Flux de travail basé sur la combinaison de traceur isotopique des expériences pour étudier le métabolisme microbien de multiples Sources d’éléments nutritifs

L’objectif général de cette procédure est d’étudier quantitativement le métabolisme de plusieurs sources de nutriments à l’aide de substrats étiquetés. Ce flux de travail permet de déterminer le devenir des nutriments consommés et l’origine métabolique des composés synthétisés par les levures. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du métabolisme microbien, telles que la façon dont tout le métabolisme fonctionne en fonction des conditions environnementales.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’élucidation et la quantification de la distribution des protéines ou des nutriments à partir de sources multiples. Cette méthode a été utilisée pour étudier le métabolisme de l’azote de la levure, mais elle peut également être appliquée à d’autres métabolismes et micro-organismes. La clé du succès de cette expérience réside dans la reproductibilité des fermentations.

Les utilisateurs doivent porter une attention particulière à collecter les cellules dans le même stade physiologique défini. La démonstration de la procédure sera assurée par Christian Picou de notre équipe technique, Pauline Seguinot, doctorante du laboratoire, et Stéphanie Rollero, post-doctorante. Dans un autoclave, pasteuriser chaque milieu synthétique préparé pour chaque source d’azote dans une fiole d’un litre contenant un barreau d’agitation magnétique.

Dissoudre la quantité appropriée de molécule marquée pour atteindre la concentration finale souhaitée dans le milieu. Stérilisez le milieu à l’aide d’un système de filtration sous vide jetable. À l’aide d’un cylindre doseur stérile, répartissez le milieu entre deux fermenteurs pré-stérilisés qui contiennent une barre d’agitation magnétique et sont équipés de verrous de fermentation pour éviter l’entrée d’oxygène mais permettre la libération de dioxyde de carbone.

Après avoir cultivé une souche cerevisiae dans un milieu YPD, prélever une aliquote de pré-culture sous flux laminaire et quantifier la population cellulaire à l’aide d’un compteur de particules électronique équipé d’une ouverture de 100 micromètres. Après centrifugation de la pré-culture, suspendre la pastille dans un volume approprié d’eau stérile pour obtenir une concentration finale de 2,5 fois 10 à la 9ème cellules par millilitre. Ensuite, inoculez chaque fermenteur avec un millilitre de suspension cellulaire.

Ensuite, préparez une plate-forme de fermentation en installant les fermenteurs dans les guides de support qui sont correctement placés sur les plaques d’agitation à 21 positions et réglez la vitesse d’agitation à 270 tr/min. Pour lancer le suivi en ligne de chaque fermentation, lancez l’application de contrôle du robot, cliquez sur le bouton Démarrer l’essai et sélectionnez le volume de fermentation à effectuer. Pour vous assurer que l’interface affichée permet d’indiquer le nombre et la position des fermenteurs sur la plate-forme, cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’emplacement de la fente et choisissez Désactiver pour désactiver la surveillance des positions vides.

Pour initialiser le logiciel de calcul, cliquez sur le bouton Initialiseur et validez avec OK. Ensuite, cliquez sur le bouton Démarrer de l’application de contrôle du robot pour lancer les acquisitions de poids. Ensuite, centrifugez deux échantillons de six millilitres prélevés dans les fermenteurs à 2 000 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Une fois terminé, transférez chaque surnageant congelé dans deux tubes et conservez-le à moins 80 degrés Celsius.

Lavez chaque pastille deux fois avec cinq millilitres d’eau distillée et conservez-la à moins 80 degrés Celsius pour la mesure de l’enrichissement isotopique. Ajoutez 200 microlitres d’une solution d’acide sulfosalicylique à 25 % contenant 2,5 millimolaires de norleucine comme étalon interne à 800 microlitres d’échantillon pour éliminer les molécules de poids moléculaire élevé. Après l’incubation et la centrifugation, filtrez le mélange à travers une membrane de nitrocellulose de 0,22 micromètre et placez l’échantillon dans un système d’analyse d’acides aminés.

Dans le programme ou le logiciel du système d’analyse, cliquez sur le bouton Exécuter pour commencer les analyses de chromatographie liquide avec l’analyseur équipé d’une colonne d’échange cationique. Ensuite, préparez un extrait oxydé en suspendant une pastille cellulaire préalablement préparée dans 200 microlitres d’acide performique. Après avoir incubé pendant quatre heures à quatre degrés Celsius, arrêtez la réaction en ajoutant 33,6 milligrammes de sulfate de sodium.

Ajoutez 800 microlitres de six acides chlorhydriques normaux à l’extrait oxydé et incubez l’échantillon dans un tube de verre hermétiquement fermé pendant 16 heures à 110 degrés Celsius dans un four à chaleur sèche. Après avoir laissé l’échantillon refroidir à température ambiante, ajoutez 200 microlitres de neuroleucine de 2,5 millimolaires et retirez le chlorure d’hydrogène gazeux avec un flux d’azote. Lavez l’extrait séché deux fois avec 800 microlitres d’eau distillée, puis 800 microlitres d’éthanol.

Ensuite, ajoutez 800 microlitres de tampon d’acétate de lithium de 200 millimolaires à l’extrait. Déterminer les concentrations relatives d’acides aminés dans les protéines de l’échantillon à l’aide de la méthode chromatographique décrite précédemment. Hydrolysez une pastille cellulaire marquée en ajoutant 1,2 millilitre d’acide chlorhydrique à six molaires et en incubant l’échantillon pendant 16 heures à 105 degrés Celsius dans un tube de verre hermétiquement fermé dans un four à chaleur sèche.

