Deuxième génération d’harmoniques signaux dans la sclérotique de lapin comme un outil pour l’évaluation des thérapeutiques tissulaires réticulation (TXL) pour la myopie

L’objectif général de ce protocole est de démontrer l’utilisation de la microscopie à génération de seconde harmonique pour visualiser et mesurer l’effet de réticulation du collagène dans le tissu scléral, tel qu’induit par l’injection d’agent libérant du formaldéhyde par sous-ténon, et tel que confirmé par la calorimétrie différentielle à balayage. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la réticulation des tissus thérapeutiques en fournissant une méthode non invasive pour évaluer les effets de réticulation induits. Le principal avantage de cette technique est que les signaux générés par la seconde harmonique sont très spécifiques aux fibrilles de collage et, en tant que tel, aucune préparation tissulaire spéciale, telle que la coloration des anticorps, n’est requise.

Nous avons eu cette idée pour la première fois de cette méthode lorsque nous avons lu sur la procédure appliquée à la réticulation thérapeutique du tissu cornéen. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car la microscopie à génération de seconde harmonique réussie nécessite un placement minutieux du tissu et la mise en place de conditions d’imagerie correctes pour prévenir les lésions tissulaires et les artefacts dans la mesure du signal. Commencez le traitement par l’injection d’un sous-tenon dans les globes oculaires du lapin comme décrit dans le protocole textuel.

Le graphique ci-dessous est une représentation schématique du site d’injection du sous-ténon. Choisissez un spéculum de taille optimale en fonction de la taille de l’œil. Après trois heures et demie d’incubation, rétractez les paupières à l’aide du spéculum des paupières pour optimiser l’accès au globe.

Séparez la conjonctive entourant le limbe et coupez les muscles oculaires extra-oculaires à leurs sites d’insertion sclérale. Coupez la partie supérieure de la sclérotique à l’aide de ciseaux ou d’une lame pour créer une zone d’un centimètre par centimètre avec le site d’injection situé au centre. Grattez les couches rétiniennes et choroïdes restantes et lavez-les deux fois avec du PBS frais, en laissant à chaque fois les morceaux en solution pendant environ 10 secondes.

Placez le tissu dans des tubes d’un millilitre remplis de solution PBS pour le transport vers l’installation d’imagerie. Pour maximiser le signal et la résolution lors de la microscopie SHG, utilisez une lentille d’objectif optimisée pour transmettre la lumière infrarouge et avec une ouverture numérique élevée. Ajustez le collier de correction de l’objectif en fonction de la profondeur de l’échantillon.

Dans ce cas, 0,17 millimètre. Montez l’objectif 25 fois sur le microscope et ajoutez une quantité généreuse de gel d’immersion à base d’eau pour couvrir la surface de l’objectif. Il est important d’effectuer l’imagerie tissulaire dans les 30 minutes suivant le montage de l’échantillon sur le microscope afin de maintenir le tissu hydraté et d’éviter le dessèchement du gel d’immersion entre l’objectif de la lentille et la lame, car cela entraînerait des modifications du signal SHG.

Assemblez la chambre cellulaire en plaçant une lamelle ronde de 25 millimètres sur la partie inférieure de la chambre. Placez le morceau de tissu de la sclérotique sur la lamelle et ajoutez 50 à 100 microlitres de tampon. Couvrez le tissu avec une deuxième lamelle ronde et vissez la partie supérieure de la chambre sans appuyer ni aplatir le tissu.

Ensuite, montez la chambre cellulaire avec l’échantillon de tissu sur la platine du microscope. Positionnez la platine et ajustez la hauteur de l’objectif de sorte que la surface inférieure de l’échantillon soit nette, comme déterminé par l’inspection en champ clair à travers l’oculaire. Éteignez toutes les lumières à l’exception de l’écran de l’ordinateur et bloquez autant que possible la lumière du moniteur avec des feuilles de papier d’aluminium drapées sur la platine du microscope.

Dans le logiciel, désactivez le mode Eye Port. Dans le panneau TI Pad, vérifiez que la définition de l’objectif est correcte. Dans le panneau A1 Compact Graphical User Interface, choisissez le laser infrarouge pour l’imagerie, sélectionnez les détecteurs non désançonnés et choisissez le canal DAPI équipé d’un filtre passe-bande de 400 à 450 nanomètres.

Dans le panneau A1 Multi Photon Graphical User Interface, réglez la longueur d’onde du laser infrarouge sur 860 nanomètres et ouvrez l’obturateur. Attendez que la longueur d’onde d’émission soit modifiée comme indiqué par le voyant vert fixe. Pour définir les conditions de balayage laser dans le panneau A1 Compact Graphical User Interface, sélectionnez le scanner Galvano, le balayage directionnel unitaire, une taille d’image de 1024 x 1024 pixels, un temps de séjour des pixels de 6,2 microsecondes et une moyenne de ligne de 2X.

Ensuite, activez l’imagerie en direct avec le mode de recherche et définissez les conditions d’imagination dans le panneau de l’interface utilisateur graphique compacte AI en ajustant la puissance du laser et le gain du détecteur. Réglez la puissance laser entre 50 milliwatts et 150 milliwatts, c’est-à-dire entre deux pour cent et six pour cent pour un laser à 860 nanomètres. Au-delà de cette plage, des lésions tissulaires peuvent survenir.

Ouvrez le panneau Table de recherche qui affiche un histogramme des valeurs d’intensité des pixels dans l’image actuelle, et ajustez davantage le gain du détecteur dans la barre étiquetée HV pour maximiser la plage des valeurs de pixels tout en évitant la saturation. Utilisez l’échantillon avec le signal SHG le plus élevé pour trouver les paramètres de laser et de gain optimaux. Maintenez des paramètres identiques pour tous les échantillons à comparer dans une seule expérience.

