Name: Cible cellulaire pré-enrichissement et Whole Genome Amplification pour la cellule unique caractérisation en aval (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Découvrez l'isolation de cellules rares par enrichissement préalable et amplification du génome entier pour la caractérisation génétique moléculaire à cellule unique. Cette méthode permet d'analyser les cellules tumorales circulantes chez les patients atteints de cancer.

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Cette étude a été financée par le fonds autrichien de Science (FWF), projet-no. J’ai 1220-B19 (au PS) dans le cadre du projet ERA-NET en recherche translationnelle de Cancer (TRANSCAN) « Circulating tumeur des cellules comme biomarqueur de la maladie résiduelle dans le Cancer de la Prostate (CCT-SCAN) ». Candidate au doctorat S.C. a été formé dans le cadre de la médecine moléculaire de programme de doctorat de l’Université médicale de Graz. Les auteurs remercient Nina Schlögl, Daniel Kummer, Gabi Wendt, Claudia Chudak, Julia Schulz et Johanna Schiller pour leur assistance technique d’experts. Les auteurs remercient Georg Peinhaupt pour la prise en charge de la conception graphique.

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<li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+and+Molecular+Characterization+of+Tumor+Cells+in+Lung+Cancer+Patients+Using+a+Novel+In+Vivo+Device+for+Capturing+Circulating+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells.</a> Clin Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).</li>
<li>Kuske, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+detection+of+circulating+tumor+cells+in+non-metastatic+high-risk+prostate+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep-UK%22%5BJournal%5D)">Improved detection of circulating tumor cells in non-metastatic high-risk prostate cancer patients.</a> Sci Rep-UK. 6 (1), (2016).</li>
<li>van Beers, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+PCR+predictor+for+aCGH+success+of+FFPE+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">A multiplex PCR predictor for aCGH success of FFPE samples.</a> Brit J Cancer. 94 (2), 333-337 (2006).</li>
<li>El-Heliebi, A., Chen, S., Kroneis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Multiplex+PCR+for+Assessing+the+Quality+of+Whole+Genome+Amplified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using Multiplex PCR for Assessing the Quality of Whole Genome Amplified DNA.</a> Methods Mol Biol. 1347, 119-128 (2015).</li>
<li>Möhlendick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Robust+Method+to+Analyze+Copy+Number+Alterations+of+Less+than+100+kb+in+Single+Cells+Using+Oligonucleotide+Array+CGH%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Robust Method to Analyze Copy Number Alterations of Less than 100 kb in Single Cells Using Oligonucleotide Array CGH.</a> PLoS ONE. 8 (6), e67031(2013).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+and+Release%3A+rare+cell+analysis+from+a+functionalised+medical+wire%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep-UK%22%5BJournal%5D)">Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire.</a> Sci Rep-UK. 7, 43424(2017).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+and+molecular+characterization+of+circulating+tumor+cell+using+an+in+vivo+capture+system+in+squamous+cell+carcinoma+of+head+and+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enumeration and molecular characterization of circulating tumor cell using an in vivo capture system in squamous cell carcinoma of head and neck.</a> Chin J Cancer Res. 29 (3), 196-203 (2017).</li>
<li>Carter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+circulating+tumor+cells+identifies+distinct+copy-number+profiles+in+patients+with+chemosensitive+and+chemorefractory+small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of circulating tumor cells identifies distinct copy-number profiles in patients with chemosensitive and chemorefractory small-cell lung cancer.</a> Nat Med. 23 (1), 114-119 (2017).</li>
<li>Luca, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+single+circulating+tumor+cells+by+next+generation+sequencing+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of single circulating tumor cells by next generation sequencing in metastatic breast cancer.</a> Oncotarget. , (2016).</li>
<li>Aravanis, A. M., Lee, M., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-Generation+Sequencing+of+Circulating+Tumor+DNA+for+Early+Cancer+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Next-Generation Sequencing of Circulating Tumor DNA for Early Cancer Detection.</a> Cell. 168 (4), 571-574 (2017).</li>
<li>Page, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+Generation+Sequencing+of+Circulating+Cell-Free+DNA+for+Evaluating+Mutations+and+Gene+Amplification+in+Metastatic+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Next Generation Sequencing of Circulating Cell-Free DNA for Evaluating Mutations and Gene Amplification in Metastatic Breast Cancer.</a> Clin Chem. 63 (2), 532-541 (2017).</li>
<li>Kalinich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-based+signature+enables+high+specificity+detection+of+circulating+tumor+cells+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">An RNA-based signature enables high specificity detection of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma.</a> P Natl Acad Sci USA. 114 (5), 1123-1128 (2017).</li>
<li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accession+of+Tumor+Heterogeneity+by+Multiplex+Transcriptome+Profiling+of+Single+Circulating+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Accession of Tumor Heterogeneity by Multiplex Transcriptome Profiling of Single Circulating Tumor Cells.</a> Clin Chem. 62 (11), 1504-1515 (2016).</li>
<li>Sinkala, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+protein+expression+in+circulating+tumour+cells+using+microfluidic+western+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Profiling protein expression in circulating tumour cells using microfluidic western blotting.</a> Nat Commun. 8, 14622(2017).</li>
<li>Morrow, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumourigenic+non-small-cell+lung+cancer+mesenchymal+circulating+tumour+cells%3A+a+clinical+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tumourigenic non-small-cell lung cancer mesenchymal circulating tumour cells: a clinical case study.</a> Ann Oncol. 27 (6), 1155-1160 (2016).</li>
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<li>Czyż, Z. T., Stoecklein, N. H., Polzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Microdissection+of+FFPE+Tissue+Areas+and+Subsequent+Whole+Genome+Amplification+by+Ampli1TM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser Microdissection of FFPE Tissue Areas and Subsequent Whole Genome Amplification by Ampli1TM.</a> Methods Mol Biol. 1347, 141-162 (2015).</li>
<li>Czyż, Z. T., Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministic+Whole-Genome+Amplification+of+Single+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deterministic Whole-Genome Amplification of Single Cells.</a> Methods Mol Biol. 1347, 69-86 (2015).</li>
<li>Kroneis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+retrieval+of+single+microchimeric+cells+and+verification+of+identity+by+on-chip+multiplex+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Automatic retrieval of single microchimeric cells and verification of identity by on-chip multiplex PCR.</a> J Cell Mol Med. 14 (4), 954-969 (2010).</li>
<li>Kroneis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Molecular+Genetic+and+Cytogenetic+Analysis+from+Single+Cells+after+Isothermal+Whole-Genome+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Combined Molecular Genetic and Cytogenetic Analysis from Single Cells after Isothermal Whole-Genome Amplification.</a> Clin Chem. 57 (7), 1032-1041 (2011).</li>
<li>Kroneis, T., Jonasson, E., Andersson, D., Dolatabadi, S., Ståhlberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+preamplification+simplifies+targeted+mRNA+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep-UK%22%5BJournal%5D)">Global preamplification simplifies targeted mRNA quantification.</a> Sci Rep-UK. 7, 45219(2017).</li>
