Name: Le positionnement et la retenue d’une patte de Rat pour l’imagerie ciblée haute résolution des os à l’aide de la micro-architecture In Vivo Micro-computed Tomography (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 24 s
Description: Apprenez le positionnement et la retenue de la patte postérieure d'un rat pour l'imagerie haute résolution de la micro-architecture osseuse par micro-tomographie in vivo. Cette méthode standardisée permet d'obtenir des images de qualité pour les études longitudinales.

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Les auteurs reconnaissent recherche le financement d’une subvention à la découverte du CRSNG (#05573) et la Fondation canadienne pour l’Innovation (#222084) pour le financement de l’in vivo micro-CT. W.E. Ward est une Chaire de recherche du Canada dans les os et le développement musculaire.

Cette étude a été approuvée par l’Animal Care Comité de Brock University et conformes aux lignes directrices établies par le Conseil canadien de protection des animaux 21.
1. anesthésie à l’aide de gaz Isoflurane
<ol><li>Remplir à l’avance la chambre d’incubation verre acrylique avec haute qualité O2 à un débit continu d’environ 1 à 2 L/min depuis une machine anesthésique (supplémentaire Figure 1).</li>
	<li>Transférer le rat à la queue de chambre d’incubation tout d’abord et fermer le couvercle de chambre d’incubation pour créer un joint étanche.</li>
	<li>Commencez à remplir la chambre d’incubation à l’isoflurane de qualité vétérinaire à 3-4 % v/v dissous dans O2 à un débit continu de 1 à 2 L/min (supplémentaire Figure 1). ATTENTION : Les gaz anesthésiques déchets peuvent affecter défavorablement les gestionnaires. Un système de charognard (c.-à-d., un filtre à charbon ou gaz d’échappement directement dans une hotte de laboratoire) doit toujours être en place.</li>
	<li>Lorsque le rat n’est plus en mesure de supporter, transfert le rat à un masque facial ou le cône de nez recevant 1 à 3 % isoflurane dissous dans O2 à un débit de 1 à 2 L/min. Rats principalement respirer par le nez et par conséquent, tant que le nez est couvert par le masque facial ou le nez cône, il y aura délivrance d’anesthésie suffisante.</li>
	<li>Appliquer ophtalmique lubrification aux membranes délicates des yeux pour les protéger de tout gaz isoflurane avec séquence d’échappement. Remarque : Assurez-vous que la lubrification ophtalmique est sans antibiotique, comme cela peut influer sur les résultats d’une intervention.</li>
	<li>Mesurer palpébrale (œil clignotant la réponse à la stimulation douce de l’ouverture palpébrale) et pédale réflexes (retrait des membres postérieurs en réponse à pincement) ; avec la profondeur de l’anesthésie, réflexe palpébrale va être absent avant pédale réflexes (complémentaire Figure 2).</li>
	<li>Quand un niveau approprié de l’anesthésie est atteinte et le rat a perdu les réflexes des fentes palpébrales et pédales, maintenir le rat sur 0,5 à 2 % isoflurane dissous dans O2 à un débit de 1 à 2 L/min.</li>
	<li>Surveiller en permanence le rythme respiratoire du rat tout au long de la procédure en gardant une constante visual sur le rat soit directement avec un système de contrôle interne, soit par le biais de la vidéo live feed (supplémentaire Figure 3).</li>
</ol>2. positionnement et la retenue de la patte de Rat
<ol><li>Posez le rat en position couchée sur le lit de scanner en fibre de carbone (complémentaire Figure 4).</li>
	<li>Immobiliser le pied droit dans un malléable, mousse tube, les orteils sortant de l’extrémité du tube. Appliquer une cire dentaire pour maintenir le pied fermement dans la mousse et tape le tube fermé hermétiquement. S’assurer que le diamètre du tube tenant le pied est assez pour être fermement insérée dans le tube en plastique.</li>
	<li>Glisser le tube en plastique dans le lit de scanner rayons x (complémentaire Figure 5).</li>
	<li>Étendre le membre postérieur de rat jusqu'à ce qu’elle est bien tendue. N’étendez pas trop la jambe quant à causent des dommages à la rat (Figure5 supplémentaire) car cela peut entraîner un mouvement involontaire des membres en raison de la respiration laborieuse.</li>
	<li>Tirer sur la jambe gauche (patte non scannée) ainsi que la queue de la numérisation du champ de vision et vers le torse, de la jambe étendue à numériser.</li>
	<li>Fixer la jambe gauche (non scannée de la patte) et la queue en position à l’aide de ruban adhésif. Ne pas utiliser quelque chose de plus ou moins collantes (c.-à-d., du ruban adhésif ou ruban adhésif de peintre), étant donné que ces matériaux affectera soit le rat lorsqu’ils sont supprimés (ruban) ou ne fournissent pas une assez forte emprise (ruban de peintre) (supplémentaires Figure 6).</li>
	<li>Fixez le corps du rat en position sur les hanches, épaules et tête avec du ruban adhésif de masquage. Fixez le masque facial ou le cône de nez au rat (supplémentaires Figure 6). NOTE : Épongez le côté adhésif du ruban-cache pour éliminer sa capacité à s’en tenir à la fourrure de rat. Tache pas les extrémités de la bande de masquage afin qu’il peut être solidement fixée au lit balayage.</li>
	<li>Envelopper le rat au vétérinaire-wrap pour limiter la perte de chaleur (supplémentaires Figure 6). Remarque : Lorsque vous êtes sous anesthésie générale, rats perdent de la chaleur rapidement en raison de leur grande surface de corps poids ratio 19,20.</li>
