Name: Deuxième génération d’harmoniques signaux dans la sclérotique de lapin comme un outil pour l’évaluation des thérapeutiques tissulaires réticulation (TXL) pour la myopie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Découvrez la microscopie de génération de second harmonique pour visualiser le réticulation du collagène dans la sclère de lapin. Cette méthode non invasive évalue les effets thérapeutiques par injection sous-ténonienne.

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Les auteurs remercient Tongalp Tezel, MD, pour consultation publique concernant l’injection de sT ; Theresa Swayne, PhD, pour consultation au sujet de la SHG microscopie ; et Jimmy Duong de la conception et de ressources de biostatistique et de l’installation de base de biostatistiques de l’Institut d’Irving à Columbia University Medical Center.
Prise en charge en partie par la recherche pour prévenir la cécité et par les instituts nationaux de santé subventions RRRNC UL1RR024156, NEI P30 EY019007, NCI P30 CA013696 et NEI R01EY020495 (DCP). Columbia University possède une propriété intellectuelle connexe : US délivré des brevets no : 8 466 203 et aucun : 9 125 856. En attente de brevet international : PCT/US2015/020276.
Des images ont été recueillies dans le Confocal et spécialisé de ressources partagées de microscopie de l’Herbert Irving Comprehensive Cancer Center à l’Université de Columbia, pris en charge par les NIH grant #P30 CA013696 (National Cancer Institute). La microscopie confocale a été achetée avec les NIH accorder #S10 RR025686.

Toutes les procédures ont été effectuées à l’aide des yeux de lapin provenant de cadavres dans les têtes de lapin non consanguins intact. Tous les institutionnels et National des directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire ont été suivies.
1. préparation des Solutions
<ol><li>Préparation de SMG pour TXL :<ol>
<li>Préparer 1 mL de concentration de 0,2 M de solution (NaHCO3) de bicarbonate de sodium solution à l’aide de 0,0165 g de NaHCO3 poudre dissous dans 1 mL de l’eau distillée.</li>
		<li>Dissoudre 0,1016 mg de hydroxyméthylglycinate de sodium en poudre (SMG) dans 1 mL de l’eau distillée pour obtenir une concentration finale de 800 mM SMG. Ajuster la solution de bicarbonate de sodium à une concentration finale de 0,1 M NaHCO3 et 400 mM SMG. Concentration de SMG selon la réticulation effet désiré. Dans le protocole décrit ici, nous avons utilisé 40, 100 et 400 mM SMG.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Injection de subTenon pour TXL utilisant SMG
<ol><li>Remplir deux seringues à insuline 1 mL (aiguilles 25G) de 400 µL contrôle et solution SMG, respectivement.</li>
	<li>Placez la tête du lapin dans un plan de profil à l’aide d’un coussin. Mousse de polystyrène ou une pile de papier peut servir à fixer la tête dans une position optimale.</li>
	<li>Rétraction des paupières avec un spéculum oeil pédiatrique.</li>
	<li>Mesurer la première pression intraoculaire (PIO) à l’aide d’un dispositif de tonométrie d’aplanation.</li>
	<li>Marquer l’endroit de l’injection prévue sur la partie médiane supérieure de la limbe avec un marqueur de tissus.</li>
	<li>Rétracter la conjonctive entourant le site d’injection avec une pince conjonctivale (ou n’importe quel pince bout rond dentelé) et insérer l’aiguille à travers la conjonctive, entrant dans la capsule de Tenon à peine au-delà du site limbique marqué (c'est-à-dire, 2-3 mm de la limbe). Une petite incision dans la conjonctive peut aussi faire avec des ciseaux iris afin de faciliter le passage de l’aiguille dans la capsule de Tenon.</li>
	<li>Une fois au sein de la capsule de Tenon, s’assurer que l’aiguille est librement mobile en le déplaçant à côté. Pendant ce temps, le monde ne doit pas bouger. Cela confirme le positionnement correct de l’aiguille au-dessus de la sclère en de sub-Tenon (sT) espace.</li>
	<li>Injecter la solution de la seringue et jeter l’aiguille. Immédiatement après l’injection, le liquide s’accumule dans l’espace de sT créant un renflement antérieur vu à travers la conjonctive (c.-à-d., chémosis).</li>
	<li>Recommencez la mesure de la PIO afin de confirmer qu’il n’a pas changé en raison d’une perforation accidentelle de la planète.</li>
	<li>Retirer le spéculum de couvercle et effectuer un massage digital à travers les paupières fermées pendant environ 2-3 min.</li>
	<li>Laissez la tête pendant une période d’incubation de 3,5 h (température ambiante = 18 ° C), avant de passer à l’étape suivante.</li>
</ol>3. préparation du tissu
<ol><li>Rétraction des paupières à l’aide du spéculum paupière afin d’optimiser l’accès au monde entier. Sélectionnez le spéculum de façon optimale de taille selon la taille de le œil.</li>