<li>Picelli, S., Faridani, O. R., Bjorklund, A. K., Winberg, G., Sagasser, S., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).</li>
<li>El-Heliebi, A., Heitzer, E., Kroneis, T., Chen, S., Haudum, C., Fuchs, J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-319-53661-3_12">Potential and Challenges of Liquid Biopsies.</a> Mechanisms of Molecular Carcinogenesis. 2, 233-261 (2017).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole décrit vise à récupérer des cellules du fil fonctionnalisé (dénommé périphérique) pour l’analyse génomique ex vivo unicellulaires. Nous avons testé trois lignées de cellules EpCAM-positive (HT-29, LNCaP et VCaP), mais en principe, cette méthode peut être appliquée à n’importe quelle ligne de cellules exprimant EpCAM. Cellules cibles EpCAM séropositifs peuvent être présentés à l’appareil comme suspension cellulaire pur (voir 2.1.) ou mélangé dans un surplus de cellules de fond (par exemple. périphérique sang, voir 2.2.). Considérant que surtout ce dernier peut être utilisé pour tester les capacités d’isolement dans des conditions rares cellules, un réglage fin du nombre de cellules attachées au fil peut être fait en utilisant le faible volume décrit l’approche (voir 2.3.). Comme les différences entre les lignées cellulaires sont à prévoir, la densité cellulaire appropriée pour charger le fil, rotation vitesse ainsi que le temps d’incubation doivent être testés empiriquement en évaluant le nombre de cellules attachées à l’aide d’un microscope d’immunofluorescence.
Pour les applications en aval de la génomique au niveau unicellulaire WGA, est nécessaire. La méthode WGA de choix peut-être différer entre les laboratoires et, en principe, notre méthode est ouvert à toutes les méthodes que peut gérer les échantillons obtenus de microdissection laser ou micromanipulation. Dans ce protocole, nous utilisons une méthode basée sur l’ADN enzymatiquement fragmenté en raison d’une meilleure performance par rapport à une chaleur-fragmentation selon WGA7. En option, seule les cellules peuvent être transmises à WGA isotherme permettant20,21de profilage d’ADN ultérieur.
Le protocole décrit vise à récupérer les cellules intactes après qui est attaché à une nouvelle génération de fils fonctionnalisés pour l’analyse génomique de cellule unique. La première génération des fils fonctionnalisés, qui représentent également les dispositifs d’enrichissement homologation uniquement in vivo sur le marché jusqu'à présent, ont été utilisée pour l’énumération des CTC chez les cancéreux métastasé. Les publications précédentes et nos propres données suggèrent la technique d’isolation en vivo pour être plus sensible par rapport à l’étalon-or actuelle technologie2. Ainsi, équiper cette technique d’isolation in vivo avec une fonction de récupération telle que réalisée dans le dispositif permet alliant haute récupération CCT caractérisation au niveau unicellulaire.
Cependant, l’appareil n'est pas autorisé pour l’utilisation chez les patients, par conséquent, les données cliniques ne sont pas disponibles. Ex vivo des applications (c'est-à-dire isoler CTC de sang périphérique après le prélèvement) ne sont pas recommandés car la technologie est adaptée pour les paramètres présents dans le cubital vaine, par exemple faible diamètre de la vaine (augmentation de la probabilité de un contact entre la CCC et l’anticorps de captures en direct) et les temps de rétention longue (30 min, permettant à 2 ou 3 L de sang à passer le fil). Cependant, tel qu’indiqué dans l’article 2.2. cellules cibles peuvent être également isolés dans des échantillons mixtes7.
Une limitation du courant de la méthode est la récupération inefficace des cellules non fixées après détachement des fils. Ceci, cependant, pourrait être amélioré par une étape de fixation cellulaire avant le traitement de détachement.
En résumé, ce protocole est un premier pas vers l’utilisation combinée d’une technique d’isolation en vivo avec récupération de cellules pour caractériser génétiquement les cellules individuelles. Des efforts supplémentaires doivent lever l’optimisation de la récupération de la cellule et la clairance pour son application dans les patients1,2. Cependant, la médecine personnalisée pour les décisions de surveillance et de la thérapie de traitement dépasse énumération des PTC. Ainsi, cette méthode est une première étape vers la caractérisation génomique de la CCT au niveau de la cellule unique.
Les applications vers l’analyse du transcriptome unicellulaires semblent possibles, comme les cellules intactes sont récoltés. Cependant, il reste à évaluer si la procédure de récupération a un impact sur l’intégrité du RNA (p. ex. transmission monocellules récupérés à la lyse directe, suivie de la RT-qPCR22). En cas de succès, caractérisation de cellules uniques (p. ex. , CTC) peut être déplacée au niveau transcriptome, permettant des analyses plus détaillées. À cet égard, RNA-seq en utilisant Smart-seq2 fournit un outil précieux pour l’analyse en aval de RNA des cellules simples l’ADNc préamplifié (obtenu au cours de la préparation de bibliothèque de RNA-seq) peut être soumis aux PCR quantitative. Cela permettra une cible combinée et l’analyse axée sur la projection de monocellules récupéré22,23.
Les fils fonctionnalisés actuelles reposent sur les anticorps anti-EpCAM qui est un marqueur épithélial largement utilisé pour la sélection positive de PTC24. Comme plusieurs CTC pourrait downregulate marqueurs épithéliaux comme cytokératines ou EpCAM25, l’ajout d’anticorps comme HER2/nouveau augmenterait les chances d’isolement de la CCT. Plusieurs anticorps basé enrichissement des stratégies ont été développés et examinés par Ferreira et al. en 2016,26. Un mélange d’anticorps immobilisés sur un fil pourrait être une amélioration future de la technologie menant à l’isolement d’un plus grand nombre et autres sous-types des PTC.
Il est obligatoire pour toutes les étapes impliquant le fils de manutention pour garder la partie fonctionnelle du fil immergée dans une solution pour maintenir son fonctionnement. Nous vous recommandons de placer le fil dans 1 x PBS lors de l’évaluation (microscope ; e.g. 3.1 les étapes. -3.3.) et le stockage. Afin d’éviter une coloration inappropriée, nous recommandons une solution colorante en étapes 1.2.1 fraîchement préparé. et 1.2.2. Cellules faiblement colorées entravent la cellule de comptage sur le fil et peuvent conduire à la sous-estimation des cellules attachées.
Il faut éviter de brancher la pipette Pasteur avec le capuchon en caoutchouc lorsque vous insérez le fil dans la pipette Pasteur pour chargement ultérieur de la suspension cellulaire (étape 2.3.4.). Le capuchon en caoutchouc est utilisé pour maintenir le fil en place afin que la partie fonctionnelle est située à l’intérieur de l’embout de la pipette Pasteur. Si le bouchon est trop fermement attaché à l’arrière de la pipette Pasteur, chargement de la suspension cellulaire n’est pas possible. Dans ce cas, faciliter la PAC telle que l’air qui est déplacé par la suspension de cellules chargées peut laisser la pipette.
Plier le fil est crucial pour son orientation au cours de la cellule de comptage en étapes 3.2. et 3.3. Monter les conducteurs avec le ruban adhésif tel que la fin ne fonctionne pas du fil vient de se coucher sur le côté. Après la numérisation de toute la longueur de la partie fonctionnelle, le fil est enroulé 180° alors que l’autre moitié du fil fonctionnel peut être scanné. Cette étape est importante pour les premières expériences d’évaluer le nombre de cellules sur le fil. Une fois que le nombre de cellules pour une lignée cellulaire et une procédure est évalué, la procédure peut être répétée sans cellule de comptage (e.g. seulement vérifiant la présence de cellules ou de l’omission de cette étape). Pipetage prudent est cruciale pour éviter la perte de cellules en réduisant le volume du liquide surnageant dans étape 4.8. Assurez-vous de pipetage se fait en douceur sans provoquer de turbulences au culot.

