Protocole en une étape pour l’évaluation du Mode de la radio-induite de cellules clonogéniques mort en microscopie par Fluorescence

L’objectif global de ce test est d’évaluer les principaux modes de mort cellulaire clonogénique induite par les rayonnements ionisants sur la base des morphologies caractéristiques des noyaux colorés au DAPI. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la radiobiologie. Le principal avantage de cette technique rapide et rentable est que les principaux modes de mort cellulaire clonogénique induits par les rayonnements ionisants peuvent être évalués simultanément.

En général, les personnes novices en radiobiologie auront du mal à évaluer la mort cellulaire clonogénique induite par les radiations, car différents tests sont nécessaires pour évaluer chaque mode de mort cellulaire. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons effectué un dépistage à grande échelle de la mort cellulaire clonogénique induite par les radiations à l’aide de plusieurs lignées cellulaires et de doses de rayonnement. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la radiobiologie, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que la chimiothérapie contre le cancer.

La démonstration de la procédure sera faite par notre collaborateur, Atsushi Shibata. Commencez par stériliser un scalpel avec des serviettes en papier imbibées d’éthanol à 70 %. Ensuite, à l’aide du scalpel, placez une lamelle dans une boîte de culture cellulaire de 35 millimètres.

Dans la boîte de culture avec la lamelle, ajoutez un millilitre de milieu de culture. Tenez maintenant doucement le centre de la lamelle à l’aide d’une pince stérile et aspirez complètement le milieu de culture du plat. Ensuite, préparez une suspension cellulaire de trois millilitres dans un milieu de culture dans un tube de 15 millilitres.

Ajoutez la suspension cellulaire dans la boîte de culture. Et incubez-le pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Assurez-vous que les cellules sont attachées à la lamelle et qu’elles sont vivantes en les examinant au microscope à contraste de phase inversé.

Maintenant, irradiez la parabole avec six rayons X gris. Après l’irradiation, incubez les cellules dans un incubateur pendant 72 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Prenez maintenant les cellules de l’incubateur et aspirez le milieu de culture de la boîte de culture.

Coupez la pointe d’une micro-pipette de 1 000 microlitres à environ cinq millimètres de l’extrémité à l’aide de ciseaux. Et utilisez-le pour ajouter un millilitre de solution de fixation dans la boîte de culture. Appliquez la solution de fixation le long des parois de la boîte de culture pour minimiser les dommages aux cellules.

Transférez ensuite cette boîte de culture dans une boîte de culture carrée et secouez-la doucement pour répartir uniformément la solution de fixation sur la lamelle. Après cela, incubez le plat pendant 10 minutes à température ambiante. Aspirez la solution de fixation du plat.

Ajoutez maintenant deux millilitres de PBS le long des parois du plat. Et puis aspirer le PBS. Pour vous préparer à la coloration DAPI, ajoutez cinq microlitres de réactif de coloration DAPI sur une lame de verre.

Retirez ensuite le couvercle du plat à l’aide d’un scalpel. Et égouttez l’excès de PBS sur la lamelle en touchant le bord de la lamelle avec une serviette en papier. Montez maintenant la lamelle de recouvrement à l’envers sur la goutte de réactif de coloration DAPI sur la lame de verre afin que les cellules soient exposées au réactif de coloration DAPI.

Enfin, examinez les cellules colorées à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’un filtre DAPI. Les morphologies nucléaires dans chacun des trois modes de mort cellulaire sont représentées. Les cellules apoptotiques ont des noyaux condensés.

De multiples lobes sont observés dans les noyaux des cellules subissant une catastrophe mitotique. Les cellules en sénescence présentent des foyers d’hétérochromatine associés à la sénescence. Une observation comparative des noyaux irradiés simulés et des noyaux irradiés avec six rayons X gris est présentée.

Les cercles indiquent les noyaux subissant une apoptose, et les flèches indiquent les noyaux subissant une catastrophe mitotique. L’évaluation d’environ 300 noyaux soumis à l’irradiation par rapport au simulacre est présentée. L’irradiation aux rayons X à six gris provoque plus fréquemment une catastrophe mitotique à environ 25 %, suivie d’une apoptose à environ 5 % et de très rares événements de sénescence.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de ne pas endommager les cellules en appliquant des solutions directement sur les lamelles. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que l’analyse cytométrique en flux ou les protéines marqueurs de mort cellulaire, ainsi que la coloration à la bêta-galactosidase associée à la sénescence pour évaluer la sénescence, peuvent être effectuées pour mieux comprendre chaque mode de mort cellulaire clonogénique.