	<li>Séparer la conjonctive entourant le limbe. Si elle a déjà été l’objet d’une incision près du site d’injection, sur sa circonférence élargir les frontières alors il contiendrait une taille de l’inoculum de 1 x 1 cm environ.</li>
	<li>Couper les muscles extra oculaires à leurs sites d’insertion sclérale.</li>
	<li>Élever le globe oculaire avec une pince, en le poussant du côté postérieur. Cela permet d’accéder au globe postérieur et facilitera la découpe du nerf optique avec l’artère ophtalmique et veine située près du pôle postérieur du globe.</li>
	<li>Découper le corneoscleral complexe, avec la bordure extérieure, y compris la point marqué d’injection. La tache doit être toujours visible sur la partie restante de la sclère.</li>
	<li>Retirez le corpus vitreus et toutes les couches, attachés à la face interne de la sclère en appliquant la traction avec une pince de tissu. Remarque : D’autres mesures dépendent les procédures suivantes sont effectuées : 4. - analyse de la DSC, 5. - microscopie SHG.</li>
</ol>4. pour l’analyse régionale de DSC
<ol><li>
Pour les yeux traité : découpée dans quatre secteurs de décentrer la coupe sclérale restante avec les ciseaux afin que le site de l’injection est situé dans le secteur supérieur et aligné au centre. Couper les 3 autres secteurs latéraux (c.-à-d., nasale et temporelle), et le fond. NOTE : la numérotation des secteurs (1-4) qui sont encore divisés en carrés (1-16) est illustrée dans la Figure 1 a.</li>
	<li>Couper les secteurs sclérales (1-4) en petits carrés (1-16) d’environ 4 x 4 mm. Secteur 1 devrait être divisé en 9 carrés (faire le point exact d’injection une individuelle place [2]). Diviser les secteurs 2 et 3 en 2 carrés de chaque (carrés 10-11 et 12-13) et 4 en 3 carrés (14-16 places).</li>
	<li>Attribuer un numéro à chaque carré, tel qu’illustré à la Figure 1 a, afin de localiser la distance du tissu analysé depuis l’emplacement de la zone injectée.</li>
	<li>
Pour les yeux de contrôle : après divisant le tissu en quatre secteurs sclérales (semblables à du tissu traité) découpe morceaux carrés de tissus aux endroits suivants : 3 places depuis le haut de la page (secteur 1), 1 de chaque côté (secteurs 2 et 3) et 1 de la bas (secteur 4).</li>
	<li>Gratter les couches rétiniennes et choroïdienne restants et laver deux fois avec du PBS frais chaque fois, laissant les pièces immergées dans la solution pendant environ 10 s à la fois.</li>
</ol>5. pour l’imagerie de la SHG
<ol><li>Couper la partie supérieure de la sclérotique à l’aide de ciseaux pour créer une zone de 1 x 1 cm avec le point d’injection, alignée au centre.</li>
	<li>Gratter les couches restantes de la rétiniens et la choroïdes et laver deux fois avec du PBS frais chaque fois laisser les morceaux dans la solution pendant environ 10 s.</li>
	<li>Placez le tissu en tubes de 1 mL remplis de solution de PBS pour le transport jusqu'à l’établissement d’imagerie. Toutes les procédures, suivant le temps d’incubation et commençant par la dissection du globe oculaire doivent être effectuées moins d’une heure.</li>
</ol>6. Protocole de microscopie
Remarque : Ce protocole d’imagerie éparpillés à l’arrière du signal du SHG du collagène du tissu sclérotique est adapté pour le laser, microscope à balayage.
<ol><li>
Mettre en place la microscopie
	<ol>
<li>Afin de maximiser le signal et la résolution lorsque effectuant la microscopie SHG utilisez une lentille d’objectif optimisent pour la transmission infrarouge lumière et avec une grande ouverture numérique (NA). Notre objectif est de Nikon Apo LWD 25 x / NA1.1 de l’eau d’immersion.</li>
		<li>Ajustez le collier de correction de l’objectif pour correspondre à la profondeur de l’échantillon, dans ce cas c’est l’épaisseur de la lamelle, 0,17 millimètres.</li>
		<li>Monter l’objectif 25 x et ajouter une quantité généreuse de gel à base d’eau pour couvrir la surface d’imagerie avant de monter l’échantillon lubrifiant. Le gel à base d’eau ne s’évapore pas pendant l’expérience et par conséquent maintiendra une qualité d’image.</li>
		<li>Placez le tissu scléral d’un tube de 1 mL avec du PBS sans sécher entre deux lamelles de rond de 25 mm (épiscléral vers le bas) fournissant maximale un contact entre l’episclera et la surface de la lamelle couvre-objet. NOTE : Le tissu peut également être placé découvert sur la lamelle couvre-objet. Une bonne quantité de PBS devrait garder le tissu hydraté pendant la formation image. Dans ce cas, ajouter le morceau de tissu et les PBS après avoir assemblé la cellchamber.</li>
