Name: Bioprinting du Cartilage et peau tissus analogues utilisant un roman passif unité Technique de mélange pour Bioink Precellularization (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Découvrez la précellularisation de bioencres par unité de mélange passive pour l'ingénierie tissulaire. Cette méthode améliore la viabilité cellulaire et la reproductibilité dans la bioimpression de cartilage et de peau.

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Les auteurs n’ont aucun remerciements.

Ce protocole suit les directives du Comité de déontologie de la recherche humaine de l’Université de Chalmers.
Remarque : Toutes les mesures sont à effectuer au sein d’une cabinet de biosécurité stérile.
1. préparation des cellules, Bioink et consommables
<ol>
	<li>Obtenir deux seringues, une seringue (Figure 1a) est la suspension cellulaire, tandis que les autre la seringue est pour le bioink (Figure 1b).</li>
	<li>Obtenir un stérile passive mélangeuse (Figure 1c) qui peut être couplé avec des seringues doubles via une connexion de Luer lock.</li>
	<li>Obtenir une unité de dosage (Figure 1d) qui peut extruder un volume de deux seringues stériles en même temps à une vitesse contrôlée. NOTE : Le rapport de mélange utilisé dans cette étude est de 10:1. Par conséquent, utiliser une seringue de 12 mL et une seringue de 1 mL tel que requis par l’unité de mélange de 10:1.</li>
	<li>Obtenir une cartouche stérile (Figure 1e) et un stérile connecteur femelle-femelle Luer lock mélangé directement la suspension bioink et cellule en.</li>
	<li>Obtenir ou préparer le bioink pour le mélange avec une suspension de cellules. Remarque : Dans le présent protocole, un bioink de nanocellulose/alginate basé a été utilisé. Cette bioink est réticulé grâce à l’ajout d’une solution stérile 100 mM CaCl2 post impression.</li>
	<li>Détacher les cellules à l’aide d’une solution de trypsine/EDTA 0,5 % et compter le nombre total de cellules à l’aide de la méthode d’exclusion bleu trypan17. Remarque : Dans le présent protocole, les fibroblastes humains ont été utilisés.</li>
	<li>Déterminez quelle densité cellulaire est nécessaire dans la construction finale imprimée. Calculer en utilisant les équations suivantes la concentration des cellules récoltées qui doit être dilué pour atteindre une densité cellulaire finale de cette cible. Remarque : Dans ce protocole, une densité finale de 5 x 106 cellules/mL a été utilisée.<ol>
		<li>Sélectionnez une concentration de la cellule souhaitée pour les expériences : Ccellulaire (cellules/mL).</li>
		<li>Calculez la quantité de bioink nécessaire, Vbioink, basé sur le nombre total de constructions désiré : 
		Vbioink = × Vconstruire NContructs Remarque : par exemple, le volume des bioink par la construction est de 100 µL. Si 30 constructions sont imprimées, alors le volume de bioink nécessaire est 3 mL.</li>
		<li>Calculer le nombre de cellules nécessaires : 
		Ncellules = Ccellule (1,1 × Vbiolink)</li>
		<li>Remettre en suspension les cellules (cellulesde N) 1/10ème du volume de le bioink : 
		Vsuspension cellulaire = 0,1 × Vbiolink NOTE : par exemple, si Vbioink = 3 mL, puis Vsuspension cellulaire = 0,1 × 3 mL = 0,3 mL</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. mélange de Suspension cellulaire et Bioink
<ol>
	<li>Transférer la suspension cellulaire dans la seringue de suspension cellulaire.</li>
	<li>Le bioink de transfert à une autre seringue ou obtenir une seringue contenant de la bioink.</li>
	<li>Tirez le piston de la seringue de bioink et insérer la seringue dans l’unité de dosage. Positionner l’appareil verticalement avec le raccord Luer lock vers le haut (Figure 1f1).</li>
	<li>Tirez le piston de la seringue de la cellule arrière jusqu'à une longueur semblable comme la seringue bioink et insérez l’unité de dosage (Figure 1,f2).</li>
	<li>Fixez les deux seringues à la mélangeuse en tordant les raccords Luer-lock (Figure 1f3).</li>
	<li>Amorcez le système de mélange en poussant l’unité de dosage pour expulser l’air dans la seringue. Arrêter l’amorçage avant la solution pour atteindre le raccord Luer lock (Figure 1g4).</li>
	<li>Après l’amorçage, fixer la cartouche de remplissage à l’extrémité de l’unité de mixage via le connecteur Luer-lock (Figure 1g5). Veiller à ce que le piston dans la cartouche de remplissage est au fond avant la fixation.</li>
	<li>Lentement, compresser (Figure 1h6) l’unité de dosage pour mélanger la suspension bioink et de cellules dans la cartouche (Figure 1i7).</li>
	<li>Poussez le piston dans la cartouche de remplissage vers le bas avec une pointe de pipette stérile à communiquer avec le mélange de cellules bioink après le mélange. Gardez le débitant jusqu'à ce que les comprimés pour que le mélange de cellules/bioink n’est pas expulsé dans l’unité de mixage.</li>
	<li>Culot de la cartouche et tapoter délicatement sur la surface de travail pour déplacer les bulles d’air vers le haut de la cartouche (fin du piston). Remarque : À ce stade, le mélange de cellules/bioink est prêt pour l’impression. Les sections suivantes donnera un aperçu des applications spécifiques et des procédés d’impression.</li>
