Essai de phagocytose pour les cellules apoptotiques dans Drosophila Embryons

Nous décrivons ici un test de phagocytose utilisant les cellules embryonnaires dispersées de Drosophila . Il nous permet de quantifier facilement et précisément les niveaux de phagocytose in vivo et d'identifier de nouvelles molécules requises pour la phagocytose des cellules apoptotiques.

L’objectif global de cette procédure est de mesurer la phagocytose in vivo chez la drosophile afin d’évaluer l’implication de gènes spécifiques d’intérêt dans l’engloutissement cellulaire apoptotique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’immunologie et de la biologie du développement sur les mécanismes impliqués dans l’engloutissement des cellules apoptotiques. Le principal avantage de cette technique est que les cellules peuvent être utilisées facilement et avec précision pour mesurer les niveaux de phagocytose in vivo.

L’implication de cette technique s’étend au traitement des troubles inflammatoires et des maladies auto-immunes, car la cellule apoptotique par phagocytose est nécessaire pour éliminer les cellules dangereuses qui causent l’inflammation. Commencez par ajouter 200 mouches à fruits femelles adultes et 200 mouches mâles adultes et une assiette de gélose au jus de raisin frais sur levure dans un tube conique de 50 millilitres. Fermez le tube avec un capuchon éponge et incubez les mouches à la lumière de 16 degrés Celsius pendant deux à trois jours.

À la fin de l’incubation, déplacez les mouches à 25 degrés Celsius dans l’obscurité pendant une heure et remplacez l’ancienne assiette par une nouvelle assiette sans levure. Laissez les mouches pondre des œufs pendant deux heures. Ensuite, incubez la plaque à 16 degrés Celsius pendant 26 heures.

Le lendemain, à l’aide d’un pinceau, transférez les embryons dans un millilitre de PBS complété par 0,2 % de Triton X-100. Après deux lavages, ajoutez 1,2 millilitre de solution d’hypochlorite de sodium aux embryons pour retirer le chorion. Après trois minutes, lavez les embryons quatre fois dans du PBS frais plus Triton X-100.

Transférez les embryons lavés sur une plaque d’agarose de six centimètres et placez la plaque sous un microscope à dissection. Identifiez les embryons de stade 16 à l’aide d’une micro-pointe. À l’aide d’une micro-pipette, transférez environ 50 des embryons du stade 16 dans un micro-tube à essai de 1,5 millilitre.

Pour isoler les cellules embryonnaires, lavez d’abord les embryons deux fois avec 150 microlitres de PBS. Transférez les embryons dans un nouveau micro-tube à essai de 1,5 millilitre. Ajoutez ensuite 200 microlitres de collagénase et homogénéisez les embryons 30 fois avec un mélangeur à granulés.

À la fin de l’homogénéisation, triturez 10 fois les cellules embryonnaires et transférez la suspension cellulaire dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant une minute. Ensuite, triturez les cellules 10 fois de plus et remettez-les dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant une minute supplémentaire.

À la fin de la deuxième incubation, ajoutez 800 microlitres de PBS aux cellules et collectez les cellules par centrifugation. Remettre la pastille en suspension dans 200 microlitres de trypsine avant de filtrer la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 70 microns. Arrêtez l’activité enzymatique avec 40 microlitres de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur dans 800 microlitres de PBS et collectez les cellules par centrifugation.

Remettre en suspension les cellules précipitées dans 200 microlitres de PBS frais et collecter les cellules avec une autre centrifugation. Remettez la pastille en suspension dans 30 microlitres de PBS et montez les cellules sur une lame de verre recouverte d’aminopropyltriéthoxysilane. Lorsque les cellules sont fixées, utilisez une pipette pour retirer l’excès de PBS de la lame et fixez les cellules avec 60 à 70 microlitres de paraformaldéhyde à 4 %.

Après 10 à 15 minutes, retirez le fixateur et lavez les cellules dans du PBS pendant une minute. Pour immunocolorer les cellules avec un anticorps anti-Croquemort, trempez d’abord la lame en série dans du méthanol, puis du PBS complété par 0,2 % de Triton X-100, suivi de PBS seul. Ensuite, bloquez la liaison non spécifique avec 20 microlitres de sérum de porc entier à 5 % dans du PBS plus 0,2 % de Triton X-100 pendant 20 minutes à température ambiante.