Récemment, CellCollector DC01, un fil médical fonctionnalisé avec des anticorps anti-EpCAM pour isoler la CTC de sang périphérique des patients atteints de cancer, a été ajouté à la gamme méthodique de CTC énumération1,2,3 . Dans une étude actuellement en cours dans le cancer de la prostate non métastatique, ce fil fonctionnalisé rapports presque deux fois plus de patients CTC-positifs et CCT supérieure compte chez les patients séropositifs au CCT par rapport à CellSearch, l’étalon-or dans l’énumération3 de la CCT . Grâce à cette performance encourageante, isolement des cellules d’un fil médical fonctionnalisé pour l’analyse de la cellule unique serait souhaitable, mais ni le traitement enzymatique avec des solutions de détachement cellulaire (par exemple , la trypsine) ni microdissection laser permet la récupération des cellules intactes (données non présentées).
Pour permettre le détachement des cellules capturées, une nouvelle génération de fils fonctionnalisés était équipée d’un polymère spécifique. Ce polymère, qui relie l’anticorps de capture le fil, est sensible à un traitement de tampon de sortie permettant le détachement des cellules intactes (CellCollector DC03 dénommé dispositif). Le nouveau dispositif fonctionnalisé, permet d’isoler des cellules cibles de différentes concentrations des cellules de ligne de cellules cancéreuses dopés à l’albumine sérique bovine (BSA) / tampon phosphate salin (PBS) et du sang périphérique, respectivement.
Pour faciliter la détection visuelle des cellules sur l’appareil et après récupération, les cibler les cellules cancéreuses sont étiquetés avec la carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) et une coloration de l’ADN avant le traitement de récupération (i.e. charge et de dépose). Les effets du traitement sur la qualité de l’ADN des cellules simples ont été préalablement évalués après WGA au moyen d’un contrôle de la qualité PCR4,5, CGH-array6,7 et ciblé de séquençage7 n’indiquant aucune différence par rapport aux cellules non traitées micromanipulés partir de suspensions cellulaires7. L’avantage de cette méthode réside dans la combinaison de pré-enrichissement rare de la cellule-cible et la récupération des cellules pour analyse en aval de cellule unique (Figure 1). Le périphérique actuel marqué CE en vivo collection est généralement utilisé pour le dénombrement des PTC, plutôt que pour la caractérisation moléculaire de cellules individuelles2,8. Cependant, une analyse plus complète pour étudier l’hétérogénéité entre les CTC depuis longtemps pour l’analyse au niveau des cellules individuelles (c'est-à-dire ciblées séquençage au niveau unicellulaire). Autres méthodes basées sur les cellules reposent sur isoler immunomagnetic CTC EpCAM séropositifs et manipulation cellule unique basé sur diélectrophorèse pour analyse génétique moléculaire ultérieures9,10. Caractérisation moléculaire des PTC est une condition importante pour leur mise en oeuvre utile en milieu clinique et est tout aussi importante dans la recherche fondamentale de la cascade métastatique. En parallèle de la CTC, circulation tumeur ADN (ADNct) est devenu d’une grande importance car elle permet l’analyse d’ADN du fardeau tumoral avec isolement technique minimale procédures11,12. Les approches de la cellule en fonction pourraient servir comme une contribution complémentaire car elle permet de RNA13,14 et protéine15 analyse de l’expression et également pour la CCT dérivé cell cultures ou xénogreffes16, 17. bien que des obstacles tels que la récupération de cellules faibles et autorisation pour l’utilisation chez les patients doivent encore être surmontés, la méthode de verrouillage et la lâcher prend une prochaine étape importante vers la caractérisation des cellules cibles rares.

