Name: Division cellulaire chez les mammifères dans des Matrices 3D par microscopie Quantitative réflexion Confocal (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Découvrez la division cellulaire des mammifères dans des matrices 3D de collagène par microscopie confocale quantitative. Cette méthode permet d'étudier les interactions cellule-matrice dans un environnement physiologiquement pertinent.

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Ce travail a été soutenu par les NIH accorde R01CA174388 et U54CA143868. Les auteurs aimerait remercier le prix PURA de l’Université Johns Hopkins, pour le soutien de Chen Wei-tong. Ce matériel est basé sur le travail soutenu par la National Science Foundation recherche bourse d’études supérieures au titre de la subvention no 1232825.

Le protocole fourni respecte les directives de la Homewood institutionnels Review Board (HIRB).
1. stable Expression de H2B-mCherry comme un marqueur de cellule mitose
<ol><li>
Génération de Particules Lentivirales rein embryonnaires humaines 293 t (HEK 293 t) cellules
	<ol>
<li>Les cellules HEK 293 t sur un plat de culture cellulaire de 10 cm à la densité de 5 x 106 cellules/plat au milieu de culture cellulaire (de Dulbecco Medium (DMEM) contenant hyperglycémie Modified Eagle (4,5 g/L), pyruvate de sodium, 10 % sérum bovin fœtal (SVF) et 1 % de la plaque pénicilline-streptomycine (Pen/Strep)). Incuber 24 h à 37 ° C et 5 % de dioxyde de carbone (CO2). La confluence souhaitée des cellules sur le jour de la transfection est environ 70 à 80 %. Remarque : Des cellules HEK 293 t sont utilisés ici pour produire des particules virales, qui seront utilisés plus tard pour transmettre les cellules MDA-MB-231 afin de produire une lignée de cellules exprimant de manière stable H2B-mCherry. Assurez-vous que les cellules sont répartis uniformément sur la plaque. Ajout des cellules drop sage de la plaque, et déplace doucement la plaque en arrière peut aider à la distribution uniforme. Les cellules peuvent également être ensemencés en assiettes ou de flacons d’autres tailles, qui seront traduira par la collection de volumes différents des particules virales.</li>
		<li>Transfecter les cellules HEK 293 t en utilisant un réactif de transfection avec trois plasmides (vecteur lentiviral, CMV ΔR 8,91 et pMDG-VSVG). Le plasmide codant H2B-mCherry est cloné dans un vecteur lentiviral avec promoteur de phosphoglycérate kinase (PGK). CMV ΔR 8,91 contient trois requis VIH gènes gag, polet rev. pMDG-VSVG contient le gène d’enveloppe de VSV-G. Remarque : Il existe plusieurs agents de transfection à choisir.<ol>
<li>Laisser le flacon de réactif de transfection à température ambiante (RT) avant utilisation. Inverti ou vortex le flacon brièvement.</li>
			<li>Mix 16 µg d’ADN, qui se compose de 6 µg de plasmide H2B-mCherry et 8 µg de CMV ΔR 8,91 2 µg de pMDG-VSVG, dans 1 mL de médias de sérum réduit. Incuber 5 min à RT. Remarque : La quantité et le rapport des trois vecteurs est variée et optimisé pour les vecteurs de transfert des gènes différents.</li>
			<li>Ajouter 48 µL (utiliser le rapport 1:3 d’ADN : réactif de transfection) du réactif de transfection dans la solution ci-dessus de l’ADN et puis incuber à RT pendant au moins 15 minutes. NOTE : Le rapport entre l’ADN vs réactif de transfection est variée et optimisé pour les vecteurs de transfert des gènes différents. Assurez-vous que le réactif de transfection ne contacte pas le côté du tube de centrifugation de 1,5 mL.</li>
			<li>Ajouter la solution complexe ADN-lipides effectuée à l’étape 1.1.2.3 goutte-à-goutte aux cellules. Agiter doucement de la plaque afin d’assurer la distribution uniforme de l’ensemble de la plaque.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Environ 6 h après la transfection, aspirer le milieu et ajouter le milieu de culture de cellules fraîches (DMEM avec hyperglycémie (4,5 g/L), pyruvate de sodium, 10 % de SVF et 1 % Pen/infection streptococcique).</li>
		<li>Récolter le surnageant 24, 48 et transfection après 72 h. Remplacer le support après chaque récolte (DMEM, 4,5 g/L de glucose, de pyruvate de sodium, avec 10 % de SVF et 1 % Pen/infection streptococcique).</li>
		<li>Les particules Lentivirales filtrer sur un filtre de 0,45 µm pour éliminer les débris cellulaires. Sinon, tournez en bas le surnageant pour séparer les débris cellulaires. Le surnageant peut être utilisé pour la transduction tout de suite, ou peut être stocké à-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Génération de cellule lignes exprimant stablement H2B-mCherry Remarque : Ce protocole est décrit en détail pour les cellules MDA-MB-231. Avant de l’utiliser dans l’expérience, les cellules de carcinome mammaire humain MDA-MB-231 (Centre d’oncologie Sciences physique, NIH) sont cultivées en DMEM contenant des taux de glycémie élevé (4,5 g/L), pyruvate de sodium, 10 % SVF et 1 % Pen/Strep.<ol>
