Évaluation de la perméabilité de la barrière hémato - encéphalique par perfusion intraveineuse d’albumine marquée FITC dans un modèle murin de la maladie neurodégénérative

Dans cette étude, nous présentons une procédure simple et efficace pour l’évaluation de la rupture de la barrière hémato - encéphalique au titre de maladies neurodégénératives. Pour atteindre notre objectif, nous avons infusé de haut poids moléculaire isothiocyanate de fluorescéine étiqueté (FITC)-albumine dans la jugulaire de souris de la veine et évalué sa fuite dans le parenchyme du cerveau par microscopie à fluorescence.

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique dans un modèle murin de maladie dégénérative par injection intrajugulaire d’albumine marquée au FITC. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés de l’étude de l’homéostasie cérébrale. Il peut être particulièrement utile d’étudier tout lien possible entre les lésions de la barrière hémato-encéphalique et la neurodégénérescence.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle est rapide et facile à réaliser et qu’elle peut également être appliquée à des modèles animaux plus grands et à d’autres contextes neuropathologiques. Luca Capocci démontrera l’intervention chirurgicale de l’injection intrajugulaire de FITC-albumen. Salvatore Castaldo fera la démonstration de la section histologique d’un cerveau.

Et Enrico Amico fera la démonstration de la procédure d’acquisition de micrographies. Commencez par préparer une solution de FITC-albumen en dissolvant la poudre de FITC-albumen dans une solution saline tamponnée au phosphate à raison de 10 milligrammes par millilitre. Disposez les instruments chirurgicaux autoclavés.

Nettoyez le banc d’opération avec de l’éthanol à 70 % et placez un champ chirurgical stérile jetable. Installez ensuite le stéréomicroscope en fonctionnement. Après avoir anesthésié la souris avec une injection intrapéritonéale d’une dose appropriée de solution de kétamine xylazine, surveillez la sédation de l’animal en donnant un léger pincement des orteils et en vous assurant de l’absence de réflexe de retrait.

Placez la souris anesthésiée en position couchée face vers le haut et fixez les quatre pattes et la queue sur l’établi chirurgical avec du ruban adhésif. Une fois la souris sécurisée, rasez soigneusement la marge chirurgicale appropriée sur le cou et désinfectez-la avec une solution de povidone iodée dans de l’éthanol à 70 %. Séchez la surface rasée exposée avec des cotons-tiges.

Ensuite, après avoir pratiqué une incision longitudinale de 1,5 centimètre de long dans la ligne médiane de la clavicule, en commençant à mi-chemin sur le thorax et en s’étendant jusqu’à juste en dessous du cou, étirez soigneusement le tissu conjonctif avec une pince sous observation microscopique pour exposer la veine jugulaire externe. Assurez-vous d’un espace suffisant à droite et à gauche de la veine jugulaire pour faciliter l’insertion de l’aiguille de calibre 30 et demi pour la perfusion de la solution FITC-albumen. Injectez 100 microlitres de 10 milligrammes par millilitre d’albumen FITC dans la veine jugulaire droite pendant trois minutes.

Il s’agit de l’étape la plus critique de la procédure. Une insertion incorrecte de l’aiguille peut causer des dommages irréversibles à la paroi veineuse et compromettre l’ensemble de l’expérience. Quinze minutes après l’injection, après avoir euthanasié la souris par décapitation, retirez rapidement le cerveau du crâne et plongez-le dans un volume d’isopentane pré-refroidi, soit dix fois celui du cerveau, pendant 15 minutes.

Déplacez le cerveau congelé à l’isopentane dans un tube pré-refroidi et conservez-le dans un congélateur à 80 degrés Celsius jusqu’à la section histologique. Intégrez le cerveau congelé dans un composé à température de coupe optimale avant la section du cryostat. Coupez le cerveau en sections de 20 microns d’épaisseur à l’aide d’un cryostat et montez-les sur des lames de verre de microscope.

Effectuez la co-coloration FITC-albumine laminine en utilisant un anticorps anti-laminine spécifique, comme décrit précédemment. Couvrez les lames coulissantes avec un support de montage contenant du DAPI et laissez sécher la diapositive pendant la nuit à quatre degrés Celsius dans l’obscurité. Le lendemain, observez la coloration de fluorescence sous un microscope à fluorescence à un grossissement de 20 fois, équipé de filtres FITC et Cy3.

Allumez la lampe à fluorescence environ 10 minutes avant de l’utiliser. Allumez le microscope, l’ordinateur connecté et l’appareil photo numérique. Exécutez le logiciel d’analyse d’images.

Utilisez l’objectif approprié pour une collecte de signal et une résolution spatiale optimales et sélectionnez les filtres appropriés. Acquérez un minimum de quatre expositions couleur 24 bits par tranche de cerveau. Analysez l’intensité de fluorescence pour chaque canal, à l’aide du logiciel ImageJ disponible gratuitement.

Les micrographies à fluorescence représentatives suivantes de cryosections cérébrales montrent une distribution différentielle de l’albumine fluorescente verte dans des conditions physiologiques et pathologiques. La coloration rouge, illustrée ici, représente le marqueur vasculaire, la laminine, dans des conditions physiologiques et dans des conditions de compromission de la barrière hémato-encéphalique. Ces images fusionnées montrent la co-localisation de l’albumine fluorescente verte et de la laminine, ainsi que la coloration DAPI des noyaux dans les barrières hémato-encéphaliques intactes et compromises.

Ce graphique montre la quantification de la fluorescence verte émise par la FITC-albumine, qui est indiquée comme l’intensité de la fluorescence verte dans des conditions saines et compromises. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de préparer fraîchement chaque réactif et de prédisposer le banc d’opération. Après avoir regardé cette vidéo, vous aurez peut-être une bonne compréhension de la façon d’évaluer la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique dans un modèle animal de maladie neurodégénérative, en mesurant l’affixation de l’albumine fluorescente verte dans le parenchyme cérébral.