</ol>
3. détermination de la viabilité des cellules à l’aide d’une mélangeuse par rapport au mélange manuelle spatule
<ol>
	<li>Détacher les fibroblastes humains (passage 7) avec une solution de trypsine/EDTA de 0,5 % à 80 % confluence, compter le nombre et remettre en suspension dans un milieu de culture à une densité suffisante de cellules pour obtenir une concentration finale après mélange avec le bioink (01:10 cellule : bioink ratio) de 5 x 10 6 cellules/mL.</li>
	<li>Mélange de cellules dans le bioink en utilisant soit le passif mélange technique de l’unité (étape 2) ou par l’intermédiaire de spatule pour évaluer l’effet de ces deux techniques sur la viabilité des cellules.</li>
	<li>Fusionner les cellules dans le bioink en utilisant le passif mélange technique de l’unité 1, 2, ou 3 fois avant distribution dans un moule pour la mise en réseau à l’aide de 100 mM CaCl2. Remarque : Pour effectuer des mélanges supplémentaires, mélanger la cellule/bioink directement dans une seringue plutôt que d’une cartouche. Puis le remix le mélange par le biais de la mélangeuse, suivant le protocole précédent mais sans le composant de seringue de cellule.</li>
	<li>Fusionner les cellules dans un bioink séparé à l’aide de manuel mécanique mixage via une spatule pour des durées de 30, 60 ou 90 transfert s. les mélanges (pour chaque temps de mélange) dans un moule pour la mise en réseau à l’aide de 100 mM CaCl2.</li>
	<li>Transférer les échantillons sur une plaque bien après l’achèvement de la mise en réseau et de la culture dans des conditions normales.</li>
	<li>Après 1 journée de la culture, laver les constructions (n = 3-4 par groupe) dans le milieu de culture sans sérum cellulaire pendant 30 min. colorer les cellules dans les constructions avec une solution colorante (4 µM calcéine AM, 1 µM d’éthidium homodimère-1) pendant 30 min.<ol>
		<li>Laver deux fois supplémentaires et incuber les échantillons dans un milieu de culture sans sérum cellulaire pour un total de 1 h à 37 ° C.</li></ol></li></ol>Transférer les échantillons dans une solution d’imagerie de cellules vivantes.
	
	
	<li>Acquisition d’images via une caméra couleur numérique à un grossissement de 10 X à l’aide d’un microscope inversé avec filtre FITC et Texas Red et d’analyser à l’aide de logiciels d’analyse image.</li>
	<li>Choisir au hasard trois images de chaque construction pour la quantification de la viabilité cellulaire.</li>
	<li>Calculer la viabilité selon le ratio de cellules vivantes au nombre total de cellules. Analyser les données via une ANOVA à suivie de test de comparaisons multiples de Tukey.</li>

4. Bioprinting de Cartilage analogues avec un seul Type cellulaire
<ol>
	<li>Dessiner un modèle 3D du tissu désiré analogique. Convertir un fichier Gcode pour bioprinting et chargez le fichier Gcode sur la bioprinter1. Remarque : Dans ce protocole, une structure carrée avec dimensions 4,8 x 4,8 x 0,9 mm3 a été exportée dans un fichier STL. Un fichier Gcode provenait de la structure maillée en utilisant les paramètres suivants : épaisseur de la couche, 0,3 mm ; motif de remplissage, rectiligne ; densité de remplissage, 25 % ; Vitesse 10 mm/s.</li>
	<li>Isoler et cryoconservé chondrocytes nasales humains primaires (hNC) provenant de patients suivant le protocole référencé1.</li>
	<li>Décongeler et développez cryoconservés hNCs puis une fois en culture monocouche à l’aide de standard milieu de culture à 37 ° C. Détacher les cellules à confluence de 80 à 90 % avec une solution de trypsine/EDTA 0,5 % et compter à l’aide d’un protocole d’exclusion bleu de trypan. Toutes les expériences ont été menées à l’aide de hNCs au passage 2.</li>
	<li>Resuspendre le hNCs à 100 x 106 cellules/mL dans 300 µL de milieu de culture additionné de sérum de veau fœtal 10 %, 1 % la pénicilline-streptomycine et 50 µg/mL d’acide ascorbique, en préparation pour le mélange avec le bioink.</li>
	<li>Mélange la suspension cellulaire hNC dans un alginate de nanocellulose/base bioink qui suit le passif protocole d’unité à un ratio 10:1 bioink:cell de suspension pour obtenir une concentration finale de cellule de 9 x 106 cellules/mL de mélange.</li>
	<li>Veiller à ce que le bioprinter est stérilisé par exposition aux rayons UV et essuyer vers le bas avec l’éthanol à 70 %. Maintenir la stérilité en plaçant dans un écoulement laminaire du cabinet.</li>
	<li>Fixez les buses d’impression stériles pour les cartouches contenant des mélanges de suspension bioink/cellule et insérer dans le bioprinter.</li>
	<li>Calibrer le bioprinter soit manuellement, soit par les protocoles spécifiques à l’imprimante.</li>
	<li>BioPrint le réseau structuré, constructions de cellules chargées en utilisant les paramètres d’impression suivants : buse conique de 25G à une pression de 25 kPa. BioPrint acellulaire constructions (mélangées avec un milieu cellulaire ne contenant aucune cellule) sous forme de contrôle.</li>