<li>Les cellules MDA-MB-231 à la densité des cellules5 1 x 10 dans une boîte de Petri de 35 mm de la plaque. Remarque : La densité de placage de différentes lignées cellulaires doit être optimisée et par conséquent peut être différente de la densité optimale pour les cellules MDA-MB-231.</li>
		<li>24 h après l’ensemencement les cellules, ajouter 1 mL de virus et 1 mL de milieu frais (DMEM, hyperglycémie (4,5 g/L), pyruvate de sodium, 10 % de SVF et 1 % Pen/infection streptococcique).</li>
		<li>Incuber les cellules pendant un laps de temps de 6 h à la nuit. NOTE : Fois le volume du virus et le temps d’incubation doivent être optimisés pour différentes lignées cellulaires. Par exemple, si les cellules ne regardent pas en bonne santé quelques heures après l’ajout du virus, utiliser 1 mL du virus et 2 mL de milieu frais (DMEM, hyperglycémie (4,5 g/L), pyruvate de sodium, 10 % de SVF et 1 % Pen/Strep) pour l’étape 1.2.2. La durée de l’incubation à l’étape 1.2.3 peut également être réduite.</li>
		<li>Aspirer le milieu et ajouter 10 mL de milieu frais (DMEM, hyperglycémie (4,5 g/L), pyruvate de sodium, 10 % de SVF et 1 % Pen/infection streptococcique). Incuber pendant 24 à 72 h à 37 ° C et 5 % de CO2.</li>
		<li>Contrôler l’expression de H2B-mCherry dans les cellules à l’aide d’un microscope à épifluorescence. Remarque : Si l’efficacité de la transduction est faible dans les cellules, le volume du virus à l’étape 2.2 et le temps d’incubation à l’étape 2.3 pourrait être augmenté.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. synchronisation des cellules exprimant de manière stable H2B-mCherry
<ol><li>Plaque de cellules des cellules à 50 à 60 % confluency, c'est-à-dire la plaque de 2 x 104 MDA-MB-231 dans chaque puits d’une plaque 24 puits.</li>
	<li>Incuber la culture à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 24 h.</li>
	<li>Remplacer le milieu de culture avec 0,5 mL de milieu (DMEM, hyperglycémie (4,5 g/L), pyruvate de sodium, 10 % de SVF et 1 % Pen/Strep) contenant la thymidine 2 mM et laisser dans l’incubateur pendant 24 h. Remarque : Les cellules exposées à la thymidine sont arrêtés lors de la phase de croissance cellulaire (G1) / transition (S) de la synthèse de l’ADN et tout au long de la phase S en raison de l’inhibition de la synthèse de l’ADN. La durée de l’incubation doit être variée et optimisée pour différentes lignées cellulaires.</li>
	<li>Libérer les cellules de l’exposition de la thymidine en les lavant avec du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS) trois fois. Puis, incuber les cellules dans un milieu de culture cellulaire normale (DMEM, hyperglycémie (4,5 g/L), pyruvate de sodium, 10 % de SVF et 1 % Pen/Strep) pendant 5 h. Remarque : La libération des cellules par l’exposition de thymidine permet aux cellules de progresser à la croissance cellulaire (G2) / phase mitotique de (M) pour les cellules précédemment arrêté lors de la phase G1/S et la phase G1 pour les cellules déjà arrêté à la S phase. La durée du congé doit être variée et optimisée pour différentes lignées cellulaires.</li>
	<li>Bloquer les cellules avec 250 ng/mL de la nocodazole pendant 12 h. Remarque : Toutes les cellules exposées à la nocodazole sont arrêtés lors de la phase G2/M. Nocodazole est cytotoxique. Une exposition prolongée à la nocodazole peut provoquer l’apoptose. Ajuster la période ou la concentration d’exposition pour les différentes lignées cellulaires si décès de cellule sont observées. Les cellules qui sont correctement synchronisées exposera une morphologie sphérique.</li>
	<li>Secouer les cellules pour 45 s à 1 min à l’aide d’un agitateur orbital à 150 à 200 tr/min. Remarque : Les cellules mitotiques, qui ont peu d’adhérence au substrat, seront ébranlées au cours du processus.</li>
	<li>Retirez le support pour extraire des cellules, en pipettant également, le milieu dans un tube à centrifuger et puis ajouter 0,5 mL de milieu frais (DMEM, hyperglycémie (4,5 g/L), pyruvate de sodium, 10 % de SVF et 1 % Pen/Strep) dans chaque puits de la plaque.</li>
	<li>Répétez les étapes 2.6 et 2.7 trois fois.</li>
	<li>Centrifuger le milieu collecté contenant les cellules mitotiques à 800 g pendant 3 min. Remarque : Cette étape sert à retirer la nocodazole le milieu cellulaire.</li>
</ol>3. l’incorporation de la synchronisation des cellules dans le collagène j’ai Matrices
NOTE : J’ai du Type collagène est la protéine la plus abondante dans le corps humain et dans l’ECM des tissus conjonctifs et ainsi est employé couramment pour enquêter sur des cellules eucaryotes comment fonctions sont modulées par un environnement 3D17,23,24 . Le collagène est soluble dans l’acide acétique. Après neutralisation et la solution de collagène à 20-37 ° C le réchauffement, les monomères de collagène se polymérisent dans un réseau de fibrilles de collagène.