Après avoir laissé l’échantillon refroidir à température ambiante, ajoutez 1,2 millilitre d’eau distillée. Après la centrifugation pour éliminer les débris cellulaires, répartissez le surnageant en six fractions de 400 microlitres dans des tubes de verre ouverts. Faites sécher les fractions dans le four à chaleur sèche à 105 degrés Celsius pendant quatre à cinq heures jusqu’à ce qu’elles atteignent la consistance d’un sirop.

Lors de l’hydrolyse de la biomasse, sécher la fraction jusqu’à la consistance d’un sirop en contrôlant fréquemment l’acide de fonctionnement. Pour la dérivation de l’ECF, dissoudre l’hydrolysat séché refroidi dans 200 microlitres d’acide chlorhydrique de 20 millimolaires et 133 microlitres d’un mélange de pyridine et d’éthanol. Ajoutez 50 microlitres de chloroformiate d’éthyle pour dérivation des acides aminés.

Une fois que le dioxyde de carbone a été libéré, transférez le mélange dans des tubes à centrifuger contenant 500 microlitres de dichlorométhane pour extraire les composés dérivés. Agitez les échantillons pendant 10 secondes. Après une centrifugation de quatre minutes à 10 000 fois G, prélever la phase organique inférieure de chaque échantillon à l’aide d’une pipette Pasteur et la transférer dans un flacon d’échantillonneur automatique GC contenant un insert en verre conique afin que chaque échantillon puisse être injecté directement dans l’instrument GCMS.

Des réactifs de dérivation HPLC sont utilisés pour la procédure ECF. Changez fréquemment les réactifs ECF. Pour la dérivation du DMF-DMA, dissoudre l’hydrolysat séché dans 50 microlitres de méthanol et 200 microlitres d’acétonitrile.

Ajoutez 300 microlitres de DMF-DMA et vortex l’échantillon. Ensuite, transférez l’échantillon dans un flacon d’échantillonneur automatique GC contenant un insert en verre conique. Pour la dérivation de BSTFA, suspendre l’hydrolysat dans 200 microlitres d’acétonitrile.

Ajoutez 200 microlitres de BSTFA à l’échantillon et fermez hermétiquement le tube de verre. Après une incubation de quatre heures à 135 degrés Celsius, transférez l’extrait refroidi directement dans un flacon d’échantillonneur automatique GC contenant un insert en verre conique. Maintenant, analysez les échantillons avec un chromatographe en phase gazeuse équipé d’un injecteur d’échantillonneur automatique et couplé à un spectromètre de masse.

Cliquez sur Instrument dans le menu du logiciel de l’ordinateur. Sous l’onglet Séquence, cliquez sur Modifier la table de journal d’échantillons pour créer une liste d’exemples, puis cliquez sur Exécuter et Exécuter la séquence pour démarrer les injections. Une fois les analyses terminées, notez un groupe d’intensités pour chaque acide aminé qui correspond à ses différents isotopomères de masse.

Ajouter 10 microlitres des étalons internes deutérés appropriés à cinq millilitres de surnageant dans un tube de verre de 15 millilitres. Ajoutez un millilitre de dichlorométhane, fermez bien le tube et secouez l’échantillon sur une plate-forme à bascule pendant 20 minutes. Après la centrifugation, recueillir la phase organique inférieure dans un tube en verre de 15 millilitres.

Après avoir répété l’extraction au dichlorométhane, séchez l’extrait organique sur 500 milligrammes de sulfate de sodium anhydre et prélevez la phase liquide à l’aide d’une pipette Pasteur. Concentrer l’extrait par un facteur quatre sous flux d’azote. Ensuite, transférez l’échantillon concentré dans un flacon d’échantillonneur automatique GC.

Pour la quantification GCMS, injectez deux microlitres d’échantillon avec un rapport de séparation de 10 pour un, et séparez les molécules volatiles extraites en utilisant le profil de température de four approprié. À l’aide des feuilles de calcul du protocole texte, entrez les valeurs des données brutes qui correspondent à la concentration d’acides aminés extracellulaires, au poids sec des cellules, à la teneur en protéines des cellules, à la concentration des molécules volatiles et à l’enrichissement isotopique des acides aminés protéinogènes et des molécules volatiles. Un schéma du flux de travail permettant d’étudier la gestion par les levures des multiples sources d’azote présentes lors de la fermentation du vin est présenté ici.

Pour différents points d’échantillonnage, les paramètres biologiques montrent une grande reproductibilité entre les fermenations. Un aperçu de la redistribution de l’azote des sources dans le jus de raisin à tous les acides aminés protéinogènes est présenté ici. Combinée à la détermination des bilans de masse, la mesure de l’enrichissement isotopique des acides aminés protéinogènes a fourni la première quantification de la contribution de l’arginine, de la glutamine, de l’ammonium et d’autres sources d’origine azotée aux groupes amines de chacun de ces composés.

Une comparaison entre la quantité d’acide aminé consommée qui est directement récupérée dans la biomasse est illustrée ici. La répartition des acides aminés aliphatiques consommés, la leucine et la valine, dans le réseau métabolique de la levure est illustrée ici. Plus de 96 % de la valine et de la leucine consommées sont récupérées dans leurs produits de conversion.

Étonnamment, une fraction substantielle de la valine et de la leucine est catabolisée malgré un déséquilibre considérable entre la disponibilité de ces composés dans le milieu et leur contenu dans la biomasse. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq jours. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de sélectionner soigneusement la partie marquage du substrat en fonction des questions scientifiques.

Pour assurer une bonne reproductibilité biologique, effectuez la fermentation et l’analyse chromatographique en double. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs en microbiologie pour explorer comment le métabolisme et la physiologie des micro-organismes changent en fonction des conditions environnementales. N’oubliez pas que travailler avec des réactifs de dérivatisation et un solvant d’arginine peut être extrêmement dangereux, donc des précautions telles que le port de gants et le travail sous une hotte doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.