<table><tbody><tr><td>Gilupi Release Buffer Gilupi</td><td></td><td>GIL083</td><td>Utilisé pour détacher les cellules du fil</td></tr><tr><td>McCoy’s 5A Medium (1x) suppl. avec L-Glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16600-082</td><td>Milieu de culture utilisé pour les cellules HT-29, adapter le milieu de culture à la lignée cellulaire utilisé pour les expériences</td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution (1 M)PAA</td><td></td> <td>S11-001</td><td>Supplément pour McCoy’s 5A Medium</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin Gold</td><td>PAA</td><td>A15-151</td><td>Supplément pour le milieu modifié McCoy’s 5a</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (100x)</td><td>Biowest</td><td>L0018-100</td><td>Supplément pour McCoy’s 5a Modified</td></tr><tr><td>Medium Phosphate Buffered Saline (1x PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Biowest</td><td>L0950-100</td><td>Solution de détachement cellulaire (culture cellulaire)</td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>GFL</td><td>Type 1003</td><td>Utilisé pour les solutions de préchauffage</td></tr><tr><td></td><td>Incubateur Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Utilisé pour incuber des cellules (culture cellulaire)</td></tr><tr><td>Tubes réactionnels de 50 mL</td><td>VWR</td><td>525-0403</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur à rouleaux</td><td>Stuart Scientific</td><td>SRT6D</td><td>Utilisé pour fixer les cellules au fil tout en empêchant les cellules de sédimenter</td></tr><tr><td>CellTrace CFSE Prolifération cellulaire Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34554</td><td>Utilisé pour le marquage de cellules vivantes (marquage cytoplasmique)</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>H3570</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Utilisé pour la coloration de l’ADN (contre-coloration nucléique)</td></tr><tr><td>Centrifugeuse (équipée pour contenir des tubes à réaction de 15 mL et 50 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Heraeus Megafuge 40R</td><td>Utilisé pour la granulation de cellules</td></tr><tr><td>Observer Z1 (microscope à fluorescence/microdissection laser)</td><td>Carl Zeiss Microimaging</td><td></td><td>Microscope inversé (immunofluorescence) capable de microdissection laser ; Les microscopes à fluorescence doivent être capables de détecter Hoechst 33342 (filtre DAPI) et CFSE (filtre FITC)</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td>Utilisé pour le revêtement de surfaces en verre/plastique</td></tr><tr><td>MS1 Minishaker</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z404039</td><td>Utilisé pour le vortex de</td></tr><tr><td>tubes Vacutainer EDTA (ou Na-héparine)</td><td>BD</td><td>366450 (ou 366480)</td><td>Utilisé comme tube de réaction pour la capture ex vivo de cellules cibles</td></tr><tr><td>Detektor CANCER03 DC03</td><td>Gilupi</td><td>GIL003</td><td>Fil fonctionnalisé capable d’isoler et de détacher des cellules positives EpCAM (également appelées catch& sortie, C& R)</td></tr><tr><td>Aiguilles de seringue (G20)</td><td>VWR</td><td>613-0554</td><td>Utilisées pour percer des capuchons en caoutchouc afin de permettre la partie non fonctionnelle du C& R pour le traverser</td></tr> Chambre <tr><td>Neubauer</td><td>Roth</td><td>T729.1</td><td>Utilisé pour compter les cellules</td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur 150 mm</td><td>Volac</td><td>D810</td><td>Utilisé pour l’application à faible volume de cellules sur le C& R</td></tr><tr><td>Stylo à graisse</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td>Utilisé sur des lames de verre pour maintenir en place la suspension cellulaire</td></tr><tr><td>Filtre à seringue Steril (0,2 & micro ; m)</td><td>Corning</td><td>431219</td><td>Pour filtrer les produits fraîchement préparés Gilupi Release Buffer</td></tr><tr><td>Delfia PlateShaker</td><td>Perkin Elmer</td><td>1296-003</td><td>Utilisé pour l’agitation lors du détachement</td></tr> cellulaire <tr><td>Tubes de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30,125,150</td><td></td></tr><tr><td>Ampli1 WGA</td><td>Kit Silicon Biosystems</td><td></td><td>À commander via Silicon Biosystems</td></tr><tr><td>Axiovert M200 équipé de Mikromanipulator MMJ et CellTram vario</td><td>Zeiss/Eppendorf</td><td></td><td>Utilisez la micromanipulation à portée de main</td></tr><tr><td>Microcapillaires (25 &micro ; m de diamètre), CustomTip Type I</td><td>Eppendorf</td><td>930001201</td><td>Utilisé pour la micromanipulation de cellules</td></tr><tr><td>Tubes PCR de 0,2 mL</td><td>Biozym</td><td>710920</td><td></td></tr><tr><td>Cytocentrifugeuse et équipement</td><td>Hettich</td><td>Universal 32</td><td>Utiliser la cytocentrifugeuse à portée de main Thermocycleur</td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>DNA Engine Dyad</td><td>Chaque thermocycleur avec couvercle chauffant peut être utilisé</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>Roth</td><td>CX73.1</td><td>Utiliser une centrifugeuse de bureau à portée de main</td></tr><tr><td>MembraneSlide 1.0 PET</td><td>Zeiss</td><td>415101-4401-050</td><td>Lames de verre recouvertes d’une membrane utilisées pour la microdissection laser</td></tr><tr><td>UV Stratalinker 1800 Stratagene</td><td></td><td>400072</td><td>Utiliser un réticulant d’ADN à portée de main</td></tr><tr><td>Réactifs</td><td></td><td></td><td></td>PCR standard</tr><tr><td>6x Chargement de l’ADN Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>R0611</td><td>Utiliser du gel Chargement du colorant à portée de main</td></tr><tr><td>Échelle d’ADN</td><td>BioLabs</td><td>N0551G</td><td>Utilisation d’une échelle de 100 pb à portée de main</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>Station d’électrophorèse en gel</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Utilisation d’un système d’électrophorèse à portée de main</td></tr><tr><td>Gel Red Nucleic Acid Stain</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>Colorant intercalateur pour la visualisation de l’ADN Dans les gels d’agarose</td></tr></tbody></table>