	<li>Surveiller en permanence le rythme respiratoire du rat tout au long de la procédure en gardant une constante visual sur le rat (soit directement, soit par une vidéo live feed). Remarque : Ici la mise en place prend 5 min, acquisition de scan est acquisition paramètre dépendant et temps de récupération est de 60 minutes.</li>
	<li>Continuez d’acquérir des images µCT. Remarque : Les spécifications exactes pour l’acquisition de scan sont spécifiques à chaque scanner type, système logiciel et la question spécifique de recherche, toutefois, plusieurs publications méthodologiques existent à travers la littérature 1,2 , 9.</li>
</ol>3. récupération de l’anesthésie
<ol><li>Après en vivo µCT numérisation est terminée, arrêter le flot d’isoflurane au rat, mais de maintenir un débit de 1 à 2 L/min d’O2.</li>
	<li>Lorsque le rat reprend le contrôle moteur (1-2 min), retirer de l’appareil respiratoire et lui permettre de récupérer individuellement dans une cage, posée en partie sur un tapis de chauffage universel à feu doux. Des rats sont connus pour réduire leur température corporelle de 1 ° C, sous anesthésie générale19. N’abandonnez pas le rat jusqu'à ce qu’il a repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal. NOTE : Des preuves anecdotiques de notre groupe de recherche signale immédiatement après de l’anesthésie isoflurane, rat commence à manger et il est donc important d’avoir leur nourriture et d’eau à leur disposition lors de la récupération. Bien que nous avons observé ce comportement, anesthésie générale répétée ne provoque pas une augmentation significative en nourriture d’admission ou corps poids 1,9.</li>
</ol>

<ol><li>Longo, A. B., Sacco, S. M., Salmon, P. L., Ward, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+use+of+micro-computed+tomography+does+not+alter+microarchitecture+of+the+proximal+tibia+in+sham+or+ovariectomized+sprague-dawley+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Calcif+Tissue+Int%22%5BJournal%5D)">Longitudinal use of micro-computed tomography does not alter microarchitecture of the proximal tibia in sham or ovariectomized sprague-dawley rats.</a> Calcif Tissue Int. 98 (6), 631-641 (2016).</li>
<li>Sacco, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+irradiation+from+micro-computed+tomography+scanning+at+2%2C+4+and+6+months+of+age+does+not+induce+damage+to+tibial+bone+microstructure+in+male+and+female+CD-1+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bonekey+Rep%22%5BJournal%5D)">Repeated irradiation from micro-computed tomography scanning at 2, 4 and 6 months of age does not induce damage to tibial bone microstructure in male and female CD-1 mice.</a> Bonekey Rep. 6, 855(2017).</li>
<li>Waarsing, J. H., Day, J. S., Verhaar, J. A., Ederveen, A. G., Weinans, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+loss+dynamics+result+in+trabecular+alignment+in+aging+and+ovariectomized+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Bone loss dynamics result in trabecular alignment in aging and ovariectomized rats.</a> J Orthop Res. 24 (5), 926-935 (2006).</li>
<li>Klinck, R. J., Campbell, G. M., Boyd, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+effects+on+bone+architecture+in+mice+and+rats+resulting+from+in+vivo+micro-computed+tomography+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Eng+Phys%22%5BJournal%5D)">Radiation effects on bone architecture in mice and rats resulting from in vivo micro-computed tomography scanning.</a> Med Eng Phys. 30 (7), 888-895 (2008).</li>
<li>Laperre, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+micro-CT+protocols+for+in+vivo+follow-up+of+mouse+bone+architecture+without+major+radiation+side+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Development of micro-CT protocols for in vivo follow-up of mouse bone architecture without major radiation side effects.</a> Bone. 49 (4), 613-622 (2011).</li>
<li>Brouwers, J. E., van Rietbergen, B., Huiskes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+effects+of+in+vivo+micro-CT+radiation+on+structural+parameters+and+bone+marrow+cells+in+proximal+tibia+of+wistar+rats+detected+after+eight+weekly+scans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">No effects of in vivo micro-CT radiation on structural parameters and bone marrow cells in proximal tibia of wistar rats detected after eight weekly scans.</a> J Orthop Res. 25 (10), 1325-1332 (2007).</li>
<li>Francisco, J. I., Yu, Y., Oliver, R. A., Walsh, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+age%2C+skeletal+site%2C+and+time+post-ovariectomy+on+bone+mineral+and+trabecular+microarchitecture+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Relationship between age, skeletal site, and time post-ovariectomy on bone mineral and trabecular microarchitecture in rats.</a> J Orthop Res. 29 (2), 189-196 (2011).</li>
<li>Altman, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+skeletal+growth%2C+modeling%2C+and+remodeling+by+in+vivo+micro+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro computed tomography.</a> Bone. 81, 370-379 (2015).</li>
