Détection des Mutations rares dans ADNct à l’aide de prochaine génération séquençage

L’objectif global de cette technique est de détecter les mutations de faible fréquence dans les tumeurs circulantes ou l’ADNtc afin de fournir aux médecins cliniciens un outil puissant pour diagnostiquer les tumeurs et surveiller la dynamique tumorale en réponse au traitement. La méthode de test de l’ADNtc peut aider à répondre à des questions clés sur les types de mutations dont un patient est porteur, telles que la variation de type nucléaire unique, la suppression d’insertion, la variation du nombre de copies et la variation structurelle. Le principal avantage de cette technique est une sensibilité et une spécificité élevées qui permettent une détection précise des mutations de basse fréquence dans l’ADNct.

Yuliang Yang, un technicien de mon laboratoire, fera la démonstration des procédures. Pour commencer, prélevez 10 millilitres de sang périphérique dans un tube de prélèvement et retournez doucement le tube de haut en bas six à huit fois pour mélanger le contenu. Conservez les échantillons de sang dans les tubes de prélèvement à une température de six à 37 degrés Celsius pendant une période pouvant aller jusqu’à 72 heures.

Centrifugez le tube de prélèvement à 1 600 fois g à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, à l’aide d’une pipette d’élimination, transférez le surnageant ou le plasma du tube dans quatre tubes à centrifuger propres de deux millilitres étiquetés de manière appropriée, sans déranger la pastille. À l’aide d’une pipette d’élimination propre, transférez un millilitre des cellules dans un tube à centrifuger de deux millilitres étiqueté de manière appropriée.

Conservez les cellules à moins 20 degrés Celsius ou moins avant l’isolement génomique ou l’ADN g. Ensuite, centrifugez le plasma à 1 600 fois g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Transférez ensuite le plasma dans des tubes à centrifuger propres, correctement étiquetés comme plasma, en laissant environ 0,1 millilitre de volume résiduel au fond pour éviter toute contamination.

La couche leucocytaire doit être évitée du plasma pendant le processus de séparation. Sinon, de gros fragments d’ADN extraits des cellules pourraient diluer l’ADNtc et affecter la sensibilité du test. À l’aide d’un kit disponible dans le commerce, isolez l’ADNcf de trois millilitres du plasma collecté en suivant les instructions du fabricant.

Ensuite, également avec un kit, isolez l’ADNg de 200 microlitres de globules blancs en suivant les instructions du fabricant. Pour fragmenter l’échantillon de contrôle de l’ADNg par sonication, préparez un microgramme d’échantillon d’ADNg dans 100 microlitres de tampon Tris-EDTA dans un tube de sonication propre. Réglez le programme de sonication sur 30 secondes d’activation et 30 secondes d’arrêt pendant 12 cycles pour un total de 12 minutes.

Après avoir confirmé que le produit contient 200 à 250 fragments de paires de bases, transférez tous les produits de fragmentation dans un nouveau tube de 1,5 millilitre contenant 150 microlitres de billes magnétiques et incubez l’échantillon pendant cinq minutes pour sélectionner les bons fragments. Ensuite, placez le tube sur une grille magnétique pendant 30 secondes et retirez le surnageant. Ensuite, tout en gardant le tube sur la grille, ajoutez 200 microlitres d’éthanol à 80 % fraîchement préparé pour laver les billes.

Incuber les billes pendant 30 secondes avant de retirer le surnageant et de répéter le lavage. Gardez le tube sur le support avec le couvercle ouvert pour sécher les perles à l’air. Ensuite, éluez les fragments d’ADN en ajoutant 32 microlitres de Tris-HCL millimolaire aux billes.

Pour effectuer la réaction de préparation finale en suivant les instructions du fabricant, dans un tube stérile sans nucléases, ajoutez sept microlitres de tampon de réaction, trois microlitres du mélange d’enzymes, 30 nanogrammes d’ADNcf et de l’eau distillée deux fois pour un volume total de 60 microlitres. Dans un tube séparé, ajoutez les mêmes composants mais avec un microgramme d’ADNg au lieu d’ADNcf. Incuber le mélange dans un thermocycleur à 20 degrés Celsius pendant 30 minutes puis à 65 degrés Celsius pendant 30 minutes sans que le couvercle ne soit chauffé.

Immédiatement après l’incubation, ajoutez 30 microlitres du mélange maître de ligature, un microlitre d’amplificateur de ligature et quatre microlitres de l’adaptateur de séquençage unique dans le tube. Incuber la réaction dans le thermocycleur à 20 degrés Celsius pendant 15 minutes sans que le couvercle ne soit chauffé. Vortex pour remettre les billes magnétiques en suspension et laisser les billes à température ambiante pendant au moins 30 minutes.