		<li>Assembler la chambre de la cellule, en plaçant une lamelle ronde 25 mm, seule ou dans une technique de "sandwich", sur la partie inférieure de la chambre et vissez la partie supérieure afin de créer un scellé autour de chambre. Ne vissez pas vers le bas fermement quand une lamelle supérieure est utilisée, afin d’éviter l’aplatissement artificiellement et endommager les tissus.</li>
		<li>Monter la chambre de cellule avec l’échantillon de tissu sur la platine du microscope.</li>
		<li>Sur la valeur du microscope pour vue avec lumière transmise.</li>
		<li>Positionnez la platine et régler la hauteur de l’objectif tel que la surface inférieure de l’échantillon est au point, tel que déterminé par l’inspection sur pied lumineux à travers l’oculaire.</li>
		<li>Éteindre toutes les lumières sauf l’écran d’ordinateur et bloquer autant de lumière du moniteur que possible avec des feuilles de papier aluminium drapés sur la platine du microscope. Minimiser toute lumière parasite atteignant les détecteurs assurera acquisition faible bruit, comme les détecteurs GaAsP NDD ont une sensibilité élevée.</li>
		<li>Dans le panneau de garniture de Ti du logiciel, vérifiez que la définition de la lentille est correcte.</li>
		<li>Dans le panneau A1 GUI Compact, choisissez le laser IR pour l’imagerie, sélectionnez les détecteurs de NDD et choisissez le canal DAPI qui est équipé d’un filtre passe-bande de 400 à 450 nm.</li>
		<li>Dans le panneau de A1 MP GUI, définissez la longueur d’onde du laser infrarouge à 860 nm et ouvrir l’obturateur.</li>
		<li>Définir comme suit les conditions dans le panneau A1 GUI Compact à balayage laser. Sélectionnez : b Galvano scanner, numérisation (b) unidirectionnel, (c) Pixel dwell time 6.2 µs, d cadre taille 1 024 x 1 024 pixels, ligne e, avec une moyenne de 2 x NOTE : Galvano scanneur et un balayage unidirectionnel garantit un alignement précis point par point. Une taille de 1 024 x 1 024 pour la totalité du champ de vision se traduit par une taille de pixel de 0,5 μm /pixel. Ligne moyenne permettra de réduire le bruit de grenaille dans l’image.</li>
		<li>Conditions d’imagerie réglées dans panneau A1 GUI Compact en ajustant la puissance du laser et détecteur de gain. Ouvrez le panneau de Look Up Table (LUT) qui affiche un histogramme des valeurs d’intensité de pixel de l’image actuelle. Tourner sur l’imagerie live en mode « Rechercher » et maximiser la plage détectée des valeurs de pixel en ajustant gain de puissance et détecteur laser. Éviter la saturation. Valeurs typiques sont la puissance de laser de 2,5 %, passant de 2,35 W à 860 nm et 100 HV (gain de détecteur).</li>
		<li>Remarque : Pour cette configuration, la puissance de laser mesurée avec un wattmètre interne est 5,2 mW. Chaque fois qu’une expérience est menée, ré-ajuster le pourcentage de laser telle que la mesure de la puissance interne est constante à 5,2 mW entre séances d’imagerie. Être prudent lors du réglage de puissance du laser. Le laser Chameleon II est un laser de 3 W à 800 nm et un 10 % ou une puissance plus élevée pourrait potentiellement induire des lésions tissulaires.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Acquisition d’images
	<ol>
<li>En mode aperçu, scannez la zone de tissu à l’aide de l’outil aperçu de XYZ.</li>
		<li>La valeur de l’imagerie à basse résolution (256 x 256 pixels et aucune ligne en moyenne) afin d’accélérer l’acquisition d’images dans ce mode.</li>
		<li>Capture de 5 x 5, 3 x 3 ou champs de vue unique pour couvrir toute la surface du tissu. À chaque endroit, avant la prise de vue d’ensemble, activer le mode « Scan » direct et mettre le tissu au point. Notez que les différentes régions du tissu aura des positions légèrement différentes dans le sens axial.</li>
		<li>Trouver un endroit plat où les fibres de collagène sont visibles dans le champ de vision complet et double-cliquez sur ce poste dans l’outil d’aperçu pour déplacer l’étape vers cet emplacement particulier.</li>
		<li>Activer mode « Scan » live, ajuster la position Z de l’objectif tel que le plan inférieur est mise au point et, dans le pavé de la Ti, utilisez le lecteur Z pour déplacer le plan optique 10 à 15 μm au-dessus de cette couche de fond.</li>
		<li>Acquérir une image à haute résolution de 1 024 x 1 024 pixels et 2 x ligne moyenne, en utilisant le bouton « Capture ».</li>
		<li>L’emplacement d’enregistrement dans la vue d’ensemble de XYZ en utilisant le bouton « + ». Cela garantit que la même zone du tissu n’est pas reprise.</li>
		<li>Pour chaque morceau de tissu capturer 10 images de non-cumul champs de vision.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Protocole de DSC
Remarque : Passez à cette étape, dès la préparation du tissu est terminée, pour l’analyse régionale de DSC, ou après tissue imaging lorsque SHGM est effectuée.