<li>Longo, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifelong+intake+of+flaxseed+or+menhaden+oil+to+provide+varying+n-6+to+n-3+PUFA+ratios+modulate+bone+microarchitecture+during+growth%2C+but+not+after+OVX+in+Sprague-Dawley+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Nutr+Food+Res%22%5BJournal%5D)">Lifelong intake of flaxseed or menhaden oil to provide varying n-6 to n-3 PUFA ratios modulate bone microarchitecture during growth, but not after OVX in Sprague-Dawley rats.</a> Mol Nutr Food Res. 61 (8), (2017).</li>
<li>Sacco, S. M., Saint, C., LeBlanc, P. J., Ward, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+consumption+of+hesperidin+and+naringin+flavanones+exerts+transient+effects+to+tibia+bone+structure+in+female+CD-1+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Maternal consumption of hesperidin and naringin flavanones exerts transient effects to tibia bone structure in female CD-1 offspring.</a> Nutrients. 9 (3), 250(2017).</li>
<li>Campbell, G. M., Buie, H. R., Boyd, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signs+of+irreversible+architectural+changes+occur+early+in+the+development+of+experimental+osteoporosis+as+assessed+by+in+vivo+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporos+Int%22%5BJournal%5D)">Signs of irreversible architectural changes occur early in the development of experimental osteoporosis as assessed by in vivo micro-CT.</a> Osteoporos Int. 19 (10), 1409-1419 (2008).</li>
<li>De Schaepdrijver, L., Delille, P., Geys, H., Boehringer-Shahidi, C., Vanhove, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+longitudinal+micro-CT+study+of+bent+long+limb+bones+in+rat+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Toxicol%22%5BJournal%5D)">In vivo longitudinal micro-CT study of bent long limb bones in rat offspring.</a> Reprod Toxicol. 46, 91-97 (2014).</li>
<li>Perilli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+early+bone+changes+using+in+vivo+micro-CT+in+ovariectomized%2C+zoledronic+acid-treated%2C+and+sham-operated+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporos+Int%22%5BJournal%5D)">Detecting early bone changes using in vivo micro-CT in ovariectomized, zoledronic acid-treated, and sham-operated rats.</a> Osteoporos Int. 21 (8), 1371-1382 (2010).</li>
<li>Bouxsein, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+assessment+of+bone+microstructure+in+rodents+using+micro-computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography.</a> J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).</li>
<li>Li, H., Zhang, H., Tang, Z., Hu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-computed+tomography+for+small+animal+imaging%3A+Technological+details%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Natural+Science%22%5BJournal%5D)">Micro-computed tomography for small animal imaging: Technological details.</a> Progress in Natural Science. 18 (5), 513-521 (2008).</li>
<li>Campbell, G. M., Sophocleous, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+bone+and+soft+tissue+by+micro-computed+tomography%3A+applications+to+ex+vivo+and+in+vivo+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bonekey+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of bone and soft tissue by micro-computed tomography: applications to ex vivo and in vivo studies.</a> Bonekey Rep. 3, 564(2014).</li>
<li>Meganck, J. A., Kozloff, K. M., Thornton, M. M., Broski, S. M., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beam+hardening+artifacts+in+micro-computed+tomography+scanning+can+be+reduced+by+X-ray+beam+filtration+and+the+resulting+images+can+be+used+to+accurately+measure+BMD%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Beam hardening artifacts in micro-computed tomography scanning can be reduced by X-ray beam filtration and the resulting images can be used to accurately measure BMD.</a> Bone. 45 (6), 1104-1116 (2009).</li>
<li>Vazquez, C. M., Molina, M. T., Ilundain, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+rat+large+intestine+in+reducing+diarrhea+after+50%25+or+80%25+distal+small+bowel+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of rat large intestine in reducing diarrhea after 50% or 80% distal small bowel resection.</a> Dig Dis Sci. 34 (11), 1713-1719 (1989).</li>
<li>Albrecht, M., Henke, J., Tacke, S., Markert, M., Guth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+isoflurane%2C+ketamine-xylazine+and+a+combination+of+medetomidine%2C+midazolam+and+fentanyl+on+physiological+variables+continuously+measured+by+telemetry+in+Wistar+rats%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of isoflurane, ketamine-xylazine and a combination of medetomidine, midazolam and fentanyl on physiological variables continuously measured by telemetry in Wistar rats.</a> BMC Vet Res. 10, 198(2014).</li>
<li>Schmitz, S., Tacke, S., Guth, B., Henke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+physiological+parameters+and+anaesthesia+specific+observations+during+isoflurane%2C+ketamine-xylazine+or+medetomidine-midazolam-fentanyl+anaesthesia+in+male+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of physiological parameters and anaesthesia specific observations during isoflurane, ketamine-xylazine or medetomidine-midazolam-fentanyl anaesthesia in male guinea pigs.</a> PLoS One. 11 (9), e0161258(2016).</li>