cible cellulaire pré-enrichissement et whole genome amplification pour la cellule unique caractérisation en aval

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Cellules cibles rares peuvent être isolés dans un fond important de cellules non ciblés à l’aide d’anticorps spécifiques pour des protéines de surface des cellules cibles. Une méthode récemment développée utilise un fil médical fonctionnalisé avec des cellules épithéliales anti adhérence molécule (EpCAM) anticorps pour in vivo l’isolement des tumeurs des cellules (CTC)1en circulation. Une cohorte de patients appariés en cancer de la prostate non métastatique ont montré que la technique d’isolation en vivo a entraîné un pourcentage plus élevé de patients positifs pour CTC ainsi que les comptes de la CCT supérieurs par rapport à l’étalon-or actuel dans l’énumération de la CCT. Comme les cellules ne peuvent pas être recouvrés auprès des dispositifs médicaux actuels, un nouveau fil fonctionnalisé (dénommé périphérique) a été fabriqué permettant la capture et le détachement ultérieur des cellules par traitement enzymatique. Les cellules sont autorisés à fixer à l’appareil, visualisé sur un microscope et détaché à l’aide d’un traitement enzymatique. Cellules récupérées sont cytocentrifuged sur glissières recouvertes de membrane et récoltées individuellement par le biais de microdissection laser ou micromanipulation. Unicellulaire échantillons sont ensuite soumis à l’amplification du génome entier de cellule unique permettant plusieurs analyse en aval, y compris les méthodes de dépistage et spécifique à la cible. La procédure d’isolement et de récupération rendements haute qualité ADN des cellules individuelles et n’altère pas l’amplification du génome entier ultérieures (WGA). Amplification de l’ADN d’une seule cellule peut être transmise au dépistage et/ou ciblées d’analyse tels que l’hybridation génomique comparative array (tableau-CGH) ou séquençage. Le dispositif permet ex vivo l’isolement des échantillons de cellules rares artificiel (c.-à-d. 500 cellules cibles dopés dans 5 mL de sang périphérique). Alors que les taux de détachement des cellules sont acceptable (50-90 %), le taux de récupération des cellules individuelles sur glissières s’étend sur une vaste gamme dépend de la lignée cellulaire utilisée (< 10 - > 50 %) et a besoin d’une plus grande attention. Cet appareil n’est pas autorisé pour l’utilisation chez les patients.