	<li>Réticuler les constructions en ajoutant une solution ionique de 100 mM CaCl2 pendant 5 min. Rincer les constructions et les incuber dans un milieu de culture dans des conditions de culture standard (37 ° C, 5 % de CO2et 95 % d’humidité relative). Modifier les médias chaque deuxième ou troisième jour.</li>
	<li>Prélever des échantillons pour analyse histologique aux semaines 2 et 4. Tacher les échantillons destinés à la production de GAG en utilisant une de tache bleu Alcian18.</li>
</ol>
5. Bioprinting des analogues de la peau avec les deux Types de cellules
<ol>
	<li>Dessiner un modèle 3D du tissu désiré analogique et convertir un fichier Gcode pour bioprinting. Chargez le fichier Gcode sur le bioprinter. Remarque : Dans ce protocole, une structure carrée avec dimensions 4,8 x 4,8 x 0,9 mm3 a été exportée dans un fichier STL. Puis un fichier Gcode provenait de la structure maillée en utilisant les paramètres suivants : épaisseur de la couche, 0,3 mm ; motif de remplissage, rectiligne ; densité de remplissage, 25 % ; Vitesse 10 mm/s.</li>
	<li>Préparer les cellules pour se mélanger dans la bioink pour bioprinting. Pour la fabrication des analogues de la peau, deux types de cellules ont été utilisés. Les deux types cellulaires ont été mélangés dans le bioink et bioprinting.<ol>
		<li>Obtenir le HDF primaire. Maintenir ces cellules dans le milieu DMEM additionné de sérum de veau fœtal 10 %, 1 % la pénicilline-streptomycine et 50 µg/mL d’acide ascorbique. Détacher les cellules à confluence de 80 à 90 % avec une solution de trypsine/EDTA 0,5 % et le compteur.</li>
		<li>Isoler et cryoconservé hNC primaire chez les patients suivant le protocole référencé1. Décongeler et développez hNCs cryoconservés en culture monocouche. Détacher les cellules à confluence de 80 à 90 % avec une solution de trypsine/EDTA 0,5 % et le compteur.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Remettre en suspension les deux types de cellules à 100 x 106 cellules/mL dans les milieux de culture. Mélanger les suspensions cellulaires ensemble à un ratio de 1:1 pour obtenir une concentration finale totale de 100 x 106 cellules/mL à 300 µL de médias.</li>
	<li>Mélange la suspension cellulaire de 50/50 de HDF et hNC dans un alginate de nanocellulose/base bioink qui suit le passif protocole d’unité à un ratio 10:1 bioink:cell de suspension pour obtenir une concentration finale de cellule de 9 x 106 cellules/mL de mélange.</li>
	<li>Veiller à ce que le bioprinter est stérilisé ou est placée dans une hotte à flux laminaire pour maintenir la stérilité.</li>
	<li>Fixez les buses d’impression stériles pour les cartouches contenant des mélanges de suspension bioink/cellule et insérer dans le bioprinter.</li>
	<li>Calibrer le bioprinter soit manuellement ou des protocoles spécifiques à l’imprimante.</li>
	<li>BioPrint le réseau structuré, constructions de cellules chargées en utilisant les paramètres d’impression suivants : buse conique de 25G à une pression de 25 kPa. BioPrint acellulaire constructions (mélangées avec un milieu cellulaire ne contenant aucune cellule) sous forme de contrôle.</li>
	<li>Réticuler les constructions en ajoutant une solution ionique de 100 mM CaCl2 pendant 5 min. Rincer les constructions et les incuber dans un milieu de culture dans des conditions de culture standard (37 ° C, 5 % de CO2et 95 % d’humidité relative). Modifier les médias chaque deuxième ou troisième jour.</li>
	<li>Prélever des échantillons pour analyse histologique aux semaines 2 et 4. Tacher les échantillons pour le collagène I production à l’aide de colorant trichrome de Masson, un19.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs de ce manuscrit sont des employés de CELLINK LLC.

Comme l’a démontré dans ce manuscrit, bioinks pre-cellularized ont été bioprinted pour fabriquer un cartilage ou peau analogues qui ont été cultivées pendant 4 semaines. Viabilité cellulaire après que fusion à l’aide de la passive mélange technique de l’unité était plus élevée que les méthodes traditionnelles de mélange. En outre, la simplification du processus de fusion à l’aide de la mélangeuse minimise le nombre d’étapes de manutention et permettant la meilleure cohérence dans la mesure du mélange. En fin de compte, cela se traduit par la meilleure reproductibilité dans les deux distribution cellulaire au sein de la bioink et à travers des constructions et des groupes expérimentaux. Dépôt de composants ECM spécifiques de tissus tels que les GAGs et le collagène, j’ai étais observé depuis le cartilage et peau analogues, respectivement après 4 semaines de culture. Ceci indique la souplesse de la technique de mélange et de la géométrie de construction choisi pour fabriquer des cibles de tissus différents. La fabrication des analogues du cartilage et la peau exposée la flexibilité de l’utilisation d’un bioink de nanocellulose-alginate et la technique de bioprinting pour des cibles distinctes ingénierie tissulaire. Nous allons discuter des deux composantes de l’étude ci-dessous : (1) le passif mélange technique de l’appareil et (2) le comportement de cellules de cartilage et peau analogues.