<li>Canadian Council on Animal Care. Guide to the care and use of experimental animals. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Experimental_Animals_Vol1.pdf">http://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Experimental_Animals_Vol1.pdf</a> (1993).</li>
<li>Stevens, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+toxicities+of+halothane%2C+isoflurane%2C+and+diethyl+ether+at+subanesthetic+concentrations+in+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Comparative toxicities of halothane, isoflurane, and diethyl ether at subanesthetic concentrations in laboratory animals.</a> Anesthesiology. 42 (4), 408-419 (1975).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole offre aux téléspectateurs la première directive détaillée pour l’anesthésie correcte, placement et retenue du rat au cours en vivo µCT numérisation du membre postérieur. Ces lignes directrices permettre aux utilisateurs d’en vivo µCT, analyse de systèmes pour obtenir une résolution élevée et des images de haute qualité du tibia qui peuvent être traitées pour la quantification de la microarchitecture osseuse 3 dimensions. Étapes cruciales dans le protocole nécessaire pour assurer le bon positionnement et retenue pour impliquent l’anesthésie correcte du rat ainsi que l’extension du membre postérieur, loin de toutes les autres structures critiques jusqu'à ce qu’elle est bien tendue, mais pas dans une position non naturelle. Pour des résultats optimaux d’imagerie, il est impératif que le rat être anesthésiés à un niveau de relaxation complète, et que les réflexes palpébrales et pédales sont perdus. En outre, il convient de prolonger la balayage de la jambe et l’ensemble du pied et la cheville doivent être maintenues dans la mousse. Les méthodes décrites ci-dessus pour obtenir un positionnement optimal de la jambe de balayage vont à ce que : 1) membres postérieurs de rats dans une étude sont toujours orientées dans le même sens, permettant ainsi le faisceau de rayons x de traverser la même zone de chaque jambe comme il tourne autour de l’échantillon ; 2) mouvement volontaire et involontaire du membre postérieur ne se produira pas, ce qui minimise le risque d’artefacts de mouvement d’interférer avec la qualité des images reçues ; 3) les obstacles (par exemple, la queue) sont empêchées, ce qui minimise le risque d’effets de volume partiel obtenir des mesures inexactes de BMD et TMD. Ces lignes directrices peuvent être modifiés pour chaque rat individuel, comme le taux de métabolisme de l’isoflurane et le positionnement peut varier selon la souche et le corps de taille 22. Les plus courantes en vivo machines balayage sont conçus pour les petits modèles animaux (p. ex., souris, rats, lapins, cochons d’Inde) et aura des stades animaux interchangeables pour permettre le scannage de différentes tailles d’animaux. Par conséquent, elles peuvent accueillir un large éventail de poids corporel.
Bien qu’en vivo µCT numérisation permis pour le rat pour être repositionné et réanalysés si les images acquises de l’analyse initiale sont de mauvaise qualité, répété numérisation exposera le rat à des doses supplémentaires d’anesthésie isoflurane et de rayonnement pour une période prolongée de temps. Mensuel radioexposition répétées de 600 mGy axé sur le tibia de rat sur quatre mois ne provoque pas d’effets indésirables à l’OS micro-architecture par rapport à la patte controlatérale 1, mais ce ne pas vérifier la sécurité des deux balayages répétés dans succession immédiate. Autres limitations de la technique décrite comprennent la nécessité d’étendre le membre postérieur tendu avec les forces exercées sur elle pour ne pas bouger, qui peuvent invoquer des changements dans la structure osseuse. Alors que la gravité de la retenue du membre postérieur pendant la numérisation dépendra de chaque objectif de la recherche, des recherches antérieures de notre laboratoire impliquant mensuel répétées en vivo µCT imagerie d’un membre postérieur a entraîné une différence dans la corticale paramètre micro-architecturales, excentricité, par rapport au membre postérieur controlatéral qui n’a pas subi d’extension répétée, la stabilisation et la numérisation 1. Excentricité est une mesure de la forme elliptique de l’os cortical et modifications en réponse à modifié porteur. Par conséquent, lorsqu’à l’aide de cette méthode de positionnement et de contention du membre postérieur pour répété en vivo µCT imaging, sera examinée lorsque évaluer et interpréter devient porteuse paramètres micro-architecturaux.
Alors que les directives susmentionnées ont été fournies pour l’imagerie et l’analyse du tissu osseux, légères modifications au Protocole s’impose lorsque l’imagerie des tissus mous du membre postérieur. Plus précisément, la façon dont le membre postérieur est prolongé du torse et retenu doit tenir compte, comme la procédure actuelle misshapes l’orientation des tissus mous (muscles, tissu adipeux) en position anormale pour la durée de l’analyse. En extrapolant ce modèle pour l’utilisation dans l’imagerie des tissus mous du membre postérieur, quelques ajustements il faudrait donc à la technique retenue pour réduire ou éliminer les changements dans le positionnement des tissus par rapport à l’autre.