<ol><li>Préparer la solution de x DMEM 10 en dissolvant un paquet de poudre DMEM, 3,7 g de bicarbonate de sodium (NaHCO3) et 1 g d’acide-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 4 (HEPES) dans 50 mL d’eau distillée. Filtrer la solution et puis préparer 1 M d’hydroxyde de sodium (NaOH) dissoudre 2 g de pastilles de NaOH dans 50 mL d’eau distillée. Filtre et partie aliquote de la solution dans les tubes à centrifuger 1,5 mL. NOTE : Solution DMEM Normal ne doit pas être utilisée dans cette étape. L’ajout d’un volume significatif de la solution de collagène va diluer le milieu. La solution concentrée de DMEM est donc disposée à faire en sorte que la concentration finale de DMEM dans la matrice de collagène sera le même que le DMEM normal.</li>
	<li>Continuer à travailler avec les cellules recueillies à l’étape 2,9. Aspirez le milieu et remettre en suspension les cellules à environ 0,25 - 0,5 mL de milieu de culture de cellules fraîches (DMEM, hyperglycémie (4,5 g/L), pyruvate de sodium, 10 % de SVF et 1 % Pen/infection streptococcique). Remarque : Pour atteindre une densité cellulaire spécifique dans la matrice de collagène, la densité initiale des cellules de la suspension ne peut pas être trop basses. Ainsi, le volume du milieu utilisé pour remettre en suspension les cellules dépendra du nombre total de cellules disponibles.</li>
	<li>Déposer 10 µL de la solution de remises en suspension cellulaire de l’étape 3.2 sur un hémocytomètre et compte la densité des cellules dans la solution.</li>
	<li>
Déterminer les volumes nécessaires pour tous les composants réaliser la matrice de collagène 3D. 500 µL de 2 gel de collagène µg/µL est utilisé ici comme un exemple.
	<ol>
<li>Calculer le volume de la solution de cellules nécessaire pour obtenir 40 000 cellules/mL (ou 20 000 cellules pour la 500 µL de gel de collagène). Ce numéro µL est X. 50 µL de 10 x DMEM est nécessaires. 50 µL de FBS sera nécessaire.</li>
		<li>Calculer le volume du collagène que je stock nécessaire. La concentration de collagène I est autour de 4 µg/µL. La quantité de collagène nécessaire en µL est Y.</li>
		<li>Calculer le volume d’hydroxyde de sodium nécessaire neutraliser l’acide acétique dans la solution de collagène : collagène µL Y * 0,023 * 1000 = Z µL NaOH nécessaire.</li>
		<li>Déterminer le volume de la solution de remplissage : (500 µL gel totale - cellules X µL - 50 µL 10 X collagène DMEM - 50 µL de FBS - Y µL - Z µL NaOH) = R µL Remarque : La solution de remplissage est distillée à l’eau. Si la valeur de la solution de remplissage est un nombre négatif, la densité cellulaire original dans la suspension cellulaire est trop faible. Les cellules ont besoin d’être tourné vers le bas encore une fois et remis en suspension dans un plus petit volume de milieu (DMEM, hyperglycémie (4,5 g/L), pyruvate de sodium, 10 % de SVF et 1 % Pen/infection streptococcique).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter les composants dans l’ordre suivant dans un tube à centrifuger propre 1,5 mL : cellules dans un milieu, 10 x DMEM, FBS, l’eau désionisée (DI), collagène, NaOH. Placez tous les composants sur la glace pour ralentir la gélification de la solution de collagène. Utiliser les techniques appropriées de pipetage pour éviter la formation de bulles.</li>
	<li>Après avoir ajouté le NaOH, mélanger la solution soigneusement avec une pipette de 1 mL. NOTE : Gélification du collagène va commencer droite immédiatement après l’addition de NaOH. Mélange doit être faite avec soin et rapidement.</li>
	<li>Une fois que la solution est bien mélangée, ajouter 500 µL de la solution dans chaque puits de la plaque 24 puits. Placer la plaque 24 puits dans un incubateur à 37 ° C. Placez le milieu de culture de cellules fraîches dans le bain-marie à 37 ° C. Remarque : Les plaques de fond en plastique sont utilisés pour microcopy de cellules vivantes de faible grossissement dans lequel le travail à distance de la lentille est dessus verre fond mm 1. plaques sont utilisées pour la microscopie de cellules vivantes à fort grossissement en raison de la courte distance de travail de la haute lentille de grossissement.</li>
	<li>Ajouter 500 µL de milieu préchauffé (DMEM, hyperglycémie (4,5 g/L), pyruvate de sodium, 10 % de SVF et 1 % Pen/Strep) vers le haut du gel 30 min après la fin de l’étape 3,7.</li>
</ol>4. vivre l’imagerie cellulaire des cellules divisant dans la matrice de collagène 3D (faible grossissement)