Le développement et l’optimisation d’une technique pour le mélange d’une suspension de cellules dans un bioink a été primordiale pour la fabrication de ces constructions. Contrairement aux matériaux d’hydrogel traditionnelles de faible viscosité, la viscosité élevée de la bioinks a entraîné en difficulté en pre-cellularization d’un bioink avant l’impression. Comme alternative à la méthode traditionnelle de l’incorporation de la cellule dans un bioink, un protocole pour le mélange en une seule étape d’une suspension de cellules dans un bioink visqueux a été développé et discuté. En outre, l’application pratique de cette technique de mélange dans la fabrication de tissus des constructions a été évaluée. Cette approche de mélange en une seule étape a plusieurs avantages par rapport aux traditionnels mélange techniques incluses contrôlé rapport de mélange, minimisation des contraintes de cisaillement élevés et irrégulières, et un système fermé pour éliminer l’échantillon fermer en mélangeant des navires. Cependant, il y a plusieurs étapes essentielles dans cette technique pour s’assurer que ses avantages par rapport aux méthodes traditionnelles pour un mélange de cellules/bioink. Il est essentiel de s’assurer que les cellules dans la seringue de cellule sont suspendus et bien mélangés avant de mélanger. Trop grand d’un écart de temps entre le levage et le transfert des cellules dans la seringue et en commençant le processus de mélange peut provoquer les cellules aux sédiments, ce qui se traduira par un mélange inégal et distribués à un filament imprimé. Si la sédimentation est observée, simple inversion (2 - 3 fois) de l’Assemblée d’unité mixage passive immédiatement avant le mélange est suffisante pour remettre en suspension les cellules et assurer une distribution uniforme avant la fusion. Il est également essentiel que des bulles d’air dans les seringues sont éliminés ou réduits au minimum de préalable pour s’assurer que le rapport de mélange reste constant. Si les bulles d’air important restent dans la cartouche de bioink avant la fusion, il est recommandé que la solution être exécuté par le biais de la mélangeuse un délai supplémentaire afin d’assurer un mélange complet. Si les bulles d’air restent, tapement doux de la cartouche d’impression/seringue peut déplacer les bulles d’air résiduel. En outre, si plusieurs matières de mélange (plusieurs mélange unités ou matériaux) est nécessaire pour des constructions plus complexes, les concentrations des suspensions bioinks/cellule à mélanger doivent être ajustées afin qu’après dilution par mélange, la bonne concentration finale est toujours atteint.
En comparaison avec d’autres techniques de fusion, la mélangeuse passive est une nouvelle approche pour cellularize bioinks. Contrairement à d’autres techniques de mixage comme seringue double mélange, ou en remuant avec une spatule ou un autre outil, la mélangeuse passive permet plus de cohérence dans le mélange à travers les lots et les utilisateurs. La nature du mélange des techniques manuelles, comme une spatule de brassage, se traduit par une plus grande variation d’utilisateur dans l’étendue et le taux de mélange. En outre, des systèmes fermés comme le passif mélange d’unité et seringue double mélange n’ont peu ou aucun perte d’échantillon par rapport au manuel de mélange dans une boîte de Pétri ou un tube.
Les deux analogues de tissus fabriqués dans ce manuscrit se comprenaient d’un seul type de bioink et un ou deux types de cellules. Toutefois, la bioprinting des analogues de tissu qui se composent d’architectures contenant des zones de bioinks distincts avec des types cellulaires distincts peut-être être nécessaire pour la fabrication de tissus physiologiques plus constructions20,21, 22. Plus spécialisées, bioinks avec des compositions uniques ou fonctionnalités peuvent être générées par le mélange de plusieurs types de bioinks existantes afin de créer des multimatériaux bioinks qui ont des compositions ou des fonctionnalités distinctes23, 24. Ceci peut être particulièrement importante dans les régions de transition de tissus tels que la peau de la couche sous-cutanée ou le cartilage à l’OS région d’un tissu où un gradient de composition de bioink25,26 peut être nécessaire pour assurer le développement de ces régions critiques trouvées dans les tissus natifs27. En outre, une unité de mélange pourrait être utilisée pour mélanger en facteurs de croissance et morphogènes dans le bioinks avant bioprinting. L’élimination de la perte de l’échantillon avec le système fermé de mélange est séduisante pour l’utilisation de facteurs bioactifs coûteux et faible concentration, où perte d’échantillon peut entraîner un changement à leur concentration finale dans la construction de bioprinted, en particulier lorsque gradients sont impliqués.
Une limitation avec toute technique de mélange, y compris le passif unité utilisée dans cette étude, de mélange est le risque de dommages aux types de cellules sensibles mécaniquement. Par exemple, isolé des cellules souches telles celles de la moelle osseuse embryonnaire ou de cellules souches pluripotentes induites sont plus sensibles aux dommages mécaniques28,29. La Loi de mélange donne des contraintes mécaniques anormales sur les cellules à cause des forces de cisaillement impliqués dans le processus de mélange, et ils doivent être soupesés afin de préserver la viabilité30. Tandis que l’utilisation des fibroblastes primaires et des chondrocytes dans cette étude a abouti à la bonne viabilité (Figure 2), plus d’études sont nécessaires pour déterminer le taux de mélange sans danger et ratios pour les types de cellules plus sensibles. Jusque là, il est recommandé que le mélange sous une vitesse lente constante afin de maximiser la viabilité. En outre, la densité cellulaire choisie dans cette étude a été déterminée sur la base d’études précédente1. Cette densité cellulaire n’est peut-être pas idéale pour tous les types de cellules.En particulier, mélange de cellules à une concentration plus élevée peut entraîner des contacts accrus cellules susceptibles d’améliorer la viabilité des cellules et tissus formation31,32. Dans la même veine, la mélangeuse passive pourrait être applicable aux mélangeant les sphéroïdes cellulaire ou autres agrégats de cellules33 bioinks.
Comme l’a proposé et démontré dans cette étude, un passif unité système de mélange peut fondre rapidement une suspension de cellules dans un bioink visqueux. Alors que le risque d’endommagement mécanique aux cellules reste encore, l’approche permet plus de cohérence en mélangeant dans une seule étude et entre les utilisateurs. Pre-cellularized bioinks utilisant cette approche ont été utilisés pour fabriquer les deux cartilages et analogues qui ont été cultivées pendant 4 semaines et a démontré la déposition des marqueurs spécifiques de ECM tissus de la peau. Les études à venir portera sur l’utilisation de la passive système d’unité pour mélanger bioinks spécialisé de bioinks normalisée pour la fabrication des analogues de tissus plus complexes de mélange.

