cellulaire est définie comme un état de cellulaire irréversible croissance arrestation2; Notez que la sénescence cellulaire n’est pas la mort des cellules en soi, mais c’est un mode de la mort des cellules clonogéniques car il abolit la survie clonogénique de la cellule sénescente.
Diverses analyses cellulaires ont été développés pour évaluer individuellement l’apoptose, catastrophe mitotique et la sénescence cellulaire. L’apoptose peut être évaluée par terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-fin étiquetage (TUNEL) coloration annexin V coloration, dosages de fragmentation d’ADN et détermination de phase sub-G1 du cycle cellulaire par cytométrie de flux1. La catastrophe mitotique peut être évaluée par immunofluorescence souillant pour marqueurs mitotiques, dont MPM2 TUNEL coloration et microscopie électronique1. Sénescence cellulaire peut être évaluée par la coloration associés à la sénescence β-galactosidase (SA-β-Gal), essais d’arrêt de la croissance et microscopie électronique1. Ce qui est important, le mode prédominant de la mort des cellules clonogéniques diffère entre les lignées cellulaires et paramètres de traitement3,4. Par conséquent, afin d’élucider le profil global de la mort des cellules clonogéniques pour une variable donnée expérimentale, essais multiples couvrant l’ensemble de ces modes de décès doivent être menées ensemble, qui est du travail - et coûteux.
Dans cet article, nous décrivons un test rapide et efficace en une seule étape pour évaluer simultanément l’apoptose, catastrophe mitotique et la sénescence cellulaire induite par IR3,4. Cette méthode, les cellules cultivées sur une lamelle couvre-objet sont irradiés aux rayons x et colorer avec 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). À l’aide de la microscopie en fluorescence, apoptose, catastrophe mitotique et sénescence cellulaire sont tous identifiés basés sur les morphologies caractéristiques respectives des noyaux colorés au DAPI. Cette approche sera utile pour les applications, y compris le dépistage pour les profils de mort de cellules clonogéniques dans diverses lignées cellulaires, les paramètres de traitement et points dans le temps, dans le but d’étudier les mécanismes de mort cellulaire dans les cellules cibles et les conditions de intérêt.

<table><tbody><tr><td>lamelle</td><td>Matsunami</td><td>C013001</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097-250G</td><td></td></tr><tr><td>solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Cosmo Bio</td><td>16232000</td><td></td></tr><tr><td>scalpel</td><td>Kai Medical</td><td>No.20, 520-A</td><td></td></tr><tr><td>35 mm plat de culture cellulaire</td><td>Falcon</td><td></td><td></td>353001</tr><tr><td>trypsine</td><td>Wako</td><td>201-16945</td><td></td></tr><tr><td>microscope à phase inversée</td><td>Shimazu</td><td>114-909</td><td></td></tr><tr><td>irradiateur à rayons X</td><td>Faxitron Bioptics</td><td>Faxitron RX-650</td><td></td></tr> carré boîte de <tr><td>culture</td><td>Corning</td><td>431110</td><td></td></tr><tr><td>verre de lame</td><td>Matsunami</td><td>Pro-11</td><td></td></tr><tr><td>DAPI réactif</td> <td>de colorationMicroscope à fluorescence Cell Signaling</td><td>8961S</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence</td><td></td> Nikon ECLIPSE Ni <td>Filtre DAPI Nikon U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> lentille de microscope à fluorescence (20&times ;)<td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>Plan Apo &lambda ; 20X/0.75</td><td></td></tr> objectif <tr><td>de microscope à fluorescence (60&fois ;, huile)</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo &lambda ; 60X/1.40 huile</td><td></td></tr><tr><td>huile</td><td>Olympus</td><td>N5218600</td><td></td></tr><tr><td>appareil photo CCD</td><td>Logiciel</td> d’acquisition d’images numériques Nikon <td>DS-Qi2</td><td></td></tr> Nettoyeur <tr><td></td><td></td><td></td> d’objectif Nikon NIS-Elements <td></td></tr> Document <tr><td></td><td>Olympus</td><td>OT0552</td><td></td></tr><tr><td>chloroforme</td><td>Wako</td><td>035-02616</td><td></td></tr></tbody></table>

protocole en une étape pour l’évaluation du mode de la radio-induite de cellules clonogéniques mort en microscopie par fluorescence

One-step Protocol for Evaluation of the Mode of Radiation-induced Clonogenic Cell Death by Fluorescence Microscopy