NOTE : Images de cellules sont recueillies à des intervalles de 2 min en utilisant une caméra de dispositif couplé (DAC) frais montée sur un microscope à contraste de phase qui est équipé d’un objectif 10 X et contrôlé par logiciel d’imagerie.
<ol><li>Allumez le groupe de cellules vivantes monté sur le dessus de l’objectif. Attendez que la température se stabilise à 37 ° C, la concentration de CO2 est à 5 % et le taux d’humidité est à 75 %.</li>
	<li>Mettre la plaque 24 puits de gels dans l’unité de cellules vivantes sur le microscope. Trouver le fond de la plaque, puis déplacez la lentille de l’objectif jusqu'à ce que le microscope se concentre à environ 500 µm de la partie inférieure de la plaque. Remarque : Les cellules dans la matrice de collagène qui sont trop près de la partie inférieure de la plaque ne sont pas entièrement noyés dans la matrice 3D. Imagerie de cellules qui sont 500 µm loin de la partie inférieure de la plaque fera en sorte que les cellules ne sont pas affectés par les effets de bord16,17,25.</li>
	<li>Déplacer la scène autour pour trouver les cellules, puis sélectionnez plusieurs postes pour l’imagerie.</li>
	<li>Mettre en place l’expérience Time-lapse à intervalles de 2 min. Remarque : Le nombre maximal de postes qui peuvent être prises pendant l’intervalle de 2 min est limité par la vitesse de déplacement de la platine motorisée et la durée de l’exposition pour capturer des images.</li>
</ol>5. collagène réseau déformation pendant la Division cellulaire (microscopie fort grossissement)
<ol><li>Allumez le groupe de cellules vivantes monté sur le dessus de l’objectif. Attendez que la température se stabilise à 37 ° C, la concentration de CO2 est à 5 % et le taux d’humidité est à 75 %.</li>
	<li>Afin de visualiser les fibres de collagène dans les matrices de collagène 3D colorées ou non, configurer un microscope confocal pour capturer seulement lumière réfléchie (488 nm) du 488 nm laser servant à éclairer l’échantillon. Le laser utilise un 60 X objectif immersion dans l’eau, NA = 1.2, WD = 200 µm et est contrôlé par le logiciel d’imagerie.</li>
	<li>Mettre l’échantillon (cellules de matrices de collagène) dans l’unité de cellules vivantes. Trouver le fond de la plaque, puis déplacez la lentille de l’objectif jusqu'à ce que le microscope se concentre à environ 100 µm de la partie inférieure de la plaque. Imagerie de cellules qui sont à 100 µm de la partie inférieure de la plaque fera en sorte que les cellules ne sont pas affectés par les effets de bord. NOTE : Ici un objectif à immersion dans l’eau est utilisé au lieu d’un objectif à immersion dans l’huile parce que la distance de travail de la lentille immersion dans l’huile est seulement environ 100 µm. L’utilisation de l’objectif à immersion dans l’huile pose un problème car l’épaisseur du verre sur la partie inférieure de la plaque est normalement d’environ 100 µm.</li>
	<li>Déplacer la scène autour pour trouver les cellules, puis sélectionnez plusieurs postes pour l’imagerie. Remarque : La microscopie confocale sections optiquement l’échantillon et seulement capte les signaux du plan focal. Des cellules vivantes peuvent se déplacer dans et hors de discussion pendant l’expérience de Time-lapse. Pour activer la capture d’images de cellules sur de longues périodes de temps, Z-pile est utilisée pour recueillir des images des tranches successives à intervalle de 5 µm. Un total de 5 tranches s’étendant sur 25 µm sont imagés.</li>
	<li>Mettre en place l’expérience Time-lapse à intervalles de 5 min. Remarque : 5 minutes est utilisé ici comme l’intervalle au lieu de 2 min, utilisé à l’article 4, car plusieurs modes de balayage, y compris fluorescence recherchant les H2B-mCherry, de réflexion à balayage pour le collagène et Z-pile numérisation, sont appliqués à chaque position. L’utilisation de plusieurs modes de balayage réduit la vitesse de balayage d’une position par rapport à l’imagerie de faible grossissement.</li>
	<li>Quantifier la déformation de la matrice de collagène dans le voisinage une cellule en raison des forces exercées par cette cellule à l’aide de particle imaging velocimetry (PIV) avec résolution de sous-pixel20. Cette analyse sur des images 2D permet la visualisation claire des deux signaux de la H2B-mCherry et les fibres de collagène. Appliquer le passe-bas anisotrope de filtrage afin d’améliorer le signal du réseau collagène20.</li>
	<li>Afin de mesurer le déplacement local d’une région de sous-image d’intérêt situé à (x,y) du châssis k pour k+ 1 du cadre, extraire une fenêtre régionale de 15 × 15 pixels centrée à (x,y) à armature k. Ensuite, identifiez le meilleur appariement des lieux (x,y) * dans les endroits qui présentent un coefficient de corrélation croisée normalisé maximal dans l’image obtenue à armature k+ 1. Le vecteur de la déformation est calculé sous la forme (x,y) *-(x,y).</li>
</ol>

