Une méthode de Culture Alternative pour maintenir l’hypométhylation génomique des cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de MEK inhibiteur PD0325901 et vitamine C

Nous avons décrit en détail deux protocoles de base chimique pour la culture des cellules souches embryonnaires de souris. Cette nouvelle méthode utilise des mécanismes synergiques de promouvoir l’oxydation induite par le Tet (par la vitamine C) et réprimant la synthèse de novo de la 5-méthylcytosine (par PD0325901) pour maintenir l’hypométhylation de l’ADN et la pluripotence des cellules souches embryonnaires de souris.

L’objectif global de ce protocole est d’utiliser les composés à petites molécules PD0325901 et la vitamine C pour maintenir un état hypométhylé et pluripotent dans les cellules souches embryonnaires de souris. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des cellules souches embryonnaires de souris cultivées FBS, telles que l’hétérogénérité de la morphologie et la déshyperméthylation. Le principal avantage de cette technique est donc que les cellules souches embryonnaires de souris sont capables de maintenir une excellente morphologie et l’état hypométhylé et indifférencié.

Après avoir préparé les plaques et les tampons, selon le protocole de texte, préchauffez les cellules ES de souris, le milieu de culture, la trypsine et le PBS dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Pour passer les cellules, aspirez le milieu de la boîte et utilisez deux millilitres de PBS pour rincer les cellules deux fois. Ensuite, retirez le PBS et ajoutez 0,3 millilitre de trypson EDTA dans les cellules et inclinez rapidement la boîte pour couvrir les cellules dans la solution.

Retirez immédiatement la trypsine et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant une minute pour détacher les cellules. Ajoutez deux millilitres de milieu sérique préchauffé pour inactiver la trypsine et utilisez une pipette de cinq millilitres pour remettre en suspension les colonies cellulaires 10 fois dans une suspension unicellulaire. Versez 150 microlitres de solution cellulaire dans une nouvelle boîte de six centimètres recouverte de gélatine et complétez avec trois millilitres de milieu VCPD0325901 fraîchement préparé.

Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de CO2. En raison de l’instabilité de Vc, toutes les 24 heures pendant l’incubation, retirez l’ancien milieu de culture et ajoutez trois millilitres de milieu frais Vcpd0325901. Après avoir atteint 70 à 80 % de confluence, passez les cellules et continuez à les cultiver comme nous venons de le démontrer.

Pour effectuer l’extraction de l’ADN, prélevez les cellules avec de la trypsine comme démontré précédemment et utilisez un kit de purification d’ADN génomique en suivant les instructions du fabricant. Ajoutez 100 microlitres d’eau ultra pure dans le tube d’ADN et dissolvez l’ADN en pipetant environ 15 fois. Ensuite, à l’aide d’un spectrophotomètre, mesurez le rapport Od260 à 280 afin de déterminer la concentration et la qualité de l’ADN.

La concentration d’ADN doit être d’environ 500 nonogrammes par microlitre. Ensuite, digérez cinq microgrammes d’ADN en le combinant avec cinq microlitres de chlorhydrate de tris PH7.6 de 100 millimolaires, deux unités de phosphatase intestinale de veau, une unité de Dnase un et 0,005 unité de venin de serpent, phosphodyestérase un. Ensuite, utilisez de l’eau ultra pure pour porter le volume à 50 microlitres.

Incuber la réaction à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, prélever l’échantillon par centrifugation à 1 000xg à température ambiante pendant une minute. Transférez ensuite la solution dans des tubes d’ultrafiltration et faites tourner les échantillons à 13 000xg et 4 degrés Celsius pendant 30 minutes pour éliminer les enzymes de digestion.

Pour préparer les échantillons à l’analyse 5HMC, transférez 36 microlitres du filtrat dans un nouveau tube d’un millilitre et ajoutez quatre microlitres de D35HMC pour une concentration finale de trois nanomolaires. Pour l’analyse 5MC, placez 196 microlitres d’eau ultra-pure dans un nouveau tube à centrifuger et ajoutez quatre microlitres de filtrat en raison de la haute densité de 5MC dans l’ADN génomique. Transférez 36 microlitres de la solution diluée de 5MC dans un nouveau tube à centrifuger et ajoutez quatre microlitres de D35MC pour une concentration finale de 50 nanomolaires.

