Bioprinting du Cartilage et peau tissus analogues utilisant un roman passif unité Technique de mélange pour Bioink Precellularization

Cartilage et peau analogues ont été bioprinted à l’aide d’un bioink de nanocellulose-alginate basé. Les bioinks ont été cellularized avant l’impression via une unité de mixage passive seule étape. Les constructions ont été démontrées pour être uniformément cellularized, ont la grande viabilité et présentent des marqueurs de différenciation favorables.

L’objectif global de cette procédure est de faciliter la pré-cellularisation rapide et reproductible des bio-encres pour les applications de bio-impression tout en préservant la viabilité cellulaire. Cette méthode peut aider à rationaliser et à améliorer la reproductibilité lors du mélange d’une suspension cellulaire avec une bio-encre pour assurer l’impression de cellules viables. Le principal avantage de cette technique est qu’elle élimine notre capacité à mélanger en mélangeant des cellules avec une bio-encre dans un système fermé avec une manipulation minimale et un risque de perte d’échantillon.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car il existe un risque de mélange incorrect si l’assemblage n’est pas effectué correctement. Pour commencer, procurez-vous deux seringues. Une seringue est destinée à la suspension cellulaire tandis que l’autre seringue est destinée à la bio-encre.

Le rapport de mélange utilisé dans cette étude est de 10 pour un. Par conséquent, utilisez une seringue de 12 millilitres et une seringue d’un millilitre, comme l’exige l’unité de mélange 10 pour un. Procurez-vous également une unité de mélange passive stérile qui peut être couplée à deux seringues via un raccord Luer Lock et un connecteur Luer Lock femelle-femelle stérile.

Récupérez une unité de distribution capable d’extruder un volume à partir de deux seringues stériles simultanément à un rythme contrôlé. Enfin, procurez-vous une cartouche stérile dans laquelle mélanger directement la bio-encre et la suspension cellulaire. Dans ce protocole, une bio-encre à base d’alginate de nanocellulose est utilisée, qui est réticulée par l’ajout d’une solution de chlorure de calcium après l’impression.

Pour préparer les cellules, détachez-les à l’aide d’une solution d’EDTA à 0,5 % de trypsine. Dans ce protocole, des fibroblastes humains sont utilisés. Ensuite, comptez le nombre total de cellules à l’aide de la méthode d’exclusion du bleu de trypan.

Déterminez la densité cellulaire souhaitée dans la construction imprimée finale. Calculez la concentration des cellules récoltées qui doivent être diluées pour atteindre cette densité cellulaire finale cible. Dans ce protocole, une densité cellulaire finale de cinq millions de cellules par millilitre a été utilisée.

Transférez la suspension cellulaire dans la seringue de suspension cellulaire. Transférez également la bio-encre dans l’autre seringue. Ensuite, tirez le piston de la seringue bioink vers l’arrière et insérez-la dans l’unité de distribution.

Assurez-vous qu’au moins la moitié du volume des seringues à retirer est constituée d’air stérile provenant de l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique. Il est important que les positions des pistons de seringue soient maintenues lors de l’insertion dans l’unité de distribution. Positionnez l’appareil verticalement avec le connecteur Luer Lock vers le haut.

Tirez ensuite le piston de la seringue cellulaire à une longueur similaire à celle de la seringue bioink et insérez-le dans l’unité de distribution. Assurez-vous qu’il n’y a pas de décharge accidentelle de la suspension cellulaire ou de la bio-encre en vous assurant que l’unité de mélange est fixée uniformément aux deux seringues. Vérifiez deux fois avant de mélanger.

Fixez les deux seringues à l’unité de mélange en tournant les connecteurs Luer Lock. Ensuite, amorcez le système de mélange en poussant sur l’unité de distribution pour extruder l’air dans la seringue. Arrêtez l’amorçage avant que la solution n’atteigne le verrou Luer.

Après l’amorçage, fixez la cartouche de remplissage à l’extrémité de l’unité de mélange via le connecteur Luer Lock. Assurez-vous que le piston de la cartouche de remplissage se trouve au fond avant de la fixer. Comprimez lentement l’unité de distribution pour mélanger l’encre biologique et la suspension cellulaire dans la cartouche.