Cette pratique garantit qu’aucun échantillon de l’expérience ne saturera le détecteur. Pour numériser les tissus sont en mode aperçu, ouvrez l’outil de présentation XYZ. Réglez l’imagerie sur une résolution inférieure pour accélérer l’acquisition des images dans ce mode.

Dans le panneau de présentation XYZ, cliquez avec le bouton droit de la souris sur la position actuelle et sélectionnez Numérisation cinq par cinq, Trois par trois ou Capture d’une seule vue. Une fois la numérisation terminée, déplacez-vous vers un nouvel emplacement en double-cliquant sur une zone en dehors de la zone de prévisualisation actuelle. Activez le mode de balayage en direct, puis faites la mise au point sur le tissu, car différentes régions du tissu peuvent avoir des positions légèrement différentes dans la direction axiale.

Capturez un nouveau champ de vision cinq par cinq, trois par trois ou un seul champ de vision. Répétez ce processus jusqu’à ce qu’une grande partie du tissu ait été prévisualisée. Dans l’outil de présentation XYZ, double-cliquez sur une position où les fibres de collagène sont visibles dans tout le champ de vision afin de déplacer la scène à cet emplacement particulier.

Réglez l’imagerie sur une résolution élevée, 1024 x 1024 pixels et une moyenne de ligne 2X. Activez le mode Live Find, ajustez la position de l’objectif de manière à ce que la partie inférieure soit nette, et dans le TI Pad, utilisez le Z Drive pour déplacer le plan optique de 10 micromètres au-dessus de cette couche inférieure. Acquérez une image à l’aide du bouton de capture, enregistrez l’emplacement à l’aide du bouton plus dans l’outil de révision XYZ.

Double-cliquez sur un nouvel emplacement et répétez le réglage de la profondeur et le processus de capture d’image. Pour chaque morceau de tissu, capturez 10 images. Les champs de vision ne doivent pas se chevaucher, comme l’indiquent les emplacements enregistrés dans l’outil de présentation XYZ.

Enfin, placez les morceaux scléraux dans un tube d’un millilitre avec PBS immédiatement après la fin de la microscopie en préparation de l’analyse calorimétrique différentielle à balayage ultérieure. Pour commencer, découpez la partie centrale de la commande et traitez la sclérotique avec des ciseaux. Séchez chaque carré scléral avec un mouchoir absorbant et posez-le à plat sur le fond d’une casserole DSC à l’aide d’une pince dentée.

Avec le tissu à l’intérieur et la lèvre sertie et couverte, pesez la casserole afin d’obtenir le poids humide du tissu. Ensuite, placez l’échantillon pesé à l’endroit indiqué sur le plateau de l’échantillonneur automatique DSC. Créez une méthode à l’aide d’un logiciel de gestion d’instruments, en spécifiant le poids du tissu et exécutez l’analyse thermique en utilisant les périmètres énumérés dans le protocole texte.

Une fois terminé, analysez les données de chaque échantillon en extrayant le pic de température de transition auquel la dénaturation thermique se produit à l’aide du logiciel d’imagerie de l’instrument. Des images SHG de sclérotiques ont été analysées aux Fidji pour la luminosité moyenne des pixels. Lorsqu’une image est ouverte et que le menu d’analyse est sélectionné suivi d’une mesure, une table avec les résultats s’ouvre contenant la luminosité moyenne du signal.

Sinon, dans le menu Analyser, l’option Histogramme est sélectionnée pour créer un histogramme des valeurs d’intensité des pixels qui contient des informations sur la luminosité moyenne et la variation du signal dans l’image. Cette mesure a été répétée pour toutes les images des échantillons de contrôle et réticulés. Des images SHG représentatives de la sclérotique avec l’analyse de l’histogramme qui l’accompagne, y compris la luminosité moyenne, sont présentées ici.

L’échantillon témoin est caractérisé par une disposition ondulée des fibrilles. Voici un échantillon réticulé avec un SMG de 400 millimolaires avec une intensité de pixel accrue, révélant des fibres de collagène qui semblent plus droites. Les résultats de l’analyse thermique montrent le pic de température de dénaturation plus élevé et confirment l’effet de réticulation.

L’échantillon témoin et une courbe de dénaturation de l’échantillon réticulé de 400 millimolaires sont présentés. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation d’un échantillon réticulé et de la réalisation de la microscopie SHG sur des échantillons scléraux. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode ont du mal à obtenir une injection précise dans l’espace sous-tenon, en extrayant chirurgicalement le carré autour du site d’injection et en réglant les conditions des images pour scanner le tissu en mode de prévisualisation.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes, comme l’autoluorescence, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que l’analyse de l’élastine incluant la quantification et la morphologie. Les implications de cette technique d’administration d’agent de réticulation s’étendent au traitement de la myopie élevée et du staphylome postérieur, car elle facilite l’accès au pôle postérieur dans le but de stabiliser le scléral. Les implications de cette technique de microscopie s’étendent aux diagnostics de myopie élevée et de complications causées par l’affaiblissement du collagène en mesurant l’état de réticulation du collagène dans la sclérotique malade, ou en mesurant le résultat une fois la procédure de réticulation souhaitée terminée.

Ainsi, cette méthode de réticulation et la microscopie à génération de seconde harmonique peuvent fournir un aperçu de la réticulation sclérale, elle peut également être appliquée à d’autres tissus tels que la cornée, la peau, le cartilage, les tendons, les valves cardiaques et les vaisseaux sanguins.