Ces dernières années, la technologie en trois dimensions (3D) bioprinting est devenu plus accessible aux chercheurs, ce qui permet la technique pour devenir plus largement utilisés pour la fabrication des analogues de tissu. Bioprinting promet de révolutionner la recherche biomédicale en facilitant la fabrication rapide et reproductible des constructions de tissus aux multiples facettes. L’essentiel de la technologie bioprinting réside dans la capacité de contrôler précisément la déposition des biomatériaux (connu comme bioinks) en trois dimensions. Cela permet la génération des échafaudages complexes avec des régions distinctes de compositions de matrice, facteurs bioactifs et les cellules qui peuvent mieux récapituler structure native tissulaire.
Bioprinting a été utilisé pour la fabrication de constructions pour de nombreuses applications de tissus, y compris le cartilage1,2de la peau, muscle3et OS4. Ces tissus sont attrayants pour bioprinting en raison de leurs micro-architectures striés intrinsèques qui conviennent à la récapitulation par dépôt de couche par couche. En particulier, la peau possède une structure bien définie de multicouches5, ce qui convient pour la fabrication par le biais de techniques de dépôt de couche par couche comme bioprinting. En outre, bioprinting peut être utilisé pour générer des constructions qui possèdent les dimensions anatomiques nécessaires, et le défaut de formes pour réparer le tissu. La capacité de générer des biomatériaux avec patient spécifiques de taille et la forme6 peut commencer à répondre à la demande pour des réparations partielles de nombreux tissus, y compris mais non limité à des défauts osseux, lésions du cartilage et des lésions cutanées dont l’étendue varie de patient à l’autre.
Dans cette étude, deux analogues de tissus (peau et le cartilage articulaire) ont été fabriqués par le biais de la bioprinting de bioinks pre-cellularized. Assurant un mélange adéquat d’un bioink avec suspension de cellules qui peut assurer une distribution cellulaire uniforme tout en préservant la viabilité cellulaire peut être un défi. Bioinks adaptés aux bioprinting par extrusion sont souvent très visqueux et donc nécessiter une vaste mélange afin d’assurer un mélange homogène. Dommages mécaniques aux cellules peuvent se produire dans des conditions difficiles de mixage et un effet négatif sur la viabilité. Des études ont montré que la plupart mort cellulaire au cours du processus d’impression jet d’encre se produit lors de la préparation comme le brassage7,8. Mélange traditionnel avec agitation9 peut être suffisant pour bioinks de faible viscosité pour impression jet d’encre10, mélange de cellules dans un bioink de haute viscosité plus approprié pour extrusion bioprinting est plus difficile. Répondre à ce besoin, l’utilisation des buses de mélange est devenu plus populaire pour le mélange de bioinks au cours du processus d’impression11. Ces mélangeurs ont également été largement utilisés dans la recherche de microfluidique où le mélange de fluides avec faible nombre de Reynolds est important12. L’utilisation d’un procédé de mélange continu se fondre une suspension de cellules dans une bioink permettrait d’assurer l’uniformité au cours du processus d’impression. Toutefois, étant donné que les suspensions cellulaires possèdent par rapport à un bioink de faible viscosité, difficultés surgiront dans la prévention de la sédimentation des cellules au cours de l’impression processus9,13,14. Sinon, le mélange de cellules dans un bioink avant l’impression peut résoudre ce problème.
Afin de minimiser la mort cellulaire en cours de préparation dans un bioink, nous avons développé une technique basée sur une unité de mixage passive se fondre les cellules dans un bioink du nombre minimal de mesures. Le mélange chaotique généré par le flux des matières par le biais de la mélangeuse suffit de façon reproductible mélange deux composants ensemble15,16. Cette méthode a été principalement développée pour simplifier le mélange de toute suspension de cellules avec n’importe quel bioink qui convient pour extrusion bioprinting. Le nombre d’étapes dans le processus de mélange a été réduit au minimum afin d’éliminer les utilisateurs à variation dans le mélange. Étapes de mélange excessifs peuvent être fastidieux et non applicable à tous les bioinks, en particulier lorsque les cellules sont impliqués. Secondaire, nous avons cherché à développer un processus de mélange qui a été autonome à la fois préserver la stérilité et minimiser la perte d’échantillon.
Dans ce manuscrit, nous démontrons le mélange d’une suspension de cellules avec un bioink à l’aide d’un passif mélange technique de l’unité qui minimise la manipulation et se traduit par une distribution uniforme et de viabilité de cellules haute. Ces bioinks pre-cellularized sont ensuite utilisés pour bioprint cartilage ou une peau de construire avec un ou deux types de cellules, respectivement qui sont mis en culture pendant 6 semaines. Le bioink utilisé est un mélange de l’alginate-nanocellulose, qui auparavant a démontré des qualités pour bioprinting1.