<ol><li>Préparer les casseroles de DSC, pesé et étiqueté. Remarque : Cette étape devrait être faite avant la dissection des tissus afin de minimiser la dessiccation des tissus.</li>
	<li>Sécher chaque carré sclérale avec un tissu absorbant et posez-le à plat sur le fond d’un moule de DSC à l’aide de la pince crantée.</li>
	<li>Peser le moule avec le tissu à l’intérieur et le couvercle serti et couverts pour obtenir les tissus poids humide (masse des échantillons doit être de l’ordre de 5 à 11 mg). Remarque : Le joint chaque pan à l’aide de la pince avant de passer à l’échantillon de tissu suivant. Les casseroles sont hermétiquement fermés, empêchant toute perte d’eau avant l’analyse thermique.</li>
	<li>Une fois que l’échantillon est serti, placez-le sur l’emplacement désigné sur le plateau de DSC. Il devrait y avoir 6 échantillons pour le contrôle et 16 pour les yeux traité.</li>
	<li>Créez une méthode à l’aide d’instrument de gestion des logiciels, en précisant le poids du tissu, et exécutez l’analyse thermique en utilisant les paramètres suivants : température ambiante de 40 à 80 ° C, vitesse de chauffage : 1 ° C/min, le flux thermique : 17,37 mW, débit de gaz (N2) : 19,8 mL/min, Pression gaz : 2,2 bar.</li>
	<li>Une fois terminé, analyser les données pour chaque échantillon en extrayant le pic de température de transition à laquelle dénaturation thermique se produit à l’aide de l’instrument de gestion des logiciels.</li>
</ol>8. image Analysis
<ol><li>
Signal SHG
	<ol>
<li>Sélectionnez au moins 5-10 des images plus représentatives de chaque traitement et son contrôle, tels que la zone de l’image occupe principalement des fibres de collagène.</li>
		<li>Télécharger chaque image dans le logiciel ImageJ et mesurer l’intensité moyenne de pixel en sélectionnant Analyze > mesure pour l’image active.</li>
		<li>Les valeurs extraites sont signalés comme l’intensité moyenne des pixels et peut également être indiquées en traçant l’histogramme des intensités en sélectionnant dans le menu Analyze > histogramme.</li>
		<li>À l’aide d’une feuille Excel, créer une table pour documenter toutes les données mesurées en conséquence à l’ID d’échantillon.</li>
		<li>Calculer la moyenne et l’écart d’intensité pixel pour chaque condition de traitement et de contrôle.</li>
		<li>T-test de l’utilisation de l’étudiant, comparer les différences pour toutes les comparaisons par paires des concentrations (c'est-à-dire40 mM SMG vs 0 et 400 mM SMG vs 0). [P ≤ 0,05].</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ondulation
	<ol>
<li>Sélectionnez une image qui affiche des fibres de collagène. Il faudrait analyser au moins 10 images par échantillon (y compris un échantillon de contrôle pour chaque concentration - au moins 40 au total).</li>
		<li>Ouvert ImageJ > Plugins > NeuronJ. NeuronJ nécessite l’installation préalable.</li>
		<li>Télécharger imagesby tous les faire glisser dans une fenêtre ouverte de la NeuronJ .</li>
		<li>Créer de tracer des lignes le long des fibres, suivant la courbure de la fibrille avec la souris (dessin comprimés pourrait servir), cliquez sur M pour mesurer la distance de la longueur des fibres totales.</li>
		<li>Sélectionnez « Option » pour dessiner une ligne droite tangentielle et connecter le début et la fin du contour fibre déjà dessinés. Maintenant cliquez sur M pour mesurer la longueur de bout en bout.</li>
		<li>Répétez la même procédure au moins 10 fibrilles par image.</li>
		<li>Recueillir ces deux mesures de chacun des 10 fibrilles et entrer les données dans un tableur excel, exprimant la longueur des fibres totales (contour) et longueur de bout à bout (ligne de raccordement tout droit) comme longueur [courbe] et [linéaire], respectivement.</li>
		<li>Calculer l’indice d’ondulation (W) selon la formule suivante : W = longueur [courbe] / [linéaire] de longueur.</li>
		<li>Calculer le % d’ondulation en comparant les données à partir des images de samples(SMG) traités avec les images provenant d’échantillons de contrôle à l’aide de la formule : (W [SMG] - 1) / (W [commande] - 1)</li>
		<li>Effectuer un test t par paires pour index ondulation (W) afin de déterminer les différences statistiques (p-valeurs) de la morphologie de fibre de collagène entre des conditions différentes de traitement et de contrôle.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Expériences ont montré des preuves à l’appui de l’utilisation de la microscopie de signal SHG comme une méthode d’évaluation de collagène réticulation des effets dans la sclérotique, évoquant la possibilité future d’utiliser cette technique comme un outil de suivi pour les traitements de réticulation qui cible les protéines de collagène. À noter, un instrument est déjà en usage clinique pouvant potentiellement capturer ce signal SHG. Bien que cet instrument a été conçu principalement pour l’imagerie derme de la peau, il ...

Myopie progressive est postulée pour être traitable par réticulation sclérale non enzymatique (photochimique et/ou chimiques), ce qui est logique étant donné que le blocage enzymatique réticulation de collagène peut augmenter la privation (FD) de forme expérimentale-induite 1de myopie. Elsheikh et Phillips2 a récemment examiné la faisabilité et le potentiel d’utilisation standard irradiation ultraviolets A (UVA)-riboflavine médiée par réticulation photochimique (également connu sous le nom du protocole de Dresde), en abrégé ici comme (riboflavine CXL) pour une stabilisation sclérale postérieure stopper une élongation axiale dans la myopie. Cette méthode photochimique a été utilisée avec succès pour traiter la déstabilisation de la surface antérieure de globe (c.-à-d., la cornée bombée) vue dans keratectasia kératocône et post-LASIK. Cependant, application du présent protocole CXL pour la sclère est entravée par questions liées aux difficultés d’accès à la sclère postérieure avec une source de lumière ultraviolette (UV), ainsi que la nécessité de modifier une beaucoup plus grande tissu surface. Qu’étant dit, l’approche CXL a été utilisé pour stopper l’élongation axiale sous forme visuellement privé lapins (par tarsorrhaphy), bien que plusieurs régions de la sclère postérieure tenu plusieurs zones distinctes de l’irradiation dans cette étude3. En revanche, l’injection d’un agent stabilisant chimique (p. ex., agent de réticulation) par l’intermédiaire de l’espace sT pourrait représenter un moyen plus simple de modifier la sclère postérieure, évitant la nécessité d’introduire une source de lumière UV. Cette technique d’injection est bien connue comme un moyen utile d’induire une anesthésie oculaire durant les interventions ophtalmologiques tels que cataracte chirurgie4,5,6. Wollensak7 a décrit précédemment l’utilisation d’une injection de sT à l’aide de glycéraldéhyde (un réticulation agent chimique semblable au concept de la formaldéhyde libérant des agents (FARs) décrites dans la présente étude) pour raidir le lapin sclérotique et la genipin a été montré pour limiter la longueur axiale en FD cobayes8,9. Ces chercheurs ont démontré un net avantage de l’utilisation d’un agent chimique soluble sur la technique CXL photochimique. Ainsi, sclérale réticulation à l’aide d’un agent chimique injectable d’un certain type, y compris le FARs (c.-à-d., TXL)10, pourrait fournir une méthode de traitement possible pour stopper la progression de l’élongation sclérale vue dans la myopie.