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<li>Fraley, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinctive+role+for+focal+adhesion+proteins+in+three-dimensional+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility.</a> Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).</li>
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<li>Harjanto, D., Maffei, J. S., Zaman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+effect+of+cancer+invasiveness+and+collagen+concentration+on+3D+matrix+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the effect of cancer invasiveness and collagen concentration on 3D matrix remodeling.</a> PLoS One. 6 (9), e24891(2011).</li>
<li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li>
<li>Petroll, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+interference+contrast+and+confocal+reflectance+imaging+of+collagen+organization+in+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Differential interference contrast and confocal reflectance imaging of collagen organization in three-dimensional matrices.</a> Scanning. 28 (6), 305-310 (2006).</li>
<li>Fraley, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+matrix+fiber+alignment+modulates+cell+migration+and+MT1-MMP+utility+by+spatially+and+temporally+directing+protrusions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional matrix fiber alignment modulates cell migration and MT1-MMP utility by spatially and temporally directing protrusions.</a> Sci Rep. 5, 14580(2015).</li>
<li>Ikeda, Y., Collins, M. K., Radcliffe, P. A., Mitrophanous, K. A., Takeuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transduction+efficiency+in+cells+of+different+species+by+HIV+and+EIAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene transduction efficiency in cells of different species by HIV and EIAV vectors.</a> Gene Ther. 9 (14), 932-938 (2002).</li>
<li>Ma, H. T., Poon, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Synchronization of HeLa cells.</a> Methods Mol Biol. 761, 151-161 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