En outre, les lignes directrices ont été écrites spécifiquement basé sur l’expérience de notre groupe de recherche, toutefois, elles peuvent être modifiées pour tenir compte d’autres scanners µCT disponible dans le commerce en vivo . Autres méthodes suggérées pour positionner et immobiliser le membre postérieur peuvent être obtenues par le fabricant de le µCT in vivo , système de balayage. Plus commercialement disponible en vivo les unités µCT listent polypropylène polystyrène expansé et tubes en plastique avec de la cire dentaire pour contenir une saillie du pied comme matériaux acceptables et les méthodes pour retenir la balayage de la jambe. Cependant, la méthode présentée dans le présent protocole fournir plus contrôlée et uniforme de positionnement et de retenue de la jambe numérisée et produit régulièrement des images de haute qualité. Les lignes directrices présentées dans la présente méthode requièrent des équipements spécialisés nécessaires pour l’anesthésie du rat, par exemple un vaporisateur, tubes, masques, chambres de l’induction et l’oxygène. Bien que l’équipement est associé à un coût légèrement plus élevé par rapport aux anesthésiques injectables, il permet aux chercheurs la possibilité de rapidement et précisément induisent une anesthésie à des profondeurs spécifiques de la conscience, ce qui donne un avantage sur alternative Méthodes.
En utilisant les directives énoncées dans la présente méthode vidéo, chercheurs utilisant les technologies de haute résolution en vivo µCT pour enquêter sur leur intervention d’intérêt sera capable de correctement et systématiquement orienter et empêcher un membre postérieur du rat pour la grande imagerie par rayons x de qualité. Cela fournira un continuum dans le domaine de l’acquisition d’images in vivo µCT et servir comme une étape vers l’optimisation de la cohérence et l’exactitude dans les études et permettent des comparaisons entre les études dans la littérature. De même, ces protocoles et méthodes peuvent être développés pour une utilisation dans d’autres espèces de rongeurs, y compris la souris, même si certains changements seront obligatoire 2,10. Par exemple, la retenue du pied dans le tube de mousse peut inclure la cheville pour réduire le risque de mouvement de la jambe lors de l’analyse. En outre, le plein pied s’insère dans le titulaire de la mousse. Ainsi, les orteils ne s’étendent pas par l’extrémité de la titulaire, comme ils le font lorsque vous fixez le pied d’un rat. En outre, le corps de la souris ne nécessite pas la même retenue avec du ruban adhésif comme le rat. Un petit cône de nez peut être utilisé pour le maintien de l’anesthésie chez les souris pendant l’analyse. Si un petit cône de nez n’est pas disponible, on peut fixer un gant en nitrile sur le cône de nez disponible et faire une petite incision dans le gant pour fournir un espace qui peut contenir le nez de la souris pour fournir l’anesthésie tout en conservant un joint autour du nez.
Tandis que le tibia proximal est le site principal de l’étude des changements à l’OS microstructure chez le rat, lignes directrices pour le positionnement correcte et uniforme des autres sites squelettiques tels que le fémur et la vertèbre lombaire doivent être étudiés et mis en place pour cohérence dans la littérature. Cependant, lorsqu’on entreprend des recherches futures impliquant l’imagerie des vertèbres lombaires, considérations s’imposent comme l’imagerie de la colonne vertébrale fournit radioexposition aux organes environnants et les tissus.

L’utilisation de in vivo micro-la tomodensitométrie (µCT) est un outil puissant qui implique l’imagerie non destructive des structures internes à haute résolution en utilisant les modèles de rongeurs. La nature non destructifs de in vivo µCT permettant des recherches répétées d’imagerie du rongeur même au fil du temps. Cette fonctionnalité non seulement réduit le nombre total de rongeurs requis dans un dispositif expérimental et réduit ainsi la variation inter-sujet qui peut survenir, mais permet également aux chercheurs de comprendre les réactions à long terme à une intervention. Avec l’utilisation de répétées en vivo µCT, expériences sur des souris et des rats ont élucidé des changements développementaux pour la microarchitecture d’os et OS de densité minérale (BMD) tout au long de la durée de vie 1,,2,3 périodes ,4,5,6,7,8 ainsi que la réponse de la santé des os aux interventions comme alimentation 9,10, une ovariectomie 7,11 et agents pharmacologiques 8,12,13. BMD et microarchitecture osseuse à des sites squelettiques spécifiques, à savoir le tibia proximal, un fémur et des vertèbres lombaires, sont indicatifs de santé osseuse et du risque de fractures et sont donc les mesures primaires lors de la quantification des réponses à un intervention.