Dans les protocoles présentés ici, nous utilisons la solution réticulation chimique de sodium hydroxyméthylglycinate (SMG), administrée par injection de sT à la sclérotique des yeux de lapin provenant de cadavres. Nous avons mis en place des protocoles similaires précédemment pour la réticulation chimique topique dans la cornée. Notamment dans les études rapportées antérieurement, dépendante de réticulation des effets de la concentration pourrait être obtenue en utilisant des SMG, avec une gamme d’effet couvrant bien supérieure à celle possible avec des procédés photochimique CXL tel que déterminé par l’analyse de la dénaturation thermique11 .
Nous décrivons ici les protocoles visant à évaluer l’effet de réticulation de SMG envoyée via des injections de sT au tissu scléral, dénaturation thermique à l’aide de la calorimétrie à balayage différentielle (DSC) et deuxième de microscopie du génération harmonique (SHGM).
À l’aide d’analyse calorimétrique différentielle (DSC), également connu sous le nom de l’analyse thermique, une transition de dénaturation thermique est mesurée, qui pour tissu scléral est principalement guidé par les propriétés des collagènes fibrillaires, car ils constituent la majorité de vrac de la protéine. Cette méthode évalue la stabilité de la structure moléculaire de collagène et des liaisons réticulés qui stabilisent les fibrilles de collagène, la structure de la principale protéine tertiaire. Durant le chauffage dans le DSC, une température de transition critique est atteint qui entraîne la dénaturation de la molécule de collagène, entraînant dans le déroulement de la triple hélice, un processus qui se forme à ce qui est communément appelé gélatine. Cette dénaturation thermique perturbe les liaisons hydrogène le long de la molécule de collagène et peut être déplacée à des températures plus élevées par le biais de méthodes de réticulation induit12,13. Cette méthode a été utilisée pendant de nombreuses décennies, particulièrement dans l’industrie des biomatériaux et des processus qui incluent la fabrication de cuir. Toutefois, cette méthode nécessite l’extraction du tissu sclérotique et ne peut donc être utile comme technique d’ex vivo .
Microscopie (SHGM) de la génération de seconde harmonique est basée sur les propriétés optiques non linéaires des matériaux particuliers, avec des environnements moléculaires non-centrosymétriques. Dans ces matières, lumière intense, par exemple lumière produit par laser, génère des signaux SHG, dans laquelle la lumière incidente est doublée en fréquence. Matières biologiques qui sont connus pour créer des signaux SHG sont le collagène, microtubules et myosine du muscle. Par exemple, le collagène excités par une lumière infrarouge de longueur d’onde de 860 nm émet un signal SHG dans le domaine du visible avec la longueur d’onde de 430 nm. Génération de seconde harmonique (SHG) signal imagerie est une méthode prometteuse pour l’évaluation de réticulation du collagène thérapeutique. On sait depuis plus de 30 ans que les fibrilles de collagène dans les tissus émettent SHG signaux14. Cependant, seulement récemment des images haute résolution pu15 dans une variété de tissus, y compris le tendon16, peau, cartilage,17,18de vaisseaux sanguins et collagène gels19.
Basé sur cette connaissance, cette étude évalue les changements de signal SHG induits dans la sclérotique par SMG induite chimiquement la réticulation du collagène. Les résultats indiquent que la modification de SMG de la sclère augmente les signaux SHG produites à partir de faisceaux de fibres de collagène des tissus (la plus haut ordre structure quaternaire composée de fibrilles de collagène) et produit également un changement structurel morphologique dans le collagène réseau de fibres optiques, reflété dans la fibre bundle « redressement. »

<table><tbody><tr><td>MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V</td><td>EMD Millipore, Massachusetts, USA</td><td></td><td>Eau désionisée double distillée. - étape du protocole 1.1.1</td></tr><tr><td>Hydroxyméthylglycinate de sodium&nbsp ;</td><td>Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, États-Unis</td><td></td><td>Réactif de réticulation - étape de protocole 1.1.2</td></tr><tr><td>Aiguille d’injection avec seringue luer-lock</td><td>BD Eclipse, NJ, USA</td><td></td><td>Seringue pour injection sous-tenon. - étape de protocole 2.1</td></tr><tr><td>Tête</td> de <td>lapin Volaille La Granja</td><td>Tête de</td><td>lapin surlignée Tête de lapin séparée et livrée dans l’heure post-mortem. - étape de protocole 2.2</td></tr><tr><td>Tono-pen&nbsp ;</td><td>Reichter Technologies Depew, NY</td><td></td><td>Mesures IOP - étape de protocole 2.4</td></tr><tr><td>DSC 6000 Échantillonneur automatique</td><td>Perkin-Elmer Waltham, MA, USA</td><td></td><td>Analyseur de dénaturation thermique - étape de protocole 7.4</td></tr><tr><td>Logiciel Pyris&nbsp ;</td><td>Perkin-Elmer, Waltham, MA, États-Unis</td><td>Ver 11.0</td><td>&nbsp ; étape de protocole 7.5</td></tr><tr><td>CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td><td></td><td>Un objectif immergé dans l’eau avec une transmission IR élevée avec une distance de travail de 2,0 mm - étape de protocole 8.1.1.