L’étude précédente de la division cellulaire en 3D n’était pas efficace en raison de limitations expérimentales et défis techniques18,19. Les étapes essentielles pour une étude efficace de la division cellulaire chez les mammifères dans les matrices de collagène 3D sont : (1) l’incorporation de marqueurs mitotiques marqués par fluorescence aux cellules ; (2) la synchronisation de la division cellulaire ; et (3) le suivi des événements de la division dans des matr...

Mitose de la cellule est un événement critique dans la vie cellulaire, dont la réglementation joue un rôle crucial dans le développement de tissus et organes. Une mitose anormale est impliquée dans des variations génétiques naturelles, les processus de vieillissement humain et la progression du cancer1,2,3,4,5. L’augmentation du taux de prolifération des cellules tumorales par rapport aux cellules normales est une des caractéristiques du cancer, malgré le fait que les comportements cellulaires sont assez hétérogènes entre les différents types de tumeurs et même chez les patients. En dépit des résultats précliniques prometteurs, certaines drogues antimitotiques nouvellement développé n’ont pas démontré d’être efficaces dans les essais cliniques6,7,8,9,10 ,11. La pertinence des modèles expérimentaux et précliniques doit être considérée. Plusieurs types de cellules normales de mammifères et cancer divisent dans des matrices en trois dimensions (3D), tels que les fibroblastes et cellules de Fibrosarcome en collagène riche j’ai 3D des tissus conjonctifs et cellules cancéreuses métastatiques dans la 3D stromales la matrice extracellulaire (MEC). Cependant, la grande majorité de la division cellulaire chez les mammifères des expériences et des essais ont été réalisée sur les cellules cultivées sur des substrats à deux dimensions (2D). Une matrice 3D ingénierie pourrait mieux récapituler la microstructure et propriétés mécaniques des signaux biochimiques de l’ECM 3D de deux tissus normaux et pathologiques12,13,14, 15,16,17.
L’étude des mammifère comment la division cellulaire est régulée en 3D des environnements demeure largement inexploré malgré la pertinence physiologique tant la signification thérapeutique18,19. Les raisons possibles incluent les difficultés techniques et expérimentales défis associés à étudier la division cellulaire dans des matrices 3D. La mitose cellulaire constitue une petite fraction temporelle dans le cycle cellulaire complet20. Travaux antérieurs ont montré que le taux de prolifération de plusieurs cellules de mammifères, tels que l’adénocarcinome du sein MCF-7, ostéosarcome humain U2OS et foie humain HepG2, est beaucoup plus faible dans des matrices 3D par rapport à leurs homologues sur des substrats 2D21, 22. En outre, les cellules incorporés dans des matrices 3D se déplacent dans et hors de discussion au cours de l’imagerie de cellules vivantes. Tous ces facteurs contribuent à la très faible efficacité de capture d’événements de la division cellulaire en 3D à l’aide de techniques d’imagerie de la culture.
Interactions entre les cellules et ECM jouent un rôle crucial dans la régulation des divisions cellulaires. Nous décrivons ici une approche pour étudier efficacement la division cellulaire chez les mammifères dans des matrices 3D de collagène. La méthode comprend l’incorporation des marqueurs mitotiques pour les cellules, la synchronisation de la division cellulaire, ainsi que le suivi des événements de la division dans des matrices 3D à l’aide de la technique d’imagerie de cellules vivantes, de la microscopie de réflexion confocal résolution temporelle, et analyse d’imagerie quantitative. Protéine de fluorescence-étiquetée histone H2B est tout d’abord introduit dans les cellules comme marqueurs pour différencier mitose et interphase de cellules. Puis les cellules sont synchronisées à l’aide de la combinaison du traitement de blocage et la nocodazole thymidine, suivie d’une technique mécanique de shake-off. Cellules synchrones sont alors directement encapsulées dans des matrices 3D de collagène. Événements de la division cellulaire des cellules multiples sont surveillées efficacement à l’aide de l’imagerie de cellules vivantes Time-lapse faible grossissement. La déformation des fibres de collagène, qui est un indicateur de l’interaction cellule-matrice, est contrôlée au moyen de la microscopie confocale réflexion à fort grossissement.
Nous avons déjà utilisé cette technique pour surveiller et de quantifier l’interaction cellule-matrice avant, pendant et après la mitose de deux lignées de cellules de cancer métastatique, carcinome canalaire invasif humain MDA-MB-231 et les cellules humaines Fibrosarcome HT1080 en collagène 3D 19de matrices. Les méthodes présentées ici fournissent une approche efficace et générale pour étudier les deux mammifères division cellulaire dans une interaction environnement et cellule-matrice 3D. La lignée de cellules MDA-MB-231 est utilisée à titre d’exemple dans le présent document. Ce protocole prévoit de nouveaux aperçus de la base moléculaire du développement des tissus normaux et les maladies et pourrait également permettre la conception de nouvelles approches diagnostiques et thérapeutiques.