<table><tbody><tr><td>Kit STARTINK</td><td>CELLINK</td><td>SK0001</td><td>Kit contenant tous les éléments pour la procédure CELLMIXER</td></tr><tr><td>Kit Live/Dead Life</td><td>Technologies</td><td>L3224</td><td>Kit pour l’analyse de la viabilité cellulaire après mélange</td></tr><tr><td>du Trichrome</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT15-1KT</td> de Masson <td>Kit pour l’analyse du dépôt de collagène I dans les constructions cutanées</td></tr><tr><td>Alcian Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B8438-250ML</td><td>Kit pour l’analyse du dépôt de glycosaminoglycanes dans les constructions cutanées</td></tr><tr><td>Bio-imprimante INKREDIBLE+</td><td>CELLINK</td><td>Gen1+</td><td>Imprimante utilisée dans l’étude</td></tr><tr><td>DMEM avec Glutamax</td><td>Thermofisher</td><td>10566016</td><td>Milieu pour la culture des cellules</td></tr><tr><td>10 % de sérum bovin fœtal</td><td>Thermofisher</td><td>A3160402</td><td>Media supplément</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td>Supplément de média Solution</td></tr><tr><td>d’imagerie cellulaire en direct</td><td>thermofisher</td><td>A14291DJ</td><td>composant utilisé à l’aide d’un microscope inversé d’imagerie en direct/mort</td></tr><tr><td></td><td>Microscope Olympus</td><td>IX73</td><td>utilisé</td></tr><tr><td>un appareil photo couleur numérique</td><td>Appareil photo microscope</td><td></td> <td>Olympus XC10</td> utilisé</tr><tr><td>Logiciel d’imagerie cellSens</td><td>Olympus</td><td>n/a</td><td>logiciel d’archives avec le microscope</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>n/a</td><td>logiciel d’analyse d’images open source</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 7</td><td>GraphPad</td><td>n/a</td><td>logiciel d’analyse statistique</td></tr><tr><td>Logiciel Slic3r (v1.2.9)</td><td>Slic3r</td><td>n/a</td><td>logiciel open source pour convertir un fichier .stl en gcode</td></tr><tr><td>dermique humain adulte primaire fibroblastes</td><td>ATCC</td><td>PCS-201-012</td><td>source cellulaire pour fibroblastes</td></tr></tbody></table>

bioprinting du cartilage et peau tissus analogues utilisant un roman passif unité technique de mélange pour bioink precellularization

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting est une technique puissante pour la fabrication rapide et reproductible des constructions pour applications en génie tissulaire. Dans cette étude, des analogues du cartilage et la peau ont été fabriqués après bioink pre-cellularization utilisant un roman passif mélange technique de l’unité. Cette technique a été développée dans le but de simplifier les étapes impliquées dans le mélange d’une suspension de cellules dans un bioink très visqueux. La résolution de filaments déposés par bioprinting nécessite l’assurance d’une uniformité dans la distribution de la cellule avant l’impression pour éviter les dépôts de régions sans cellules ou rétention de touffes de grandes cellules qui peuvent boucher l’aiguille. Nous démontrer sa capacité à mélanger rapidement une suspension de cellules avec un bioink avant bioprinting des analogues du cartilage et la peau. Les deux analogues de tissu pourraient être mis en culture pendant 4 semaines. L’analyse histologique a démontré la viabilité cellulaire et dépôts des marqueurs spécifiques de la matrice extracellulaire (ECM) tissus tels que des glycosaminoglycanes (GAGs) et de collagène j’ai respectivement.

Résultats dans ce manuscrit sont divisés en deux sections. Tout d’abord, la viabilité cellulaire a été analysée après mélange avec la méthode mécanique ou la mélangeuse passive. Ensuite, les constructions de cartilage et de la peau ont été cultivées et analysées pour les marqueurs histologiques.
Distribution de la cellule est apparu homogène dans les deux cas. Toutefois, l’action de mélange à la main à l’aide d’une spatule (Figure 2b) a une variance plus que mélanger avec une unité de mixage passive (Figure 2a). La mesure, la vitesse et la technique de mélange avec une spatule dépend fortement de l’utilisateur. Cependant, mélange de cellules dans un bioink avec une mélangeuse passive normalise mélange et minimise les variations dans l’ensemble de lots. En outre, les 30, 60 et 90 s mélangeant temps mai ne pas être suffisant pour le mélange d’une grande quantité de cellules dans une grande quantité de bioink. Un mélange plus rigoureuse grâce à mélanger avec une spatule peut être nécessaire. En comparaison, utilisant une mélangeuse passive mieux maintient le rapport de mélange des cellules à bioink en cours de préparation et s’assure qu’un mélange homogène est effectué. En outre, perte de l’échantillon est une préoccupation avec les techniques traditionnelles de mélange où bioink peut être laissé dans les boîtes de Pétri, tubes et outils de mixage en raison de leur haute viscosité. La viabilité cellulaire a été élevée pour le mélange avec une mélangeuse (&gt; 90 %) 1, 2 ou 3 fois. Lorsque l’unité de mixage passive a été utilisée, mélange a pris environ 1 min à vitesse lente constante fusion. Alors que mélanger avec une spatule grande viabilité après le mélange pendant 30 à 60 s, supérieur à 90 s de mélange a entraîné une diminution significative de viabilité par rapport aux autres groupes (77,9 ± 14 %, p &lt; 0,05) (Figure 2c). Ceci peut être dû mélange excessif qui cause des dommages aux cellules. À long terme vivent/dé coloration après 14 jours et 28 jours de culture apparaît en supplémentaire Figure 1. Cellules commencent qui se propage par jour 14 et sont fortement propagées par jour 28 et indiquent la bonne viabilité.