</td></tr><tr><td>GenTeal&nbsp ;</td><td>Alcon, Fort Worth, Texas</td><td>B000URVDQ8</td><td>Gel à base d’eau utilisé comme milieu d’immersion objectif à la place de l’eau pour éviter l’évaporation - 8.1.1</td></tr><tr><td>Chameleon Vision II&nbsp ;</td><td>Cohérent, Santa Clara, CA, USA</td><td></td><td>Laser pulsé Ti :Sapphire avec une largeur d’impulsion de 140 fs à 80 MHz et une plage accordable de 680 nm à 1080 nm. - étape de protocole 8.1.11</td></tr><tr><td>Chambre de cellule AttoFluor</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>A7816</td><td>Fixation de la lamelle de protection - étape de protocole 8.1.3</td></tr><tr><td>Lamelles rondes de 25 mm, #1.5</td><td>Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, États-Unis</td><td>GG-25-1.5</td><td>étape de protocole 8.1.3</td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY, États-Unis</td><td></td><td>étape de protocole 8.1.4.</td></tr><tr><td>Détecteur GaAsP non désannoté (NDD)</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td><td></td><td>Équipé d’un filtre passe-bande 400-450 nm - étape de protocole 8.1.7</td></tr><tr><td>Système de balayage laser A1R-MP</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td><td></td><td>Compatible avec l’excitation multiphotonique infrarouge (IR). - étape de protocole 8.1.8</td></tr><tr><td>Logiciel NIS Elements</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td><td>Ver 4.3</td><td>désigné comme « logiciel » dans le texte - étape de protocole 8.1.9</td></tr><tr><td>Fidji/ImageJ</td><td>Institut national de la santé</td><td></td><td>&nbsp ; étape de protocole 9.1.2</td></tr><tr><td>NeuronJ</td><td>Eric Meijering, Centre médical de l’Université Erasmus, Rotterdam, Pays-Bas</td><td></td><td>https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, pour l’étape de protocole 9.2.2</td></tr><tr><td>Microsoft Excel&nbsp ;</td><td>Microsoft Corporation, Redmond, WA, États-Unis</td><td>Ver 14</td><td>étape de protocole 9.2.8</td></tr></tbody></table>

deuxième génération d’harmoniques signaux dans la sclérotique de lapin comme un outil pour l’évaluation des thérapeutiques tissulaires réticulation (txl) pour la myopie

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia

Méthodes pour renforcer le tissu en introduisant des liaisons chimiques (réticulation non enzymatique) dans des protéines structurales (collagènes fibrillaires) pour la thérapie incluent la réticulation photochimique et tissus réticulation méthodes (TXL). Ces méthodes pour induire des changements de propriété tissu mécanique sont utilisées pour la cornée en amincissement cornéen (mécaniquement affaibli) troubles comme le kératocône, mais aussi la sclère dans la myopie progressive, où éclaircie et affaiblissement de la partie postérieure sclère se produit et contribue probablement à élongation axiale. Les protéines de la cible principale pour le renforcement de ces tissus sont des collagènes fibrillaires qui constituent la grande majorité des protéines de poids sec dans la cornée et la sclérotique. Fortuitement, collagènes fibrillaires constituent la principale source de deuxième génération harmonique de signaux dans l’espace extracellulaire du tissu. Donc, modifications des protéines de collagène, telles que celles induites par le biais de thérapies, la réticulation pourraient potentiellement être détectées et quantifiées par l’utilisation de la microscopie de génération d’harmoniques deuxième (SHGM). Surveillance SHGM signaux grâce à l’utilisation d’un laser à balayage système de microscopie couplée à une excitation infrarouge lumière source est une méthode d’imagerie moderne excitante qui jouit d’un usage répandu dans les sciences biomédicales. Par conséquent, la présente étude a été entreprise afin d’évaluer l’utilisation de la microscopie SHGM comme un moyen de mesurer a provoqué des effets réticulation dans ex vivo de sclère lapin, après une injection d’un produit chimique, agent de réticulation dans l’espace de la sub-Tenon (sT), un injection l’approche c’est une pratique courante pour causer d’anesthésie oculaire lors de procédures cliniques ophtalmologiques. Le produit chimique, agent de réticulation, hydroxyméthylglycinate de sodium (SMG), provient d’une classe de conservateurs cosmétiques appelée formaldéhyde libérant des agents (FAR). Sclérales changements après réaction avec SMG a entraîné une augmentation dans les signaux de la SHG et en corrélation avec des changements dans la température de dénaturation thermique, une méthode standard pour évaluer induite tissu effets de réticulation.

Température de dénaturation thermique (Tm) comme une méthode d’essai pour évaluer TXL réticulation effet : Un total de 16 paires d’yeux de lapin ont été utilisées dans ces expériences pour la procédure TXL. Dans une première partie de cette étude, la localisation de réticulation effet induit par une seule injection de l’agent de réticulation SMG via sT espace dans la tête de lapin provenant de cadavres a été évaluée. Ce type d’expérience depuis présentant un intérêt pour ...

Ce protocole décrit les techniques d’évaluation de réticulation chimique de la sclérotique de lapin à l’aide de l’imagerie de la génération de seconde harmonique et calorimétrie différentielle à balayage.

Deuxième génération d’harmoniques signaux dans la sclérotique de lapin comme un outil pour l’évaluation des thérapeutiques tissulaires réticulation (TXL) pour la myopie

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy ...