Utilisez le D35HMC et le D35MC comme étalons internes pour étalonner respectivement le 5HMC et le 5MC. Après avoir configuré les paramètres d’analyse 5MC et 5HMC dans le logiciel UHPLCMS, conformément au protocole texte, établissez les paramètres pour QQQMSMS en cliquant sur MS QQQ. Pour le temps d’arrêt, choisissez Aucune limite/Comme pompe.

Pour source d’ions, choisissez ESI. Pour le filtrage temporel, cochez Peak width (Largeur du pic) et entrez 0.07 minutes. Pour configurer les segments de temps, pour l’heure de début, choisissez zéro.

Pour définir le mode de balayage dans MRM afin d’analyser l’allusion de la colonne, pour le type de balayage, choisissez MRM. Pour Valeur Div, choisissez À MS. Pour Delta EMV plus, entrez 200 et pour Delta EMV moins, entrez zéro. Configurez les paramètres de surveillance des transitions en cliquant d’abord sur MSQQQ une acquisition.

Pour définir les segments de balayage, pour Attente, entrez 90. Pour régler les tensions de fragment pour le fragmenteur, entrez 90. Pour Collision Energy, entrez cinq.

Pour la tension de l’accélérateur de cellules, entrez quatre. Pour régler le mode d’ions positifs, pour Polarité, choisissez positif. Pour effectuer la séparation UHPLC des mononucléosides, préparez les solutions a et b pour l’allusion du 5MC et de la cytosine en mélangeant 500 millilitres d’eau ultra pure avec 500 microlitres d’acide formique pour la solution a.

Mesurez ensuite 500 millilitres de méthanol à 100 % et la solution b. Mélangez la solution a et la solution b à un rapport volume-volume de 95 à cinq comme la phase mobile pour éluer 5MC et C. Réglez ensuite le débit à 0,25 millilitres par minute. Séparez 5HMC à l’aide d’une allusion de dégradé optimisée.

Réglez ensuite le débit à 0,25 millilitre par minute. Surveillez les transitions pour 5MC, D35MC, DC, 5HMC et D35HMC. Réglez les tensions capillaires à 3 500 volts.

Réglez ensuite le volume d’injection sur 5 microlitres et analysez chaque échantillon trois fois. Utilisez les courbes standard correspondantes pour évaluer la quantité de 5MC et 5HMC selon le protocole de texte. Comme le montre cette analyse de l’ADN génomique dans les cellules ES de souris par UHPLC MSMS, le traitement VcPD0325901 a entraîné un déclin plus rapide de la méthylation de l’ADN et a atteint cinq niveaux de MC constants après cinq jours, tandis que le traitement Vc 2i a entraîné un niveau comparable au 11e jour.

Ce graphique montre que le traitement contenant du Vc a considérablement augmenté la fréquence des 5HMC après un jour et par la suite, les niveaux de 5HMC ont progressivement diminué en raison d’une réduction progressive du substrat 5MC. L’analyse par transfert Western a montré que Prdm14 était significativement élevé, tandis que Dnmt3b et son cofacteur, Dnmt3l, étaient considérablement régulés à la baisse lorsque les cellules se retiraient avec PD0325901, indiquant l’action de PD0325901 dans l’effacement de 5MC. Dans cet essai de phosphatase alcaline, les cellules ES de souris étaient toutes colorées en violet avec une morphologie en forme de boule lorsqu’elles ont été cultivées pendant 26 jours dans VcPD032590, indiquant un état indifférencié.

En revanche, les cellules cultivées dans le FBS contenant uniquement du milieu semblaient de couleur claire, avec un étalement partiel indiquant une différenciation partielle. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq heures si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que FBS doit être pré-sélectionné.

Évitez également de trop pipeter les cellules dans le passage et de changer quotidiennement le milieu de culture VcPDO325901. Après ce développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la culture de cellules ES de souris in vitro pour explorer le développement et les processus d’embryons in vitro et les cellules générées d’importance médicale pour la médecine régénérative. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une meilleure compréhension de la façon de maintenir la morphologie de croissance et l’état hyperméthylé et puissant pluriel pour les cellules ES de souris en utilisant deux petits composants moléculaires, l’inhibiteur de MEK, PD0325901.

N’oubliez pas que travailler avec Trisol, DMS ou PMS et le DTT peut être extrêmement dangereux et que les précautions telles que le port de gants, d’un masque et de lunettes doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.