Après culture, analogues de tissus cartilagineux et la peau ont été analysés par le biais de l’histologie. Analyse des constructions de cartilage à 0, 14 et 28 jours montre une augmentation de la quantité et de la couverture de GAGs comme en témoigne une tache bleu Alcian (Figure 3a-3_c). L’absence de la tache est remarqué au jour 0, au jour 14 coloration est limitée aux emplacements proximales vers les cellules. Cependant, en 28 jours de culture, le bleu Alcian trouve tout au long de la construction, ce qui démontre la formation d’un chondrocytaire ECM. Bioprinted constructions de peau ont été analysées par le biais de coloration histologique du collagène I utilisant tache Trichrome de Masson, un (Figure 3d-3f). Comme pour les constructions de cartilage, jour 0 échantillons ne présentés aucun dépôt de collagène. Jour 14 de la culture, importants gisements de collagène ont été enregistrées autour des cellules et le long de la surface de la construction. Ceci a été encore renforcé par jour 28, comme les couches denses de collagène ont été trouvés sur la surface de la construction et dans la majeure partie.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56372/56372fig1.jpg"> 
Figure 1 : Passif unité système de mélange. (un) seringue de 1 mL de suspension cellulaire, seringue de 12 mL (b) avec bioink, unité de dosage (c), unité de mixage passive (d) (e) de remplissage cartouche, (f) montage de la seringue de bioink (1) et la cellule seringue de suspension (2) dans l’unité de dosage, fixation de l’unité de mixage passive à la fin de seringues (3), (g) de fixation du connecteur femelle-femelle Luer lock (4) et de fixation de la cartouche de remplissage (5) termine l’Assemblée, (h ) compresser l’unité de dosage pour amorcer le mixage (6), (i) continuer à pousser vers le bas sur l’unité de dosage à mélanger la suspension cellulaire avec le bioink et distribuer dans la cartouche de remplissage (7). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56372/56372fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56372/56372fig2.jpg"> 
Figure 2 : Images de viabilité et analyse des cellules. Les images représentatives montrant vivant (vert) et fibroblastes humains morts (rouge) après avoir mélangé avec le passif, unité 1, 2 ou 3 temps de mélange (une) ou spatule pour 30, 60 ou 90 secondes (b) et la culture 3D pendant 1 nuit. Image à un grossissement de X 4 sont affichées. Barres d’échelle indiquent 200 µm. (c) viabilité moyenne pourcentage des fibroblastes humains après avoir mélangé avec le passif mélange unité ou une spatule et la culture 3D pour 1 jour. Barres d’erreur Voir la déviation standard de la moyenne, * 0,005. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56372/56372fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56372/56372fig3.jpg"> 
Figure 3: tissu spécifique de la matrice extracellulaire dépôts. Constructions de cartilage Bioprinted colorées pour glycosaminoglycanes utilisant Alcian bleu à (un) jour 0, (b) 14 et (c) 28. Images capturées à un grossissement de X 5. Bioprinted des constructions de peau tachées de collagène j’ai utiliser Trichrome de Masson (d) les jours 0, (e), 14 et (f), 28. Images capturées à un grossissement de X 5. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56372/56372fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/56372/56372supfig1.jpg"> 
Supplémentaire Figure 1: la viabilité cellulaire au jour 14 (un) et le jour 28 (b). Barre d’échelle est 200 µm, vert se réfère pour vivre les cellules, rouge fait référence à des cellules mortes. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56372/56372supfig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Cartilage et peau analogues ont été bioprinted à l’aide d’un bioink de nanocellulose-alginate basé. Les bioinks ont été cellularized avant l’impression via une unité de mixage passive seule étape. Les constructions ont été démontrées pour être uniformément cellularized, ont la grande viabilité et présentent des marqueurs de différenciation favorables.

Bioprinting du Cartilage et peau tissus analogues utilisant un roman passif unité Technique de mélange pour Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

L’objectif global de cette procédure est de faciliter la pré-cellularisation rapide et reproductible des bio-encres pour les applications de bio-impression tout en préservant la viabilité cellulaire. Cette méthode peut aider à rationaliser et à améliorer la reproductibilité lors du mélange d’une suspension cellulaire avec une bio-encre pour assurer l’impression de cellules viables. Le principal avantage de cette technique est qu’elle élimine notre capacité à mélanger en mélangeant des cellules avec une bio-encre dans un système fermé avec une manipulation minimale et un risque de perte d’échantillon.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car il existe un risque de mélange incorrect si l’assemblage n’est pas effectué correctement. Pour commencer, procurez-vous deux seringues. Une seringue est destinée à la suspension cellulaire tandis que l’autre seringue est destinée à la bio-encre.Le rapport de mélange utilisé dans cette étude est de 10 pour un. Par conséquent, utilisez une seringue de 12 millilitres et une seringue d’un millilitre, comme l’exige l’unité de mélange 10 pour un. Procurez-vous également une unité de mélange passive stérile qui peut être couplée à deux seringues via un raccord Luer Lock et un connecteur Luer Lock femelle-femelle stérile.Récupérez une unité de distribution capable d’extruder un volume à partir de deux seringues stériles simultanément à un rythme contrôlé. Enfin, procurez-vous une cartouche stérile dans laquelle mélanger directement la bio-encre et la suspension cellulaire. Dans ce protocole, une bio-encre à base d’alginate de nanocellulose est utilisée, qui est réticulée par l’ajout d’une solution de chlorure de calcium après l’impression.Pour préparer les cellules, détachez-les à l’aide d’une solution d’EDTA à 0,5 % de trypsine. Dans ce protocole, des fibroblastes humains sont utilisés. Ensuite, comptez le nombre total de cellules à l’aide de la méthode d’exclusion du bleu de trypan.Déterminez la densité cellulaire souhaitée dans la construction imprimée finale. Calculez la concentration des cellules récoltées qui