Les cellules après CFSE et coloration nucléiques peuvent être évaluées en utilisant un microscope d’immunofluorescence équipé de filtres pour DAPI et FITC. Noyaux présentent contre-colorant lumineux dans le chenal DAPI alors que le cytoplasme des cellules montrent un marquage uniforme avec la CFSE avec une intensité inter-cellules hétérogène (Figure 2 a et 2E). Forme similaire et intensités de coloration sont attendus de cellules attachées au fil (Figure 2 b et 2F) ainsi que décrochés du fil et récupérés sur une lame (Figure 2D et 2 H).
La densité cellulaire élevée (par exemple &gt; 1 000 000 cellules/mL) peut entraîner une couverture totale du fil avec des cellules lorsque les câbles de charge. Cependant, réduire la densité des cellules, des changements de vitesse de rotation pendant l’incubation et l’utilisation de lignées cellulaires différentes affectent l’efficacité de l’isolation et doivent être testés séparément. Lorsque les fils ont été incubées avec 5 mL de cellules HT-29 100 000 cellules / mL comme décrit dans la section 2.1., une moyenne de 254 ± 103 cellules (n = 5) ont été capturés sur les fils. Avec la même expérience en utilisant des cellules LNCaP, une moyenne de 440 ± 319 cellules (n = 5) par fil a été obtenue.
Présentant des cellules HT-29 500, 5 000 et 50 000 dans un fond de 5 mL de sang périphérique aux fils (selon le protocole, section 2.2.) a abouti à la capture de 75 ± 18 cellules, 25 ± 9 cellules et 47 ± 57 cellules (n = 3, chaque), respectivement. Si le fil est facturé 15 µl de la suspension de cellules (cellules/mL 1 000 000) selon le protocole à la section 2.3., jusqu'à 1 000 (HT-29) les cellules peuvent s’attacher à un fil.
Cellule des efficacités de détachement varies de 81 % dans les cellules HT-29 (gamme 54,9 % à 93,2 % et n = 5) à 81 % (rang 63.51 92,87 %, n = 6) et 91 % (rang 84,7 % - 95,3 %, n = 6) à LNCaP et VCaP cellules, respectivement. De même, la récupération de cellules individuelles est différente entre les lignées cellulaires : une moyenne de 28 % des cellules individuelles de HT-29 ont été récupérés par cytocentrifugation. Alors que le taux de récupération de LNCaP était inférieur à 10 %, le taux de recouvrement moyen des cellules VCaP était de 55 %.
Environ 75 % des cellules simples soumis à des produits de WGA WGA rendement qualité : il s’agit de 1) frottis de produits WGA allant de 0,1 à &gt; 1 Ko (Figure 4, panneau supérieur) et 2) trois ou quatre bandes dans la qualité 4plex contrôlent PCR (Figure 4, plateau inférieur) . Produits WGA peuvent être utilisés pour 1) tableau-CGH profilage répondant aux critères de qualité de single-cell array-CGH profils 6,7 et NGS 2) ciblés après ré-amplification WGA 7.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig1.jpg"> Figure 1 : "Workflow" pour isoler et récupérer des cellules cibles pour l’analyse des unicellulaires. (A) les cellules sont cultivées à la confluence de 90 % et (B) récoltés pour obtenir une suspension de cellules individuelles. Après coloration avec CFSE et acides nucléique teinté, (C) le fil fonctionnalisé est incubée en présence de cellules dans un volume de 5 mL à l’aide de tubes de réaction ou dans un faible volume à l’aide d’une pointe de pipette Pasteur. Ce dernier permet application des volumes de suspension cellulaire aussi bas que 15 µL. (D) cellules ont besoin d’être détaché au sein de 4 h après la recharge. Par conséquent, le fil est placé dans un tube à essais 1,5 mL rempli avec du tampon de sortie. Après 15 min d’incubation sur un rocker et centrifugation de 10 min, le fil est enlevé et la suspension cellulaire est centrifugée pour les cellules de granule. (E) récupéré les cellules sont soit transférés à une lame de verre pour monocellulaires micromanipulation (haut) ou cytocentrifuged sur une lame de membrane-enduit et transmises à laser microdissection (en bas). (F) Enfin, monocellules récoltés sont amplifiées au moyen de l’amplification du génome entier (WGA). Produits WGA sont compatibles avec la CGH-array et analyse en aval du NGS ciblée. EpCAM épitope : cercle vert sur la surface de la cellule. Fonctionnalisés fil : appareil, câbles triple hélice gris. Polymère : lignes violettes. Anticorps anti-EpCAM : orange. Activité de la mémoire tampon de sortie : flèche rouge. Marqueur de graisse pour maintenir la suspension cellulaire en place : ellipse bleu foncé. Récupéré la suspension cellulaire : bleu clair. Capillaire de micromanipulation : noir ligne. Grossissement : récupéré cellule récolté par micromanipulation, cytospin sur membrane recouverte diapositive contenant des cellules récupérées (gris ellipse pleine). Grossissement : cellule récupéré étant laser microdissected (gris ligne circulaire : membrane de diapositive de membrane sert d’épine dorsale pour la microdissection laser), objective, faisceau laser (ligne bleue approchant la lame de la membrane par en dessous). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig2.jpg"> Figure 2 : visualisation des cellules marquées. (A, E) Avant de charger les cellules : les cellules sont marquées avec CFSE et Eosine avec de l’ADN intercalant colorant montrant une intensité de signal de gamme de CFSE (vert). (B,F) Cellules marquées capturés sur le fil. (C,G) Fil après intervention de la cellule-détachement. (D,H) Cellules individuelles du fil et récupéré par cytocentrifugation sur une lame. CFSE : Canal FITC (vert). ADN : canal DAPI (bleu). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig3.jpg"> Figure 3 : fil et rangement du coffre à. (A) compartiments du fil. (B) détail de la partie fonctionnalisée. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig4.jpg"> Figure 4 : contrôle de la qualité des produits WGA provenant de cellules simples micromanipulés. Panneau supérieur : produits WGA obtenus à partir de cellules individuelles en général résultat ADN frottis allant de 0,2 kb à &gt; 1,0 Ko avec un pic d’intensité à environ 0,5 Ko. Nombre d’échantillons 1, 7 et 13 (indiquées par des astérisques) montrer sous-optimaux ou aucun ADN frottis. Panneau inférieur : WGA produits sont de qualité suffisante si la PCR 4plex des rendements trois ou quatre de quatre produits PCR (100, 200, 300 et 400 bp). Échantillons de 1, 7, 10 et 13 montrent moins de trois bandes et seraient exclus de l’analyse. Voie M contient une échelle bp 100 et les astérisques indiquent les échantillons de qualité insuffisante de produit WGA. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Séquence d’amorce</td>
			<td>REMARQUE</td>
		</tr>
<tr>
<td>5′-gtt cca ata tga ttc ACC cc-3′</td>
			<td>apprêt avant bp 100</td>
		</tr>
<tr>
<td>5′-CCC ctg gaa Tam Tam ggt gg-3′</td>
			<td>100 amorces inverse bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>5′-agg tgg agc gag gct agc-3′</td>
			<td>apprêt avant 200 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>5′-ttt tgc ggt gga aat gtc ct-3′</td>
			<td>apprêt inverse bp 200</td>
		</tr>
<tr>
<td>5′-agg tga gac att ctt gct gg-3′</td>
			<td>apprêt avant bp 300</td>
		</tr>
<tr>
<td>5′-tcc act aac cag tca gcg tc-3′</td>
			<td>apprêt inverse bp 300</td>
		</tr>
<tr>
<td>5′-aca gtc chat gcc atc Loi gc-3′</td>
			<td>apprêt avant 400 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>5′-gct tga caa agt ggt cgt tg-3′</td>
			<td>apprêt inverse bp 400</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Séquences d’amorces pour le contrôle de la qualité 4plex PCR