Ajoutez ensuite 87 microlitres de billes magnétiques en suspension à la réaction de ligature. Mélangez bien en pipetant de haut en bas, puis incubez l’échantillon à température ambiante pendant cinq minutes. Après le lavage et le séchage à l’air libre des billes, éluez la cible d’ADN des billes en ajoutant 20 microlitres de Tris-HCL de 10 millimolaires.

Ajoutez 20 microlitres de fragments d’ADN ligaturés adaptateurs, cinq microlitres d’amorce d’index i7, 25 microlitres de master mix d’amplification de bibliothèque et de l’eau distillée deux fois jusqu’à un volume total de 50 microlitres. La PCR amplifie l’adaptateur ligaturé cfDNA ou gDNA. Ajoutez ensuite 45 microlitres de billes magnétiques en suspension à l’ADN enrichi en PCR.

Mélangez l’échantillon en pipetant de haut en bas et incubez-le pendant cinq minutes. Après avoir retiré le surnageant et lavé les billes, utilisez 30 microlitres de Tris-HCL de 10 millimolaires pour éluer les fragments d’ADN avec des adaptateurs. Pour effectuer une capture d’ADN ciblée, dans un tube stérile, bloquez l’échantillon en ajoutant 1,5 microgramme de banques de pooling, huit microlitres chacun du bloc P5 100P et du bloc P7 100P, et cinq microlitres d’un microgramme par microlitre et un ADN.

Séchez le contenu du tube à l’aide d’un concentrateur sous vide réglé à 60 degrés Celsius. Hybridez les sondes de capture d’ADN avec la bibliothèque en ajoutant 8,5 microlitres de tampon d’hybridation 2X, 2,7 microlitres d’activateur d’hybridation et 1,8 microlitre d’eau doublement distillée sans nucléases. Mélangez en pipetant de haut en bas et incubez dans le mélangeur thermique à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Ajoutez ensuite immédiatement quatre microlitres de la sonde personnalisée. Incuber les échantillons dans un mélangeur thermique à 65 degrés Celsius avec le couvercle chauffé à 75 degrés Celsius pendant quatre heures. Incuber l’ADN cible hybridé avec des billes de streptavidine, puis laver les billes pour éliminer l’ADN non lié.

Utilisez le kit commercial selon les instructions du fabricant pour obtenir les 20 microlitres restants de billes remises en suspension avec des fragments d’ADN capturés. L’étape de lavage de l’ADN non lié des billes de streptavidine doit être rapide. Sinon, l’efficacité de capture de l’ADN ciblé pourrait être affectée.

Amplifiez les fragments d’ADN capturés en effectuant une PCR à l’aide d’un kit commercial avec deux oligonucléotides de squelette micromolaires selon les instructions du fabricant. Enfin, ajoutez 45 microlitres de billes en suspension directement au produit de PCR et enrichissez les fragments d’ADN cible amplifiés liés aux billes par élution avec 30 microlitres de Tris-HCL de 10 millimolaires. Quantifier les fragments et effectuer le séquençage et l’analyse des données selon le protocole texte.

Ce tableau montre comment ER-seq améliore la profondeur de couverture de 23 % par rapport à la méthode traditionnelle. Cela est dû à sa récupération efficace des molécules d’ADNcf, améliorant ainsi considérablement l’analyse des mutations rares. Il est également clair que les adaptateurs de séquençage uniques utilisés dans ER-seq permettent de différencier facilement les duplications naturelles et induites par la PCR.

Comme détaillé dans ce tableau sur les résultats d’appel, l’analyse basée sur ER-seq était cohérente à 100 % pour la détection EGFR pL858R et la fréquence de détection était un peu plus élevée par rapport à une analyse traditionnelle. Il est important de noter que l’analyse ER-seq a permis de détecter d’autres mutations de fréquence relativement basses, notamment EGFR pT790M qui n’a pas été reconnu par l’analyse traditionnelle en raison du bruit de fond élevé. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 48 heures si elle est bien exécutée.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’éviter la perte d’une très faible quantité d’ADNcf lors de l’extraction, de la préparation de la banque et du lavage des billes après l’hybridation. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon dont l’ADNtc du patient a été collecté, préparé et ciblé en fonction de l’unique identifié pour le séquençage. Après sa mise au point, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biopsie liquide pour explorer de meilleures pratiques dans la prise de décisions cliniques.