Acquisition d’images in vivo µCT implique les projections de radiographie bidimensionnelles absorbées à angles multiples, comme la source de rayons x et le détecteur tournent autour de l’animal sous enquête 14,15. La qualité de l’image résultante est tributaire de nombreux facteurs, y compris, mais non limité à : sélection des paramètres d’acquisition (c'est-à-dire, résolution spatiale, rayons x tension, ampérage, étape de rotation, filtre appliqué, durée d’exposition), limitations de le µCT Scanner (c.-à-d., axée sur le scanner artefacts tels que des artefacts de bague ou de la poussière qui provoquent des effets de volume formant des stries ou partielle) et un positionnement correct et retenue de l’animal. Les deux premiers de ces facteurs peuvent être manipulés dans une certaine mesure par l’utilisateur, selon la machine de balayage spécifique, les objectifs de l’étude et les corrections qui sont nécessaires pour optimisent la fonction du scanner ou traitement des images reçues. Le dernier de ces facteurs, le bon positionnement du rongeur avant l’analyse, peut être réalisé indépendamment des limitations axée sur le scanner ou les paramètres d’acquisition qui sont sélectionnés pour atteindre un objectif d’étude spécifique. Alors que de nombreuses publications portant sur l’imagerie in vivo ont été publiées dans la littérature 14,15,16,17, style manuscrit classique est telle que détaillée « how to » information ne peut pas être inclus. Par conséquent, du présent article et le guide vidéo vise à combler cette lacune. Ici, nous voulons apprendre aux utilisateurs de scanners de µCT in vivo à anesthésier un rat et à positionner et à immobiliser le membre postérieur pour produire des images de haute qualité qui peuvent être analysés pour quantifier plus précisément les résultats de la microarchitecture osseuse.
Des obstacles empêchant du faisceau de rayons x à travers des objets autres que le membre postérieur sont indispensables pour quantifier les BMD plus précis et les valeurs de microarchitecture osseuse. Comme les rayons x traversent les objets et tissus des différentes épaisseurs et densités, certains des rayons x sont absorbés (c.-à-d. atténuée) par les matériaux qu’ils traversent. Puisque la masse volumique mesurée d’un échantillon est remis en cause par son épaisseur et la présence et l’épaisseur des tissus environnants, il est impératif que les fantômes d’étalonnage utilisées pour déterminer les BMD sont analysés de la même manière. Par conséquent, si le faisceau de rayons x doit passer à travers des objets (c'est-à-dire, la queue) avant ou après avoir traversé la zone d’intérêt, ces objets vont absorber une partie des énergies des rayons x et n’interférera avec l’image de transmission acquise. En outre, ces scans serait très difficiles de simuler en scannant les fantômes qui doivent ressemblent étroitement à des analyses de l’échantillon. En conséquence, ces différences d’atténuation entraîner inexactitude dans l’évaluation des mesures de BMD de l’OS. Ainsi, pour la facilité et de précision, il est préférable de limiter le nombre d’obstacle entre la source de rayons x, région d’intérêt et des rayons x détecteur.
Une évaluation longitudinale de la structure osseuse d’une intervention dans des modèles précliniques impliquent l’anesthésie répétée de l’animal afin de limiter leur mouvement pendant l’analyse des protocoles. Plusieurs méthodes d’anesthésie générale existent afin de dompter les animaux subissant un balayage µCT, y compris les injectables et inhalant anesthésie 1,2,4,5,6, 12. Contrairement aux anesthésiques inhalants tels qu’isoflurane, répétée anesthésie générale à l’aide d’anesthésiques injectables entraîner une réduction du poids corporel, de tolérance chirurgicale et de modifications importantes apportées aux autres paramètres physiologiques chez les rongeurs, spécifiquement des rats et des cobayes, suggérant des contre-indications importantes pour répété utilisation 18,19,20. Tandis qu’isoflurane est très volatile et permet l’induction rapide et de récupération, des agents anesthésiques injectables produisent des niveaux variables de l’anesthésie et temps sous anesthésie dépend de la souche, le sexe, composition corporelle, à jeun et cycle circadien de la animal. Anesthésiques injectables posent des obstacles supplémentaires à leur utilisation comme ils sont très réglementés par les organes directeurs nationaux. Anesthésie par inhalation implique toutefois, la livraison directe dans le système respiratoire ; Cette méthode permet plus rapidement pour l’induction et la récupération du temps et mieux contrôlent la longueur et la profondeur de l’anesthésie19,20. Limites de la méthode d’anesthésie par inhalation impliquent son exigence pour équipement spécialisé de vaporisation et des changements de pression artérielle et fréquence cardiaque durant l’induction, entretien et restauration 18,19.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>Fresenius Kabi</td> Vaporisateur <td>108737</td><td></td>Santé Animale</tr><tr><td></td><td>Dispomed</td><td>990-1091-3SINEWA</td><td></td></tr><tr><td>Scavengers/Filtres à Charbon</td><td>Dispomed</td><td>985-1005-000</td><td></td></tr><tr><td>Micro-CT Scanner</td><td>Bruker microCT</td><td>SkyScan 1176</td><td></td></tr><tr><td>Cire dentaire</td><td>Kerr Dental Laboratory</td><td>623</td><td></td></tr><tr><td>Foam (Backer Rod)</td><td>Rona</td><td>CF12086</td><td>1" x10'</td></tr><tr><td>Tube en plastique</td><td>Bruker microCT</td><td>SP-3010</td><td></td></tr><tr><td>Lit en fibre de carbone</td><td>Bruker microCT</td><td>SP-3002</td><td></td></tr><tr><td>Vet Wrap/Bandage</td><td>Dura-Tech</td><td>17473</td><td></td></tr><tr><td>Gel ophtalmique</td><td>OptixCare</td><td>006CLC-4256</td> Sans <td>antibiotiques</td></tr><tr><td>Coussin chauffant</td><td>Sunbeam</td><td>000731-500-000</td><td></td></tr></tbody></table>

le positionnement et la retenue d’une patte de rat pour l’imagerie ciblée haute résolution des os à l’aide de la micro-architecture in vivo micro-computed tomography

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