Poussez le piston de la cartouche de remplissage vers le bas à l’aide d’une pointe de pipette stérile pour entrer en contact avec le mélange de cellules de bio-encre après le mélange. Maintenez l’unité de distribution comprimée pour vous assurer que le mélange de bio-encre cellulaire n’est pas extrudé dans l’unité de mélange. Fermez la cartouche et tapotez doucement sur la surface de travail pour déplacer les bulles d’air vers le haut de la cartouche.

À ce stade, le mélange de bio-encre cellulaire est prêt pour l’impression. Dans ce protocole, une structure carrée de dimensions 4,8 x 4,8 x 0,9 millimètres cubes a été exportée sous forme de fichier de stéréolithographie. Un fichier g-code a été généré à partir de la structure du treillis à l’aide des paramètres trouvés dans le protocole texte.

Isoler et cryoconserver les chondrocytes nasaux humains primaires, ou HNC, des patients, en suivant le protocole référencé. Décongeler et étendre les HNCs cryoconservés et se dilater une fois dans une culture monocouche en utilisant un milieu de culture standard à 37 degrés Celsius. Détachez les cellules à 80 % à 90 % de confluence avec une solution EDTA de trypsine à 0,5 % et comptez à l’aide d’un protocole d’exclusion du bleu de trypan.

Toutes les expériences ont été menées à l’aide de HNC au deuxième passage. Nous suspendons les HNCs à 100 millions de cellules par millilitre dans un rayon de 300 microlitres de milieu de culture, complété par 10 % de sérum de veau fœtal, 1 % de streptomycine de pénicilline et 50 microgrammes par millilitre d’acide ascorbique en préparation du mélange avec la bio-encre. Mélangez la suspension cellulaire HNC dans une bio-encre à base d’alginate de nanocellulose, en suivant le protocole de l’unité de mélange passif à un rapport de 10 pour une bio-encre par suspension cellulaire, pour obtenir une concentration cellulaire finale de neuf millions de cellules par millilitre.

Assurez-vous que la bio-imprimante est stérilisée par exposition aux UV et essuyez-la avec de l’éthanol à 70 %. Maintenez la stérilité en plaçant la bio-imprimante dans l’armoire à flux laminaire. Fixez ensuite des buses d’impression stériles aux cartouches contenant les mélanges de suspension de cellules de bioencre et insérez-les dans la bio-imprimante.

Après avoir calibré la bio-imprimante, bio-imprimez les constructions chargées de cellules structurées en treillis à l’aide de la buse conique de calibre 25 à une pression de 25 kilopascals. Bioprint (acellulaire) construit comme contrôle. Réticuler les constructions en ajoutant une solution ionique de 100 millimères ou de chlorure de calcium.

Au bout de cinq minutes, rincez les constructions. Ensuite, incubez les constructions dans un milieu de culture dans des conditions de culture standard, en changeant le milieu tous les deux ou trois jours. Prélever des échantillons pour analyse histologique aux semaines deux et quatre.

Colorez les échantillons pour la production de glycosaminoglycanes, ou GAG, à l’aide d’un colorant au bleu alcien. La viabilité de la cellule 24 heures après le mélange avec l’unité de mélange passif ou une technique de mélange manuel est illustrée. L’unité de mélange passive a montré une meilleure viabilité, car l’étendue du mélange a été augmentée.

Ceci est important car des temps de mélange plus longs peuvent être nécessaires lors de la préparation de grands lots de bio-encres précellularisées. La viabilité cellulaire au jour 14 et au jour 28 de la culture est illustrée ici. Une bonne viabilité cellulaire est visualisée, montrant la survie cellulaire à long terme lorsque cette technique est utilisée.

Les glycosaminoglycanes sont visualisés dans des constructions cartilagineuses bio-imprimées, colorées au bleu alcian, aux jours zéro, 14 et 28. Ces images démontrent la formation de néocartilage au sein de ces constructions bio-imprimées. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 minutes si elle est exécutée correctement.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser un système d’unité de mélange passif pour cellulariser les bio-encres. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la bio-impression pour cellulariser rapidement et uniformément les bio-encres avec une technique de mélange doux.