<table><tbody><tr><td>Rein embryonnaire humain 293T</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>Centre d’oncologie des sciences physiques, NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM poudre</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12100-046</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine 100X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life technologies</td><td>11668-07</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide codant pour H2B-mCherry dans un vecteur lentiviral</td><td>Plasmide Addgene</td><td>21217</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>GibcoBRL</td><td>11810-025</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>113375-100</td><td></td></tr><tr><td>Collagène</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>J.T. Bake</td><td>3722-01</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV Unité de filtre à seringue, 0.45-&mu ; m, PVDF, 33 mm</td><td>Millipore</td><td>SLHVM33RS</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à épifluorescence Nikon TE2000E Caméra</td><td></td><td></td> CCD TE2000E <td></td></tr><tr><td>Cascade 1K</td><td>Roper Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Logiciel d’imagerie AR</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1 Microscope confocal</td><td>Nikon</td><td>A1</td><td></td></tr></tbody></table>

division cellulaire chez les mammifères dans des matrices 3d par microscopie quantitative réflexion confocal

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

L’étude de la division cellulaire chez les mammifères comment est réglementée dans une 3D environnement demeure largement inexploré malgré sa pertinence physiologique et sa signification thérapeutique. Les raisons possibles de l’absence d’exploration sont les limitations expérimentales et les défis techniques qui rendent l’étude de la division cellulaire en culture 3D inefficace. Nous décrivons ici une méthode axée sur l’imagerie pour étudier efficacement la division cellulaire chez les mammifères et les interactions cellule-matrice dans des matrices 3D de collagène. Cellules marquées avec la H2B fluorescents sont synchronisées à l’aide de la combinaison du traitement de blocage et la nocodazole thymidine, suivie d’une technique mécanique de shake-off. Cellules synchrones sont ensuite incorporées dans une matrice de collagène 3D. La division cellulaire est contrôlée au moyen de la microscopie de cellules vivantes. La déformation des fibres de collagène pendant et après la division cellulaire, qui est un indicateur de l’interaction cellule-matrice, peut être surveillée et quantifiées à l’aide de la microscopie quantitative réflexion confocale. La méthode fournit une approche efficace et générale pour étudier la division cellulaire chez les mammifères et les interactions cellule-matrice dans un environnement 3D physiologiquement pertinent. Cette approche non seulement fournit de nouveaux aperçus de la base moléculaire du développement des tissus normaux et les maladies, mais permet également à la conception de nouvelles approches diagnostiques et thérapeutiques.