L’objectif général de ce protocole est de démontrer l’utilisation de la microscopie à génération de seconde harmonique pour visualiser et mesurer l’effet de réticulation du collagène dans le tissu scléral, tel qu’induit par l’injection d’agent libérant du formaldéhyde par sous-ténon, et tel que confirmé par la calorimétrie différentielle à balayage. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la réticulation des tissus thérapeutiques en fournissant une méthode non invasive pour évaluer les effets de réticulation induits. Le principal avantage de cette technique est que les signaux générés par la seconde harmonique sont très spécifiques aux fibrilles de collage et, en tant que tel, aucune préparation tissulaire spéciale, telle que la coloration des anticorps, n’est requise.Nous avons eu cette idée pour la première fois de cette méthode lorsque nous avons lu sur la procédure appliquée à la réticulation thérapeutique du tissu cornéen. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car la microscopie à génération de seconde harmonique réussie nécessite un placement minutieux du tissu et la mise en place de conditions d’imagerie correctes pour prévenir les lésions tissulaires et les artefacts dans la mesure du signal. Commencez le traitement par l’injection d’un sous-tenon dans les globes oculaires du lapin comme décrit dans le protocole textuel.Le graphique ci-dessous est une représentation schématique du site d’injection du sous-ténon. Choisissez un spéculum de taille optimale en fonction de la taille de l’œil. Après trois heures et demie d’incubation, rétractez les paupières à l’aide du spéculum des paupières pour optimiser l’accès au globe.Séparez la conjonctive entourant le limbe et coupez les muscles oculaires extra-oculaires à leurs sites d’insertion sclérale. Coupez la partie supérieure de la sclérotique à l’aide de ciseaux ou d’une lame pour créer une zone d’un centimètre par centimètre avec le site d’injection situé au centre. Grattez les couches rétiniennes et choroïdes restantes et lavez-les deux fois avec du PBS frais, en laissant à chaque fois les morceaux en solution pendant environ 10 secondes.Placez le tissu dans des tubes d’un millilitre remplis de solution PBS pour le transport vers l’installation d’imagerie. Pour maximiser le signal et la résolution lors de la microscopie SHG, utilisez une lentille d’objectif optimisée pour transmettre la lumière infrarouge et avec une ouverture numérique élevée. Ajustez le collier de correction de l’objectif en fonction de la profondeur de l’échantillon.Dans ce cas, 0,17 millimètre. Montez l’objectif 25 fois sur le microscope et ajoutez une quantité généreuse de gel d’immersion à base d’eau pour couvrir la surface de l’objectif. Il est important d’effectuer l’imagerie tissulaire dans les 30 minutes suivant le montage de l’échantillon sur le microscope afin de maintenir le tissu hydraté et d’éviter le dessèchement du gel d’immersion entre l’objectif de la lentille et la lame, car cela entraînerait des modifications du signal SHG.Assemblez la chambre cellulaire en plaçant une lamelle ronde de 25 millimètres sur la partie inférieure de la chambre. Placez le morceau de tissu de la sclérotique sur la lamelle et ajoutez 50 à 100 microlitres de tampon. Couvrez le tissu avec une deuxième lamelle ronde et vissez la partie supérieure de la chambre sans appuyer ni aplatir le tissu.Ensuite, montez la chambre cellulaire avec l’échantillon de tissu sur la platine du microscope. Positionnez la platine et ajustez la hauteur de l’objectif de sorte que la surface inférieure de l’échantillon soit nette, comme déterminé par l’inspection en champ clair à travers l’oculaire. Éteignez toutes les lumières à l’exception de l’écran de l’ordinateur et bloquez autant que possible la lumière du moniteur avec des feuilles de papier d’aluminium drapées sur la platine du microscope.Dans le logiciel, désactivez le mode Eye Port. Dans le panneau TI Pad, vérifiez que la définition de l’objectif est correcte. Dans le panneau A1 Compact Graphical User Interface, choisissez le laser infrarouge pour l’imagerie, sélectionnez les détecteurs non désançonnés et choisissez le canal DAPI équipé d’un filtre passe-bande de 400 à 450 nanomètres.Dans le panneau A1 Multi Photon Graphical User Interface, réglez la longueur d’onde du laser infrarouge sur 860 nanomètres et ouvrez l’obturateur. Attendez que la longueur d’onde d’émission soit modifiée comme indiqué par le voyant vert fixe. Pour définir les conditions de balayage laser dans le panneau A1 Compact Graphical User Interface, sélectionnez le scanner Galvano, le balayage directionnel unitaire, une taille d’image de 1024 x 1024 pixels, un temps de séjour des pixels de 6,2 microsecondes et une moyenne de ligne de 2X.Ensuite, activez l’imagerie en direct avec le mode de recherche et définissez les conditions d’imagination dans le panneau de l’interface utilisateur graphique compacte AI en ajustant la puissance du laser et le gain du détecteur. Réglez la puissance laser entre 50 milliwatts et 150 milliwatts, c’est-à-dire entre deux pour cent et six pour cent pour un laser à 860 nanomètres. Au-delà de cette plage, des lésions tissulaires peuvent survenir.Ouvrez le panneau Table de recherche qui affiche un histogramme des valeurs d’intensité des pixels dans l’image actuelle, et ajustez davantage le gain du détecteur dans la barre étiquetée HV pour maximiser la plage des valeurs de pixels tout en évitant la saturation. Utilisez l’échantillon avec le signal SHG le plus élevé pour trouver les paramètres de laser et de gain optimaux. Maintenez des paramètres identiques pour tous les échantillons à comparer dans une seule expérience.Cette pratique garantit qu’aucun