Ce protocole est de récupérer et de préparer des cellules-cibles rares à partir d’un mélange avec des cellules non cibles fond pour la caractérisation génétique moléculaire au niveau unicellulaire. Qualité de l’ADN est égale à cellules individuelles non traitées et permet application unicellulaires (les deux dépistage basé et ciblée d’analyse).

Cible cellulaire pré-enrichissement et Whole Genome Amplification pour la cellule unique caractérisation en aval

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les cellules de la suspension cellulaire afin de les rendre disponibles pour l’analyse en aval d’une seule cellule. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le contexte des biopsies liquides et de l’hétérogénéité cellulaire. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’isolement de cellules uniques à base d’anticorps et leur récupération pour une analyse génétique moléculaire ultérieure au niveau de la cellule unique.Une fois autorisée pour son utilisation chez les patients, cette technique permettra de caractériser les cellules tumorales circulantes de patients cancéreux. Comme cette méthode peut donner un aperçu de l’hétérogénéité entre les cellules individuelles, elle peut être appliquée à toutes sortes de suspensions cellulaires contenant des sous-populations telles que des échantillons de sang, des échantillons de cultures cellulaires ou des tissus et organes dissociés. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons utilisé un dispositif d’enrichissement in vivo non capable de libérer des cellules à des fins d’analyse en aval.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de récolte de cellules uniques à l’aide de la microdissection laser ou de la micromanipulation sont difficiles à réaliser avec succès car le processus de récolte de cellules uniques est sujet à la perte de cellules et nécessite un haut niveau d’expertise. Dans un millilitre de milieu de culture cellulaire préchauffé, remettre en suspension les cellules marquées au HT-29 CFSE et les laisser se régénérer à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour récolter les cellules, centrifugez à 300 g pendant trois minutes.Ensuite, mettez la pastille cellulaire en suspension dans un millilitre de solution de coloration de l’ADN Hoechst 33342 prête à l’emploi à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire à 300 g pendant trois minutes. Ensuite, jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans quatre millilitres de solution saline tamponnée au phosphate 1X.Ensuite, comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre et vérifiez le marquage par fluorescence avec un microscope à fluorescence. Ensuite, centrifugez les cellules à 300 g pendant trois minutes, jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension à environ 500 000 cellules par millilitre et placez les cellules sur de la glace. Dans cinq millilitres de sang périphérique, ajoutez environ 500 à 500 000 cellules puis mélangez en inversant le tube.Après avoir retiré le fil du compartiment de rangement, retirez le capuchon en caoutchouc qui maintient le fil et lavez le fil dans une solution saline tamponnée au phosphate 1X et montez-le dans le capuchon du tube. Ensuite, incubez le tube sur un mélangeur à rouleaux inclinés à cinq rotations par minute pendant 30 minutes à température ambiante. Après l’incubation, rincez trois fois le fil dans une solution saline tamponnée au phosphate.Ensuite, stockez le fil dans un tube de 15 millilitres contenant une solution saline tamponnée au phosphate 1X dans l’obscurité. Dessinez une zone rectangulaire sur une lame de verre à l’aide d’un stylo à graisse, puis ajoutez-y 500 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate 1X. Pour immerger la partie fonctionnelle du fil dans une solution saline tamponnée au phosphate 1X, pliez la partie non fonctionnelle du fil et placez-la sur la lame de verre.Pour compter le nombre de cellules capturées, inspectez visuellement les deux côtés du fil. Après l’inspection, transférez le fil dans le tube de 15 millilitres avec une solution saline tamponnée au phosphate 1X et maintenez-le dans l’obscurité. Dans un millilitre de solution saline tamponnée au phosphate 1X, dissolvez quatre milligrammes du composant du tampon de démoulage, puis filtrez la solution à travers un filtre stérile de 0,2 micromètre pour obtenir le tampon prêt à l’emploi.Ensuite, réchauffez le tampon de libération à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Une fois réchauffé, transférez 1,6 millilitre de tampon de libération pour remplir complètement un tube de réaction de 1,5 millilitre. Ensuite, incubez la partie fonctionnelle du fil dans le tampon de libération à 37 degrés Celsius dans un bain-marie pendant 20 minutes.Après l’incubation, placez le fil sur un agitateur à 500 rotations par minute pendant 15 minutes. Ensuite, centrifugez le fil à 300 g pendant 10 minutes. Une fois la centrifugation terminée, déplacez le fil du tube, fermez le capuchon et centrifugez à nouveau le tube à 300 g pendant 10 minutes.Pour diminuer le volume de suspension cellulaire, jetez tous les surnageants sauf 100 microlitres pour la micromanipulation ou 300 microlitres pour la cytocentrifugation et la microdissection laser ultérieures. Ensuite, passez rapidement à l’échantillonnage sur cellule unique. Pour la micromanipulation, transférez les 100 microlitres de suspension cellulaire sur une lame de