L’utilisation de in vivo micro-la tomodensitométrie (µCT) est un outil puissant qui implique l’imagerie non destructive des structures internes à des résolutions élevées dans des modèles animaux vivants. Cela permet une imagerie répétée du rongeur même au fil du temps. Cette fonctionnalité non seulement réduit le nombre total de rongeurs requis dans un dispositif expérimental et réduit ainsi la variation inter-sujet qui peut survenir, mais permet également aux chercheurs d’évaluer les réponses longitudinales et toute la vie à une intervention. Pour acquérir des images de haute qualité qui peuvent être traitées et analysées afin de quantifier plus précisément les résultats de la microarchitecture osseuse, utilisateurs de scanners de µCT en vivo doivent correctement anesthésier le rat et positionner et immobiliser le membre postérieur. Pour ce faire, il est impératif que le rat être anesthésiés à un niveau de relaxation complète, et que les réflexes pédales sont perdus. Ces lignes directrices peuvent être modifiés pour chaque rat individuel, comme le taux de métabolisme isoflurane peut varier selon la taille de la souche et le corps. La technique appropriée pour l’acquisition d’images in vivo µCT permet une mesure précise et cohérente de l’OS micro-architecture au sein et entre les études.

Cette méthode d’anesthésie pour le rat et le positionnement et la retenue du membre postérieur pour l’imagerie in vivo µCT facilite l’acquisition de haute qualité images adéquat pour l’analyse du tibia microarchitecture. Le positionnement de la patte de rat implique la jambe étant étirée et l’ensemble pied et la cheville maîtrisé de mousse (Figure 1 a), ayant pour résultat une image acquise d’une qualité suffisante pour l’analyse de la (micro-architecture trabéculaire et corticale Figure 1 b). Placement insuffisant et retenue du membre postérieur (Figure 1) peut entraîner des images avec des artefacts de mouvement (Figure 1), alors qu’une queue qui n’est pas complètement retirée de la numérisation du champ de vision (Figure 1E) interférera avec x-ray atténuation par les échantillons numérisés (Figure 1F) et modifier les mesures de densité minérale (TMD) BMD et tissus. Ou l’autre de ces erreurs de placement se traduira par un balayage de mauvaise qualité qui ne doit pas être analysé plus loin. Réalisation d’images de mauvaise qualité vont changer la quantification du réseau trabéculaire fine et une structure corticale du membre postérieur et produiront des données inappropriées ou non concluants,14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56346/56346fig1.jpg"> La figure 1. Des images représentatives de la mise en place de la patte du rat et des images acquises correspondantes du tibia proximal en coupe transversale. (A) le positionnement correct de la patte de rat avec la cheville entièrement maîtrisée de mousse, jambe étendue et queue dégagea de tibia fournit une qualité d’image suffisante en coupe transversale (B) du tibia et sa trabéculaire et corticale microarchitecture. (C) placement incorrect de la patte de rat avec la jambe pas étirée et cheville pas totalement maîtrisée de mousse peut entraîner les artefacts de mouvement (D), considérés comme des stries en coupe transversale. (E) objets de gêner le champ de vision, telles que la queue n’a ne pas tirée loin du tibia (F) interfère avec l’atténuation des rayons x de tibia et peut se traduire par BMD altérée et TMD mesures, bien que pas visuellement évident. Le coin inférieur gauche au panneau F montre une partie de queue dans le champ de vision, qui interférait avec le faisceau de rayons x qui ont transité par la suite le tibia. Les lignes pointillées rouges dans les panneaux de gauche indiquent la section présentée sur les panneaux de droite. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/56346fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Supplémentaire Figure 1. Unité anesthésie isoflurane Isoflurane anesthésique unité mise en place de fournir 3 à 4 % isoflurane dissous dans O2 à un débit continu de 1 à 2 L/min pour l’induction de l’anesthésie générale. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_1.jpg">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.</a>
Supplémentaires Figure 2. Veiller à ce que la profondeur de l’anesthésie. Réflexes pédales mesure en pinçant les orteils du rat recevant continu inhalé anesthésique par un masque facial ou le cône de nez. La réponse de la douleur est plus évidente lorsque la jambe est légèrement étendue. Très fortes pincées ou l’utilisation de forceps ou de pinces peut induire des lésions tissulaires et ne doit donc pas être utilisée. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_2.jpg">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.</a>
Supplémentaire Figure 3. Capture d’écran de la vue de caméra surveillance physiologique direct. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_3.jpg">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.</a>
Supplémentaires Figure 4. Rat portant en position couchée sur le lit de scanner en fibre de carbone. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_4.jpg">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.</a>
Supplémentaire Figure 5. Droit pied du rat immobilisé dans un tube de mousse malléable. Pied droit du rat est attaché dans un tube de mousse malléable avec les orteils s’étendant hors du tube (non représenté ici). Le tube de mousse est attaché dans un support en plastique (veuillez vous référer à la Table des matières/équipements spécifiques pour plus d’informations). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_5.jpg">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.</a>
Supplémentaires Figure 6. Rat attaché en position avec la jambe droite étendue directement. Le pied arrière et gauche est collé à la jambe droite (vers le torse), les hanches sont sécurisés et le torse de rat est encapsulé dans EFP-wrap (bleu) pour limiter les pertes de chaleur. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_6.jpg">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.</a>

Cet article indique au utilisateurs de scanners de micro-la tomodensitométrie (µCT) in vivo comment anesthésier, correctement positionner et immobiliser le membre postérieur d’un rat pour mouvement minimal au cours de l’imagerie à haute résolution du tibia. Il en résulte des images de haute qualité qui peuvent être traitées afin de quantifier précisément la microarchitecture osseuse.

