Division cellulaire chez les mammifères dans des Matrices 3D par microscopie Quantitative réflexion Confocal

L’objectif global de cette procédure est d’étudier la division cellulaire des mammifères et les interactions de la matrice cellulaire dans un environnement 3D physiologiquement pertinent. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une approche efficace et générale pour étudier la division cellulaire des mammifères et les interactions entre la matrice cellulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie cellulaire telles que la base moléculaire du développement des tissus normaux et pathologiques.

Un jour avant la transfection, mettez cinq millions de lymphocytes T HEK-293 dans une boîte de culture cellulaire de 100 millilitres dans 10 millilitres de milieu de culture cellulaire normal. Incuber ces cellules à 37 degrés Celsius pendant 24 heures dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, juste avant de commencer les transfections, retirez un flacon du réactif de transfection de quatre degrés Celsius et laissez-le à l’extérieur pour atteindre la température ambiante.

Ensuite, pour commencer, ajoutez un millilitre de milieu sérique réduit dans un tube de microfuge stérile. À cela, ajoutez des quantités spécifiées de plasmides de vecteurs lentiviraux utilisés pour la transfection et mélangez par pipetage. Incuber le tube à température ambiante pendant cinq minutes.

Au bout de cinq minutes, ajoutez 48 microlitres de réactif de transfection dans ce tube et mélangez doucement par pipetage. Par la suite, incubez ce mélange à température ambiante pendant au moins 15 minutes. Une fois l’incubation terminée, retirez la plaque contenant les lymphocytes T HEK-293 de l’incubateur.

Ajoutez le mélange de réactifs de transfection d’ADN préparé goutte à goutte sur les cellules et faites tourner doucement la plaque pour assurer une distribution uniforme dans la plaque. Remettez l’assiette dans l’incubateur. Environ six heures après la transfection, retirez la plaque et aspirez le fluide.

Ajoutez 10 millilitres de milieu de culture frais et remettez la plaque dans l’incubateur. À plusieurs moments, 24, 48 et 72 heures après la transfection, récoltez le milieu de culture contenant les particules lentivirales dans des tubes séparés. Ensuite, filtrez le milieu de culture récolté à travers un filtre stérile de 0,45 micron pour éliminer les débris cellulaires.

Remplacer par un milieu de culture frais après chaque récolte. Le filtrat contenant les particules lentivirales peut être utilisé immédiatement pour la transduction ou peut être stocké à moins 80 degrés Celsius. Plaquez les cellules de carcinome mammaire humain MDA-MB-231 dans une boîte de culture de 35 millimètres dans un milieu de culture normal.

Incuber ces cellules à 37 degrés Celsius pendant 24 heures dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, aspirez le milieu de culture de la plaque et ajoutez un millilitre de particules lentivirales avec un millilitre de milieu de culture frais. Incuber les cellules dans l’incubateur pendant environ 16 heures.

Une fois l’incubation avec des particules virales terminée, retirez la plaque pour aspirer le milieu. Ajoutez ensuite deux millilitres de milieu frais et transférez dans l’incubateur pendant 24 à 72 heures. Vérifiez l’expression de H2B-mCherry dans ces cellules transduites à l’aide d’un microscope à épifluorescence.

Pour commencer les expériences de synchronisation, il faut d’abord placer des cellules MDA-MB-231 exprimant H2B-mCherry à 50 à 60 % de confluence dans une plaque à 24 puits. Incuber la culture à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Le lendemain, remplacez le milieu de culture par 0,5 millilitre de milieu contenant deux millimolaires de thymidine.

Laissez la plaque dans l’incubateur pendant 24 heures. Une fois l’incubation terminée, lavez les cellules trois fois avec du PBS pour les libérer du traitement à la thymidine. Laissez ensuite les cellules dans 0,5 millilitre de milieu de culture normal pendant cinq heures dans l’incubateur.

Après cela, pour bloquer ces cellules en mitose, ajoutez Nocodazole au milieu de culture. Laissez les cellules dans l’incubateur pendant 12 heures. Une fois le traitement au nocodazole terminé, retirez la plaque et, à l’aide d’un agitateur orbital, secouez les cellules pendant 45 secondes à une minute pour libérer les cellules mitotiques.