Recherche sur les rayonnements ionisants (IR)-la mort des cellules clonogéniques induite est importante pour comprendre l’effet de l’IR sur les tumeurs malignes et les tissus normaux. Nous décrivons ici une analyse rapide et efficace en une seule étape pour évaluer simultanément les modes principaux de clonogéniques la mort cellulaire induite par IR, c'est-à-dire, l’apoptose, catastrophe mitotique et sénescence cellulaire. Cette méthode, les cellules cultivées sur une lamelle couvre-objet sont irradiés aux rayons x et colorer avec 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). À l’aide de la microscopie en fluorescence, apoptose, catastrophe mitotique et sénescence cellulaire sont identifiées basées sur la morphologie caractéristique des noyaux colorés au DAPI. L’apoptose est déterminée par la présence de corps apoptotiques (c.-à-d., les noyaux condensés et fragmentées). La catastrophe mitotique est déterminée par la présence de noyaux qui présentent deux ou plusieurs lobes distincts et des micronoyaux. Sénescence cellulaire est déterminée par la présence de foyers hétérochromatiques associée à la sénescence (c.-à-d., ADN nucléaire contenant des foyers lumineux et denses de 30-50). Cette approche permet à l’expérimentateur de dépister facilement les modes de mort cellulaire clonogéniques à l’aide de diverses lignées cellulaires, les paramètres de traitement et/ou points dans le temps, dans le but d’élucider les mécanismes de l’apoptose dans les cellules cibles et conditions d’intérêt.

À titre d’exemple, U2OS ostéosarcome humain cellules ont été traitées avec 6 Gy radiographies, incubés pendant 72 h et soumis à la DAPI dosage selon le protocole de coloration. La figure 1 montre les images avec zoom pour les morphologies nucléaires typiques associées à l’apoptose, catastrophe mitotique et la sénescence cellulaire obtenue à l’aide d’une lentille d’huile 60 ×. Se référer aux étapes 7.1.1-7.1.3 pour les morphologies caractéristiques pour chaque mode de la mort des cellules clonogéniques. Figure 2 montre des images d’aperçu des noyaux obtenus à l’aide d’une lentille X 20. L’irradiation à 6 Gy de rayons x induite par catastrophe mitotique fréquemment, l’apoptose moins fréquemment et la sénescence cellulaire rarement. De cette manière, l’examen sur un terrain de faible grossissement permet d’appréhender en un clin d’oeil l’image globale du profil mort cellulaire clonogénique dans un cadre expérimental donné. La figure 3 montre une représentation graphique des données quantifiées.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56338/56338fig1.jpg"> 
Figure 1 : zoom des images des noyaux colorés au DAPI montrant des morphologies typiques de la sénescence cellulaire, l’apoptose et catastrophe mitotique. U2OS cellules irradiées avec 6 Gy x-rays. Après 72 h, les cellules ont été fixées et colorées au DAPI. Images nucléaires ont été obtenues à l’aide d’un 60 X lentille de pétrole. Echelle = 20 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56338/56338fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56338/56338fig2.jpg"> 
Figure 2 : images d’aperçu des noyaux colorés au DAPI des cellules traitement avec des rayons x. U2OS cellules ont été irradiés avec 6 Gy radiographies ou mock-irradiées. Après 72 h, les cellules ont été fixées et colorées au DAPI. Images des noyaux ont été obtenues à l’aide d’une lentille X 20. Cercles, apoptose ; flèches, catastrophe mitotique. Echelle = 50 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56338/56338fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56338/56338fig3.jpg"> 
Figure 3 : données quantifiées pour l’apoptose, catastrophe mitotique et sénescence cellulaire induite dans les cellules traitées avec des rayons x. U2OS cellules ont été irradiés avec 6 Gy radiographies ou mock-irradiées. Après 72 h, les cellules ont été fixées et colorées au DAPI. Images des noyaux ont été obtenues à l’aide d’une lentille X 20. De champs, un total de 300 noyaux ont été évalués pour l’apoptose (Ap), catastrophe mitotique (MC) et la sénescence cellulaire (Sns). Les évaluations ont été effectuées en trois exemplaires. Les valeurs moyennes sont montrés, et barres d’erreur indiquent des écarts-types. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56338/56338fig3large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Recherche sur les rayonnements ionisants (IR)-la mort des cellules clonogéniques induite est importante pour comprendre les effets de l’IR sur les tumeurs malignes et les tissus normaux. Nous décrivons ici un test en une seule étape pour évaluer les modes principaux de la mort cellulaire induite par l’IR clonogéniques basés sur la morphologie des 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)-teinté noyaux visualisées par microscopie à fluorescence.

Protocole en une étape pour l’évaluation du Mode de la radio-induite de cellules clonogéniques mort en microscopie par Fluorescence

Research on ionizing radiation (IR)-induced clonogenic cell death is important for understanding the effect of IR on malignant tumors and normal tissues. ...