Le positionnement et la retenue d’une patte de Rat pour l’imagerie ciblée haute résolution des os à l’aide de la micro-architecture In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

L’objectif global de cette procédure est de positionner et de retenir correctement un membre postérieur de rat pour l’acquisition d’images focalisées à haute résolution de la micro-architecture osseuse du tibia proximal et du fémur distal à l’aide de la micro-tomographie in vivo. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur l’acquisition d’images In Vivo par micro CT et fournit des conseils pour le bon positionnement et la contention du membre postérieur. Le principal avantage de cette procédure est qu’il est possible d’acquérir des images très cohérentes et de les utiliser pour quantifier les changements de microarchitecture osseuse qui se produisent lors d’études longitudinales.Placez le rat en position couchée sur un lit de scanner en fibre de carbone. Après avoir confirmé le niveau approprié de sédation par absence de réponse au pincement des orteils, appliquez une lubrification ophtalmique sur les yeux de l’animal. Retenez le pied dans un tube de mousse malléable avec les orteils dépassant d’une extrémité, et appliquez de la cire dentaire pour maintenir le pied fermement dans la mousse, en veillant à ce que la mousse ne s’étende pas sur la région d’intérêt.Fermez hermétiquement le tube avec du ruban adhésif et insérez la mousse dans le tube. Vérifiez que la mousse et le tube sont bien ajustés et glissez le tube dans le lit du scanner à rayons X. Étendez le membre postérieur jusqu’à ce que la jambe soit tendue.Confirmer un manque de surextension en palpant la position de l’articulation du genou et en tirant le membre postérieur opposé et la queue vers le torse. En étendant le membre postérieur loin du torse jusqu’à ce que la jambe soit tendue, assurez-vous que la radiographie traversera toutes les régions de l’os de la même manière que possible. Ensuite, épongez le côté adhésif de plusieurs morceaux de ruban de masquage et utilisez le ruban modifié pour fixer le membre postérieur et la queue non étendus, afin qu’ils restent hors du champ de vision du balayage.Ensuite, fixez les hanches, les épaules, la tête et le cône nasal au lit de numérisation. Enveloppez l’animal dans un film vétérinaire pour limiter les pertes de chaleur et imagez l’animal par micro tomographie en utilisant les paramètres expérimentaux appropriés selon les protocoles standards. Lorsque toutes les images ont été acquises, laissez l’animal se rétablir dans une cage individuelle partiellement chauffée avec surveillance jusqu’à sa décubitus complète.Le bon positionnement de la patte postérieure du rat implique que la jambe soit complètement étendue et que tout le pied et la cheville soient retenus dans de la mousse, ce qui permet d’obtenir une image acquise de qualité suffisante pour l’analyse de la micro-architecture trabéculaire et corticale. Un placement et une contention insuffisants du membre postérieur peuvent entraîner des images avec des artefacts de mouvement, tandis qu’une queue qui n’est pas complètement retirée du champ de vision de balayage interférera avec l’atténuation des rayons X par les échantillons numérisés et modifiera les mesures de densité minérale de la moelle osseuse et des tissus. Une fois maîtrisée, cette procédure peut être correctement effectuée en 5 à 10 minutes.Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de toujours être conscient de la fréquence respiratoire, du niveau de sédation et de la quantité d’exposition aux radiations du rat. Cette procédure peut être modifiée et utilisée pour évaluer d’autres sites squelettiques, tels que le fémur distal et les vertèbres de bois. De plus, cette procédure peut être modifiée et utilisée pour d’autres espèces de rongeurs comme les souris.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de positionner et de retenir correctement le membre postérieur du rat, pour la mise au point et l’imagerie haute résolution cohérente de la micro-architecture osseuse du tibia proximal.

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Le positionnement et la retenue d’une patte de Rat pour l’imagerie ciblée haute résolution des os à l’aide de la micro-architecture In Vivo Micro-computed Tomography

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