échantillon de l’expérience ne saturera le détecteur. Pour numériser les tissus sont en mode aperçu, ouvrez l’outil de présentation XYZ. Réglez l’imagerie sur une résolution inférieure pour accélérer l’acquisition des images dans ce mode.Dans le panneau de présentation XYZ, cliquez avec le bouton droit de la souris sur la position actuelle et sélectionnez Numérisation cinq par cinq, Trois par trois ou Capture d’une seule vue. Une fois la numérisation terminée, déplacez-vous vers un nouvel emplacement en double-cliquant sur une zone en dehors de la zone de prévisualisation actuelle. Activez le mode de balayage en direct, puis faites la mise au point sur le tissu, car différentes régions du tissu peuvent avoir des positions légèrement différentes dans la direction axiale.Capturez un nouveau champ de vision cinq par cinq, trois par trois ou un seul champ de vision. Répétez ce processus jusqu’à ce qu’une grande partie du tissu ait été prévisualisée. Dans l’outil de présentation XYZ, double-cliquez sur une position où les fibres de collagène sont visibles dans tout le champ de vision afin de déplacer la scène à cet emplacement particulier.Réglez l’imagerie sur une résolution élevée, 1024 x 1024 pixels et une moyenne de ligne 2X. Activez le mode Live Find, ajustez la position de l’objectif de manière à ce que la partie inférieure soit nette, et dans le TI Pad, utilisez le Z Drive pour déplacer le plan optique de 10 micromètres au-dessus de cette couche inférieure. Acquérez une image à l’aide du bouton de capture, enregistrez l’emplacement à l’aide du bouton plus dans l’outil de révision XYZ.Double-cliquez sur un nouvel emplacement et répétez le réglage de la profondeur et le processus de capture d’image. Pour chaque morceau de tissu, capturez 10 images. Les champs de vision ne doivent pas se chevaucher, comme l’indiquent les emplacements enregistrés dans l’outil de présentation XYZ.Enfin, placez les morceaux scléraux dans un tube d’un millilitre avec PBS immédiatement après la fin de la microscopie en préparation de l’analyse calorimétrique différentielle à balayage ultérieure. Pour commencer, découpez la partie centrale de la commande et traitez la sclérotique avec des ciseaux. Séchez chaque carré scléral avec un mouchoir absorbant et posez-le à plat sur le fond d’une casserole DSC à l’aide d’une pince dentée.Avec le tissu à l’intérieur et la lèvre sertie et couverte, pesez la casserole afin d’obtenir le poids humide du tissu. Ensuite, placez l’échantillon pesé à l’endroit indiqué sur le plateau de l’échantillonneur automatique DSC. Créez une méthode à l’aide d’un logiciel de gestion d’instruments, en spécifiant le poids du tissu et exécutez l’analyse thermique en utilisant les périmètres énumérés dans le protocole texte.Une fois terminé, analysez les données de chaque échantillon en extrayant le pic de température de transition auquel la dénaturation thermique se produit à l’aide du logiciel d’imagerie de l’instrument. Des images SHG de sclérotiques ont été analysées aux Fidji pour la luminosité moyenne des pixels. Lorsqu’une image est ouverte et que le menu d’analyse est sélectionné suivi d’une mesure, une table avec les résultats s’ouvre contenant la luminosité moyenne du signal.Sinon, dans le menu Analyser, l’option Histogramme est sélectionnée pour créer un histogramme des valeurs d’intensité des pixels qui contient des informations sur la luminosité moyenne et la variation du signal dans l’image. Cette mesure a été répétée pour toutes les images des échantillons de contrôle et réticulés. Des images SHG représentatives de la sclérotique avec l’analyse de l’histogramme qui l’accompagne, y compris la luminosité moyenne, sont présentées ici.L’échantillon témoin est caractérisé par une disposition ondulée des fibrilles. Voici un échantillon réticulé avec un SMG de 400 millimolaires avec une intensité de pixel accrue, révélant des fibres de collagène qui semblent plus droites. Les résultats de l’analyse thermique montrent le pic de température de dénaturation plus élevé et confirment l’effet de réticulation.L’échantillon témoin et une courbe de dénaturation de l’échantillon réticulé de 400 millimolaires sont présentés. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation d’un échantillon réticulé et de la réalisation de la microscopie SHG sur des échantillons scléraux. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode ont du mal à obtenir une injection précise dans l’espace sous-tenon, en extrayant chirurgicalement le carré autour du site d’injection et en réglant les conditions des images pour scanner le tissu en mode de prévisualisation.Suite à cette procédure, d’autres méthodes, comme l’autoluorescence, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que l’analyse de l’élastine incluant la quantification et la morphologie. Les implications de cette technique d’administration d’agent de réticulation s’étendent au traitement de la myopie élevée et du staphylome postérieur, car elle facilite l’accès au pôle postérieur dans le but de stabiliser le scléral. Les implications de cette technique de microscopie s’étendent aux diagnostics de myopie élevée et de complications causées par l’affaiblissement du collagène en mesurant l’état de réticulation du collagène dans la sclérotique malade, ou en mesurant le résultat une fois la procédure de réticulation souhaitée terminée.Ainsi, cette méthode de réticulation et la microscopie à génération de seconde harmonique peuvent fournir un aperçu de la réticulation sclérale, elle peut également être appliquée à d’autres tissus tels que la cornée, la peau, le cartilage, les tendons, les valves cardiaques et les vaisseaux sanguins.

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