L’objectif global de ce test est d’évaluer les principaux modes de mort cellulaire clonogénique induite par les rayonnements ionisants sur la base des morphologies caractéristiques des noyaux colorés au DAPI. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la radiobiologie. Le principal avantage de cette technique rapide et rentable est que les principaux modes de mort cellulaire clonogénique induits par les rayonnements ionisants peuvent être évalués simultanément.En général, les personnes novices en radiobiologie auront du mal à évaluer la mort cellulaire clonogénique induite par les radiations, car différents tests sont nécessaires pour évaluer chaque mode de mort cellulaire. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons effectué un dépistage à grande échelle de la mort cellulaire clonogénique induite par les radiations à l’aide de plusieurs lignées cellulaires et de doses de rayonnement. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la radiobiologie, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que la chimiothérapie contre le cancer.La démonstration de la procédure sera faite par notre collaborateur, Atsushi Shibata. Commencez par stériliser un scalpel avec des serviettes en papier imbibées d’éthanol à 70 %. Ensuite, à l’aide du scalpel, placez une lamelle dans une boîte de culture cellulaire de 35 millimètres.Dans la boîte de culture avec la lamelle, ajoutez un millilitre de milieu de culture. Tenez maintenant doucement le centre de la lamelle à l’aide d’une pince stérile et aspirez complètement le milieu de culture du plat. Ensuite, préparez une suspension cellulaire de trois millilitres dans un milieu de culture dans un tube de 15 millilitres.Ajoutez la suspension cellulaire dans la boîte de culture. Et incubez-le pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Assurez-vous que les cellules sont attachées à la lamelle et qu’elles sont vivantes en les examinant au microscope à contraste de phase inversé.Maintenant, irradiez la parabole avec six rayons X gris. Après l’irradiation, incubez les cellules dans un incubateur pendant 72 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Prenez maintenant les cellules de l’incubateur et aspirez le milieu de culture de la boîte de culture.Coupez la pointe d’une micro-pipette de 1 000 microlitres à environ cinq millimètres de l’extrémité à l’aide de ciseaux. Et utilisez-le pour ajouter un millilitre de solution de fixation dans la boîte de culture. Appliquez la solution de fixation le long des parois de la boîte de culture pour minimiser les dommages aux cellules.Transférez ensuite cette boîte de culture dans une boîte de culture carrée et secouez-la doucement pour répartir uniformément la solution de fixation sur la lamelle. Après cela, incubez le plat pendant 10 minutes à température ambiante. Aspirez la solution de fixation du plat.Ajoutez maintenant deux millilitres de PBS le long des parois du plat. Et puis aspirer le PBS. Pour vous préparer à la coloration DAPI, ajoutez cinq microlitres de réactif de coloration DAPI sur une lame de verre.Retirez ensuite le couvercle du plat à l’aide d’un scalpel. Et égouttez l’excès de PBS sur la lamelle en touchant le bord de la lamelle avec une serviette en papier. Montez maintenant la lamelle de recouvrement à l’envers sur la goutte de réactif de coloration DAPI sur la lame de verre afin que les cellules soient exposées au réactif de coloration DAPI.Enfin, examinez les cellules colorées à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’un filtre DAPI. Les morphologies nucléaires dans chacun des trois modes de mort cellulaire sont représentées. Les cellules apoptotiques ont des noyaux condensés.De multiples lobes sont observés dans les noyaux des cellules subissant une catastrophe mitotique. Les cellules en sénescence présentent des foyers d’hétérochromatine associés à la sénescence. Une observation comparative des noyaux irradiés simulés et des noyaux irradiés avec six rayons X gris est présentée.Les cercles indiquent les noyaux subissant une apoptose, et les flèches indiquent les noyaux subissant une catastrophe mitotique. L’évaluation d’environ 300 noyaux soumis à l’irradiation par rapport au simulacre est présentée. L’irradiation aux rayons X à six gris provoque plus fréquemment une catastrophe mitotique à environ 25 %, suivie d’une apoptose à environ 5 % et de très rares événements de sénescence.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de ne pas endommager les cellules en appliquant des solutions directement sur les lamelles. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que l’analyse cytométrique en flux ou les protéines marqueurs de mort cellulaire, ainsi que la coloration à la bêta-galactosidase associée à la sénescence pour évaluer la sénescence, peuvent être effectuées pour mieux comprendre chaque mode de mort cellulaire clonogénique.

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Découvrez un protocole rapide en une étape pour évaluer les modes de mort cellulaire clonogénique radio-induite par microscopie à fluorescence avec coloration DAPI. Cette méthode permet d'identifier simultanément l'apoptose, la catastrophe mitotique et la sénescence.

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