Par la suite, transférez le milieu contenant les cellules mitotiques extraites dans un nouveau tube à centrifuger. Ajoutez ensuite 0,5 millilitre de milieu frais dans chaque puits. Ensuite, répétez l’agitation et l’extraction des cellules deux fois de plus.

Regrouper la totalité du milieu collecté, puis le centrifuger pour granuler les cellules mitotiques. Après l’essorage, remettre en suspension la pastille cellulaire dans 0,25 millilitre de milieu de culture cellulaire frais. À l’aide d’un hémocytomètre, comptez le nombre de cellules.

Au début de cette étape, préparez 50 millilitres de solution 10x DMEM et stérilisez-la par filtre. Ensuite, déterminez les volumes de tous les composants qui seront utilisés pour fabriquer la matrice de collagène 3D, comme spécifié dans le protocole texte. Pré-refroidissez tous ces composants sur de la glace pour ralentir la gélification du collagène.

Maintenant, dans un tube à centrifuger pré-refroidi de 1,5 millilitre, ajoutez le nombre requis de cellules dans le milieu, puis 10x DMEM, FBS, eau désionisée, collagène et enfin hydroxyde de sodium. Mélangez soigneusement à l’aide d’une pipette d’un millilitre. Une fois la solution bien mélangée, ajoutez 500 microlitres du mélange dans chaque puits de la plaque de 24 puits.

Placez la plaque à 24 puits dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Après 30 minutes, sortez la plaque et ajoutez 500 microlitres de milieu de culture préchauffé sur le gel. Avant l’imagerie, allumez les unités de cellules vivantes des microscopes à contraste de phase et confocales.

Pour capturer les cellules en division, placez la plaque à 24 puits contenant les cellules intégrées dans les matrices de collagène dans l’unité de cellules vivantes du microscope à fluorescence. À l’aide de l’objectif 10X, trouvez le bas de la plaque, puis déplacez-le vers le haut jusqu’à ce que le microscope fasse la mise au point à environ 500 micromètres du bas de la plaque. Déplacez la platine pour trouver des cellules à différents stades de la mitose et sélectionnez plusieurs positions pour l’imagerie.

Configurez l’expérience timelapse avec des intervalles de deux minutes. Ensuite, pour imager le réseau de collagène, configurez le microscope confocal pour capturer uniquement la lumière réfléchie par le laser de 488 nanomètres. Placez ensuite la plaque contenant les cellules des matrices de collagène dans l’unité de cellules vivantes de ce microscope.

Trouvez le bas de la plaque, puis déplacez l’objectif vers le haut jusqu’à ce qu’il fasse la mise au point à environ 100 micromètres du bas de la plaque. Déplacez la platine pour trouver des cellules et sélectionnez plusieurs positions pour l’imagerie. Configurez l’expérience timelapse avec des intervalles de cinq minutes.

Des images fluorescentes d’une cellule MDA-MB-231 exprimant H2B-mCherry en division intégrée dans une matrice de collagène sont présentées ici. Les différentes phases de la mitose sont facilement observées comme prévu. La distribution des fibres de collagène en blanc visualisée simultanément à l’aide de la microscopie à réflexion confocale change très peu au cours de la mitose.

La phase G2-M synchronisée et intégrée dans une matrice de collagène complète la division cellulaire dans les deux premières heures tandis que les cellules asynchrones de contrôle se divisent au hasard. La quantification de la distribution des fibres de collagène pendant les phases interphase et mitotique suggère que la déformation de la matrice est minime pendant la division cellulaire et plus élevée dans les cellules interphasiques. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en sept jours, de la génération de la lignée cellulaire stable à l’analyse de la division cellulaire vidéo dans une matrice 3D.

Après avoir regardé cette vidéo, vous avez une bonne compréhension de la façon de synchroniser et de surveiller la division cellulaire des mammifères dans les matrices 3D à l’aide de l’imagerie de cellules vivantes et de la façon de déterminer la déformation de la matrice à l’aide de la microscopie à réflexion confocale et des techniques d’analyse d’imagerie quantitative.