Retirez l’excès de solution bloquante et étiquetez les cellules avec 20 microlitres d’antisérum anti-Croquemort à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, lavez la lame dans du PBS plus Triton X-100 pour cinq incubations de 10 minutes. Après le dernier lavage, rincez la lame dans du PBS pendant 10 minutes.

Ensuite, étiquetez les cellules avec 20 microlitres d’IgG anti-rat marqués à la phosphatase alcaline à température ambiante pendant une heure. À la fin de l’incubation, laver la lame cinq fois dans du PBS plus Triton X-100 comme il a été démontré, puis l’immerger pendant 10 minutes dans une solution tampon. Ensuite, marquez les cellules avec une solution de substrat de phosphatase et observez les cellules au microscope optique.

Lorsque de forts signaux violets apparaissent dans les granules d’hémocytes, retirez l’excès de substrat et trempez la lame dans un tampon complété par de l’EDTA pendant cinq à 10 minutes. À la fin de l’incubation, rincez les cellules avec deux lavages PBS de cinq minutes et traitez-les avec un tampon d’équilibrage pendant 10 minutes. Après avoir retiré la solution, étiquetez les cellules avec 20 microlitres de solution terminale de désoxynucléotidyltransférase à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Ensuite, retirez la solution de la lame et faites tremper les cellules dans 0,5 millilitres de tampon d’arrêt de lavage dans 17 millilitres d’eau pendant 10 minutes. Ensuite, rincez les cellules avec trois lavages PBS de cinq minutes et étiquetez-les avec 20 microlitres d’anti-digoxigénine peroxydase pendant 30 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, lavez les cellules quatre fois dans du PBS comme démontré et trempez la lame dans un substrat de peroxydase par incréments de 30 secondes jusqu’à ce que les cellules apoptotiques deviennent brunes.

Lorsqu’une coloration optimale a été obtenue, trempez la lame dans l’eau pour arrêter la réaction de la peroxydase. Dans ces images, des macrophages de drosophile appelés hémocytes ont été colorés pour le marqueur hémocytaire Croquemort et pour la présence de cellules apoptotiques phagocytées par TUNEL dans des cellules embryonnaires dispersées comme nous venons de le démontrer. Les cellules positives à Croquemort présentent des signaux violets dans les petits granules de leurs cellules, tandis que les cellules positives à TUNEL ont montré un signal brun dans l’ensemble de leurs corps.

Alternativement, les hémocytes peuvent être colorés avec un anticorps anti-GFP qui colore l’ensemble de l’hémocyte au lieu de seulement les granules. Dans cette expérience, le rapport entre les hémocytes phagocytants et les hémocytes totaux chez les embryons de type sauvage ou les embryons mutants uniques a été analysé, démontrant que l’indice phagocytaire était plus faible dans les deux souches mutantes simples que chez les mouches de type sauvage, tandis que le nombre total d’hémocytes et de cellules apoptotiques était similaire, ce qui indique la nécessité des gènes mutés pour l’engloutissement des cellules apoptotiques. L’inactivation de l’ARNi de gènes uniques réduit également l’indice phagocytaire, tandis que le nombre total d’hémocytes et de cellules apoptotiques est resté comparable, ce qui souligne davantage l’implication des récepteurs de phagocytose étudiés dans la phagocytose médiée par les cellules apoptotiques.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 15 heures environ si elle est exécutée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’éviter l’excès de marqueur hémocytaire et la coloration TUNEL pour une évaluation optimale de la capacité phagocytotique des cellules. À la suite de cette procédure, un test de phagocytose in situ de tous les embryons de drosophile peut être effectué pour répondre à des questions supplémentaires sur le site d’engloutissement ou la distribution des hémocytes.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs en immunologie pour explorer les mécanismes de l’engloutissement cellulaire apoptotique chez la drosophile. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer la phagocytose in vivo chez les embryons de drosophile.