L’objectif de cet article est de présenter une méthode axée sur l’imagerie pour étudier les processus de la division cellulaire chez les mammifères dans des matrices 3D et de quantifier les interactions entre la cellule et la matrice extracellulaire 3D pendant et après la division cellulaire. Afin de faciliter l’imagerie de la mitose de la cellule, nous avons incorporé H2B-mCherry dans les cellules MDA-MB-231 à l’aide de transduction des gènes. H2B conjugué avec protéines fluorescentes es...

Ce protocole a efficacement étudie la division cellulaire chez les mammifères dans les matrices de collagène 3D en intégrant la synchronisation de la division cellulaire, la surveillance des manifestations de la division dans des matrices 3D à l’aide de la technique d’imagerie de cellules vivantes, microscopie de réflexion confocal résolution temporelle et analyse d’imagerie quantitative.

Division cellulaire chez les mammifères dans des Matrices 3D par microscopie Quantitative réflexion Confocal

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

L’objectif global de cette procédure est d’étudier la division cellulaire des mammifères et les interactions de la matrice cellulaire dans un environnement 3D physiologiquement pertinent. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une approche efficace et générale pour étudier la division cellulaire des mammifères et les interactions entre la matrice cellulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie cellulaire telles que la base moléculaire du développement des tissus normaux et pathologiques.Un jour avant la transfection, mettez cinq millions de lymphocytes T HEK-293 dans une boîte de culture cellulaire de 100 millilitres dans 10 millilitres de milieu de culture cellulaire normal. Incuber ces cellules à 37 degrés Celsius pendant 24 heures dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, juste avant de commencer les transfections, retirez un flacon du réactif de transfection de quatre degrés Celsius et laissez-le à l’extérieur pour atteindre la température ambiante.Ensuite, pour commencer, ajoutez un millilitre de milieu sérique réduit dans un tube de microfuge stérile. À cela, ajoutez des quantités spécifiées de plasmides de vecteurs lentiviraux utilisés pour la transfection et mélangez par pipetage. Incuber le tube à température ambiante pendant cinq minutes.Au bout de cinq minutes, ajoutez 48 microlitres de réactif de transfection dans ce tube et mélangez doucement par pipetage. Par la suite, incubez ce mélange à température ambiante pendant au moins 15 minutes. Une fois l’incubation terminée, retirez la plaque contenant les lymphocytes T HEK-293 de l’incubateur.Ajoutez le mélange de réactifs de transfection d’ADN préparé goutte à goutte sur les cellules et faites tourner doucement la plaque pour assurer une distribution uniforme dans la plaque. Remettez l’assiette dans l’incubateur. Environ six heures après la transfection, retirez la plaque et aspirez le fluide.Ajoutez 10 millilitres de milieu de culture frais et remettez la plaque dans l’incubateur. À plusieurs moments, 24, 48 et 72 heures après la transfection, récoltez le milieu de culture contenant les particules lentivirales dans des tubes séparés. Ensuite, filtrez le milieu de culture récolté à travers un filtre stérile de 0,45 micron pour éliminer les débris cellulaires.Remplacer par un milieu de culture frais après chaque récolte. Le filtrat contenant les particules lentivirales peut être utilisé immédiatement pour la transduction ou peut être stocké à moins 80 degrés Celsius. Plaquez les cellules de carcinome mammaire humain MDA-MB-231 dans une boîte de culture de 35 millimètres dans un milieu de culture normal.Incuber ces cellules à 37 degrés Celsius pendant 24 heures dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, aspirez le milieu de culture de la plaque et ajoutez un millilitre de particules lentivirales avec un millilitre de milieu de culture frais. Incuber les cellules dans l’incubateur pendant environ 16 heures.Une fois l’incubation avec des particules virales terminée, retirez la plaque pour aspirer le milieu. Ajoutez ensuite deux millilitres de milieu frais et transférez dans l’incubateur pendant 24 à 72 heures. Vérifiez l’expression de H2B-mCherry dans ces cellules transduites à l’aide d’un microscope à épifluorescence.Pour commencer les expériences de synchronisation, il faut d’abord placer des cellules MDA-MB-231 exprimant H2B-mCherry à 50 à 60 % de confluence dans une plaque à 24 puits. Incuber la culture à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Le lendemain, remplacez le milieu de culture par 0,5 millilitre de milieu contenant deux millimolaires de thymidine.Laissez la plaque dans l’incubateur pendant 24 heures. Une fois l’incubation terminée, lavez les cellules trois fois avec du PBS pour les libérer du traitement à la thymidine. Laissez ensuite les cellules dans 0,5 millilitre de milieu de culture normal pendant cinq heures dans l’incubateur.Après cela, pour bloquer ces cellules en mitose, ajoutez Nocodazole au milieu de culture. Laissez les cellules dans l’incubateur pendant 12 heures. Une fois le traitement au nocodazole terminé, retirez la plaque et, à l’aide d’un agitateur orbital, secouez les cellules pendant 45 secondes à une minute pour libérer les cellules mitotiques.Par la suite, transférez le milieu contenant les cellules mitotiques extraites dans un nouveau tube à centrifuger. Ajoutez ensuite 0,5 millilitre de milieu frais dans chaque puits. Ensuite, répétez l’agitation et l’extraction des cellules deux fois de plus.Regrouper la totalité du milieu collecté, puis le centrifuger pour granuler les cellules mitotiques. Après l’essorage, remettre en suspension la pastille cellulaire dans 0,25 millilitre de milieu de culture cellulaire frais. À l’aide d’un hémocytomètre, comptez le nombre de cellules.Au début de cette étape, préparez 50 millilitres de solution 10x DMEM et stérilisez-la par filtre. Ensuite, déterminez les volumes de tous les composants qui seront utilisés pour fabriquer la matrice de collagène 3D, comme spécifié dans le protocole texte. Pré-refroidissez tous ces composants sur de la glace pour ralentir la gélification du collagène.Maintenant, dans un tube à centrifuger pré-refroidi de 1,5 millilitre, ajoutez le nombre requis de cellules dans le milieu, puis 10x DMEM, FBS, eau désionisée, collagène et enfin hydroxyde de sodium. Mélangez soigneusement à l’aide d’une pipette d’un millilitre. Une fois la solution bien mélangée, ajoutez 500 microlitres du mélange dans chaque puits de la plaque de 24 puits.Placez la plaque à 24 puits dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Après 30 minutes, sortez la plaque et ajoutez 500 microlitres de milieu de culture préchauffé sur le gel. Avant l’imagerie, allumez les unités de cellules vivantes des microscopes à contraste de phase et confocales.Pour capturer les cellules en division, placez la plaque à 24 puits contenant les cellules intégrées dans les matrices de collagène dans l’unité de cellules vivantes du microscope à fluorescence. À l’aide de l’objectif 10X, trouvez le bas de la plaque, puis déplacez-le vers le haut jusqu’à ce que le microscope fasse la mise au point à environ 500 micromètres du bas de la plaque. Déplacez la platine pour trouver des cellules à différents stades de la mitose et sélectionnez plusieurs positions pour l’imagerie.Configurez l’expérience timelapse avec des intervalles de deux minutes. Ensuite, pour imager le réseau de collagène, configurez le microscope confocal pour capturer uniquement la lumière réfléchie par le laser de 488 nanomètres. Placez ensuite la plaque contenant les cellules des matrices de collagène dans l’unité de cellules vivantes de ce microscope.Trouvez le bas de la plaque, puis déplacez l’objectif vers le haut jusqu’à ce qu’il fasse la mise au point à environ 100 micromètres du bas de la plaque. Déplacez la platine pour trouver des cellules et sélectionnez plusieurs positions pour l’imagerie. Configurez l’expérience timelapse avec des intervalles de cinq minutes.Des images fluorescentes d’une cellule MDA-MB-231 exprimant H2B-mCherry en division intégrée dans une matrice de collagène sont présentées ici. Les différentes phases de la mitose sont facilement observées comme prévu. La distribution des fibres de collagène en blanc visualisée simultanément à l’aide de la microscopie à réflexion confocale change très peu au cours de la mitose.La phase G2-M synchronisée et intégrée dans une matrice de collagène complète la division cellulaire dans les deux premières heures tandis que les cellules asynchrones de contrôle se divisent au hasard. La quantification de la distribution des fibres de collagène pendant les phases interphase et mitotique suggère que la déformation de la matrice est minime pendant la division cellulaire et plus élevée dans les cellules interphasiques. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en sept jours, de la génération de la lignée cellulaire stable à l’analyse de la division cellulaire vidéo dans une matrice 3D.Après avoir regardé cette vidéo, vous avez une bonne compréhension de la façon de synchroniser et de surveiller la division cellulaire des mammifères dans les matrices 3D à l’aide de l’imagerie de cellules vivantes et de la façon de déterminer la déformation de la matrice à l’aide de la microscopie à réflexion confocale et des techniques d’analyse d’imagerie quantitative.

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