verre.Ensuite, placez la lame de verre sur un microscope équipé d’un micromanipulateur et laissez les cellules se stabiliser pendant cinq minutes. Ensuite, dans des tubes PCR de 0,2 millilitre, pipetez deux microlitres de mélange maître de lyse cellulaire et transférez-les sur de la glace. Utilisez le micromanipulateur pour prélever une seule cellule dans un microlitre de solution saline tamponnée au phosphate 1X.Ensuite, transférez la cellule directement dans deux microlitres de mélange maître de lyse cellulaire. À l’aide d’un microfuge de bureau, faites tourner rapidement les échantillons à 2 000 g pendant trois secondes afin de recueillir le liquide au fond du tube. Ensuite, transférez l’échantillon sur de la glace et procédez à l’amplification du génome entier basée sur l’adaptateur de liaison.Aspirez une seule cellule en utilisant un microlitre de tampon au maximum. Lors du transfert de la cellule dans la solution de lyse, assurez-vous de voir des bulles sortir de la solution, indiquant que tout le volume aspiré a été transféré. Pour la microdissection laser, cytocentrifugez la totalité des 300 microlitres de suspension cellulaire sur une lame recouverte d’une membrane à 300 g pendant cinq minutes.Ensuite, placez la lame recouverte d’une membrane sur un microscope capable de microdissection laser. Ensuite, pipetez 4,5 microlitres de mélange maître de lyse cellulaire dans le capuchon du tube PCR de 0,2 millilitre. Placez le capuchon au-dessus de l’échantillon et prélevez une seule cellule par microdissection laser.Immédiatement après, vérifiez la présence de cellules isolées dans le capuchon de la PCR, retirez le tube de la PCR du microscope de microdissection laser et fermez le tube. Récupérez tout le liquide au fond du tube avec une courte rotation. Transférez l’échantillon sur de la glace et procédez à l’amplification du génome entier basée sur l’adaptateur de liaison.Assurez-vous de récupérer la cellule microdisséquée au laser. Par conséquent, il est important de couvrir l’ensemble du capuchon du tube avec la solution de lyse. Après la microdissection, vérifiez que le capuchon du tube n’est pas en présence de la cellule.Pour montrer les cellules qui sont colorées avec CFSE et Hoechst 33342, l’imagerie par immunofluorescence a été réalisée avant de charger le fil, pendant que les cellules étaient attachées au fil, puis détachées du fil, et enfin sur la lame. Les images d’immunofluorescence des cellules avant la charge montrent une coloration nucléique brillante en bleu, tandis que le cytoplasme des cellules montre une coloration CFSE verte avec une intensité intercellulaire hétérogène. Un motif de coloration similaire est également observé pour les cellules qui sont attachées puis détachées du fil.Pour vérifier la qualité de l’ensemble des produits d’amplification du génome, un gel d’agarose à 1 % a été analysé. Le gel d’agarose présente un frottis d’ADN allant de 0,2 à plus de 1 kilobase pour les produits PCR d’amplification du génome entier. Les produits PCR de contrôle qualité 4plex obtenus à partir de la cellule unique produisent des produits de 100, 200, 300 et 400 paires de bases.Les produits qui présentent moins de trois bandes sont exclus de l’analyse plus approfondie. Une fois maîtrisée, cette technique permet d’isoler des cellules uniques à partir de suspensions cellulaires en quatre heures si elle est effectuée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de garder les cellules immergées dans un tampon, en particulier pendant le temps où les cellules sont attachées au fil pour éviter d’endommager les cellules.À la suite de cette procédure, des méthodes d’analyse telles que l’hybridation génomique comparative de zone, le séquençage de nouvelle génération et la PCR spécifique à la cible peuvent être effectuées afin de caractériser des cellules uniques en fonction des variations du nombre de copies et des mutations. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et de récupérer des cellules à partir de suspensions cellulaires à l’aide d’un fil fonctionnalisé et de la façon d’échantillonner des cellules uniques pour une analyse génétique moléculaire multiple en aval. N’oubliez pas que travailler avec du sang humain présente un risque d’infection, c’est pourquoi le port de gants et d’une blouse de laboratoire est obligatoire lors de l’exécution de cette procédure.

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Les cellules tumorales circulantes (CTC) sont essentielles pour l’étude de la progression du cancer et des métastases. Cet article présente un protocole intégré à haut débit pour l’enrichissement des CTC et le séquençage d’un seul CTC, améliorant l’efficacité de capture et la pureté des CTC tout en réduisant les coûts de contamination et de séquençage, faisant ainsi progresser la recherche en oncologie de précision et les applications cliniques.

Technologie de tri de cellules tumorales circulantes à haut débit et de séquençage de cellules uniques basée sur la microfluidique

Découvrez l'isolation de cellules rares par enrichissement préalable et amplification du génome entier pour la caractérisation génétique moléculaire à cellule unique. Cette méthode permet d'analyser les cellules tumorales circulantes chez les patients atteints de cancer.

Cible cellulaire pré-enrichissement et Whole Genome Amplification pour la cellule unique caractérisation en aval

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