doivent être diluées pour atteindre cette densité cellulaire finale cible. Dans ce protocole, une densité cellulaire finale de cinq millions de cellules par millilitre a été utilisée.Transférez la suspension cellulaire dans la seringue de suspension cellulaire. Transférez également la bio-encre dans l’autre seringue. Ensuite, tirez le piston de la seringue bioink vers l’arrière et insérez-la dans l’unité de distribution.Assurez-vous qu’au moins la moitié du volume des seringues à retirer est constituée d’air stérile provenant de l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique. Il est important que les positions des pistons de seringue soient maintenues lors de l’insertion dans l’unité de distribution. Positionnez l’appareil verticalement avec le connecteur Luer Lock vers le haut.Tirez ensuite le piston de la seringue cellulaire à une longueur similaire à celle de la seringue bioink et insérez-le dans l’unité de distribution. Assurez-vous qu’il n’y a pas de décharge accidentelle de la suspension cellulaire ou de la bio-encre en vous assurant que l’unité de mélange est fixée uniformément aux deux seringues. Vérifiez deux fois avant de mélanger.Fixez les deux seringues à l’unité de mélange en tournant les connecteurs Luer Lock. Ensuite, amorcez le système de mélange en poussant sur l’unité de distribution pour extruder l’air dans la seringue. Arrêtez l’amorçage avant que la solution n’atteigne le verrou Luer.Après l’amorçage, fixez la cartouche de remplissage à l’extrémité de l’unité de mélange via le connecteur Luer Lock. Assurez-vous que le piston de la cartouche de remplissage se trouve au fond avant de la fixer. Comprimez lentement l’unité de distribution pour mélanger l’encre biologique et la suspension cellulaire dans la cartouche.Poussez le piston de la cartouche de remplissage vers le bas à l’aide d’une pointe de pipette stérile pour entrer en contact avec le mélange de cellules de bio-encre après le mélange. Maintenez l’unité de distribution comprimée pour vous assurer que le mélange de bio-encre cellulaire n’est pas extrudé dans l’unité de mélange. Fermez la cartouche et tapotez doucement sur la surface de travail pour déplacer les bulles d’air vers le haut de la cartouche.À ce stade, le mélange de bio-encre cellulaire est prêt pour l’impression. Dans ce protocole, une structure carrée de dimensions 4,8 x 4,8 x 0,9 millimètres cubes a été exportée sous forme de fichier de stéréolithographie. Un fichier g-code a été généré à partir de la structure du treillis à l’aide des paramètres trouvés dans le protocole texte.Isoler et cryoconserver les chondrocytes nasaux humains primaires, ou HNC, des patients, en suivant le protocole référencé. Décongeler et étendre les HNCs cryoconservés et se dilater une fois dans une culture monocouche en utilisant un milieu de culture standard à 37 degrés Celsius. Détachez les cellules à 80 % à 90 % de confluence avec une solution EDTA de trypsine à 0,5 % et comptez à l’aide d’un protocole d’exclusion du bleu de trypan.Toutes les expériences ont été menées à l’aide de HNC au deuxième passage. Nous suspendons les HNCs à 100 millions de cellules par millilitre dans un rayon de 300 microlitres de milieu de culture, complété par 10 % de sérum de veau fœtal, 1 % de streptomycine de pénicilline et 50 microgrammes par millilitre d’acide ascorbique en préparation du mélange avec la bio-encre. Mélangez la suspension cellulaire HNC dans une bio-encre à base d’alginate de nanocellulose, en suivant le protocole de l’unité de mélange passif à un rapport de 10 pour une bio-encre par suspension cellulaire, pour obtenir une concentration cellulaire finale de neuf millions de cellules par millilitre.Assurez-vous que la bio-imprimante est stérilisée par exposition aux UV et essuyez-la avec de l’éthanol à 70 %. Maintenez la stérilité en plaçant la bio-imprimante dans l’armoire à flux laminaire. Fixez ensuite des buses d’impression stériles aux cartouches contenant les mélanges de suspension de cellules de bioencre et insérez-les dans la bio-imprimante.Après avoir calibré la bio-imprimante, bio-imprimez les constructions chargées de cellules structurées en treillis à l’aide de la buse conique de calibre 25 à une pression de 25 kilopascals. Bioprint (acellulaire) construit comme contrôle. Réticuler les constructions en ajoutant une solution ionique de 100 millimères ou de chlorure de calcium.Au bout de cinq minutes, rincez les constructions. Ensuite, incubez les constructions dans un milieu de culture dans des conditions de culture standard, en changeant le milieu tous les deux ou trois jours. Prélever des échantillons pour analyse histologique aux semaines deux et quatre.Colorez les échantillons pour la production de glycosaminoglycanes, ou GAG, à l’aide d’un colorant au bleu alcien. La viabilité de la cellule 24 heures après le mélange avec l’unité de mélange passif ou une technique de mélange manuel est illustrée. L’unité de mélange passive a montré une meilleure viabilité, car l’étendue du mélange a été augmentée.Ceci est important car des temps de mélange plus longs peuvent être nécessaires lors de la préparation de grands lots de bio-encres précellularisées. La viabilité cellulaire au jour 14 et au jour 28 de la culture est illustrée ici. Une bonne viabilité cellulaire est visualisée, montrant la survie cellulaire à long terme lorsque cette technique est utilisée.Les glycosaminoglycanes sont visualisés dans des constructions cartilagineuses bio-imprimées, colorées au bleu alcian, aux jours zéro, 14 et 28. Ces images démontrent la formation de néocartilage au sein de ces constructions bio-imprimées. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 minutes si elle est exécutée correctement.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser un système d’unité de mélange passif pour cellulariser les bio-encres. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la bio-impression pour cellulariser rapidement et uniformément les bio-encres avec une technique de mélange doux.

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Bioprinting du Cartilage et peau tissus analogues utilisant un roman passif unité Technique de mélange pour Bioink Precellularization (Vidéo) | JoVE Journal

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