Cible cellulaire pré-enrichissement et Whole Genome Amplification pour la cellule unique caractérisation en aval

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les cellules de la suspension cellulaire afin de les rendre disponibles pour l’analyse en aval d’une seule cellule. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le contexte des biopsies liquides et de l’hétérogénéité cellulaire. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’isolement de cellules uniques à base d’anticorps et leur récupération pour une analyse génétique moléculaire ultérieure au niveau de la cellule unique.

Une fois autorisée pour son utilisation chez les patients, cette technique permettra de caractériser les cellules tumorales circulantes de patients cancéreux. Comme cette méthode peut donner un aperçu de l’hétérogénéité entre les cellules individuelles, elle peut être appliquée à toutes sortes de suspensions cellulaires contenant des sous-populations telles que des échantillons de sang, des échantillons de cultures cellulaires ou des tissus et organes dissociés. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons utilisé un dispositif d’enrichissement in vivo non capable de libérer des cellules à des fins d’analyse en aval.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de récolte de cellules uniques à l’aide de la microdissection laser ou de la micromanipulation sont difficiles à réaliser avec succès car le processus de récolte de cellules uniques est sujet à la perte de cellules et nécessite un haut niveau d’expertise. Dans un millilitre de milieu de culture cellulaire préchauffé, remettre en suspension les cellules marquées au HT-29 CFSE et les laisser se régénérer à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour récolter les cellules, centrifugez à 300 g pendant trois minutes.

Ensuite, mettez la pastille cellulaire en suspension dans un millilitre de solution de coloration de l’ADN Hoechst 33342 prête à l’emploi à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire à 300 g pendant trois minutes. Ensuite, jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans quatre millilitres de solution saline tamponnée au phosphate 1X.

Ensuite, comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre et vérifiez le marquage par fluorescence avec un microscope à fluorescence. Ensuite, centrifugez les cellules à 300 g pendant trois minutes, jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension à environ 500 000 cellules par millilitre et placez les cellules sur de la glace. Dans cinq millilitres de sang périphérique, ajoutez environ 500 à 500 000 cellules puis mélangez en inversant le tube.

Après avoir retiré le fil du compartiment de rangement, retirez le capuchon en caoutchouc qui maintient le fil et lavez le fil dans une solution saline tamponnée au phosphate 1X et montez-le dans le capuchon du tube. Ensuite, incubez le tube sur un mélangeur à rouleaux inclinés à cinq rotations par minute pendant 30 minutes à température ambiante. Après l’incubation, rincez trois fois le fil dans une solution saline tamponnée au phosphate.

Ensuite, stockez le fil dans un tube de 15 millilitres contenant une solution saline tamponnée au phosphate 1X dans l’obscurité. Dessinez une zone rectangulaire sur une lame de verre à l’aide d’un stylo à graisse, puis ajoutez-y 500 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate 1X. Pour immerger la partie fonctionnelle du fil dans une solution saline tamponnée au phosphate 1X, pliez la partie non fonctionnelle du fil et placez-la sur la lame de verre.

Pour compter le nombre de cellules capturées, inspectez visuellement les deux côtés du fil. Après l’inspection, transférez le fil dans le tube de 15 millilitres avec une solution saline tamponnée au phosphate 1X et maintenez-le dans l’obscurité. Dans un millilitre de solution saline tamponnée au phosphate 1X, dissolvez quatre milligrammes du composant du tampon de démoulage, puis filtrez la solution à travers un filtre stérile de 0,2 micromètre pour obtenir le tampon prêt à l’emploi.

Ensuite, réchauffez le tampon de libération à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Une fois réchauffé, transférez 1,6 millilitre de tampon de libération pour remplir complètement un tube de réaction de 1,5 millilitre. Ensuite, incubez la partie fonctionnelle du fil dans le tampon de libération à 37 degrés Celsius dans un bain-marie pendant 20 minutes.

Après l’incubation, placez le fil sur un agitateur à 500 rotations par minute pendant 15 minutes. Ensuite, centrifugez le fil à 300 g pendant 10 minutes. Une fois la centrifugation terminée, déplacez le fil du tube, fermez le capuchon et centrifugez à nouveau le tube à 300 g pendant 10 minutes.

Pour diminuer le volume de suspension cellulaire, jetez tous les surnageants sauf 100 microlitres pour la micromanipulation ou 300 microlitres pour la cytocentrifugation et la microdissection laser ultérieures. Ensuite, passez rapidement à l’échantillonnage sur cellule unique. Pour la micromanipulation, transférez les 100 microlitres de suspension cellulaire sur une lame de verre.

Ensuite, placez la lame de verre sur un microscope équipé d’un micromanipulateur et laissez les cellules se stabiliser pendant cinq minutes. Ensuite, dans des tubes PCR de 0,2 millilitre, pipetez deux microlitres de mélange maître de lyse cellulaire et transférez-les sur de la glace. Utilisez le micromanipulateur pour prélever une seule cellule dans un microlitre de solution saline tamponnée au phosphate 1X.

Ensuite, transférez la cellule directement dans deux microlitres de mélange maître de lyse cellulaire. À l’aide d’un microfuge de bureau, faites tourner rapidement les échantillons à 2 000 g pendant trois secondes afin de recueillir le liquide au fond du tube. Ensuite, transférez l’échantillon sur de la glace et procédez à l’amplification du génome entier basée sur l’adaptateur de liaison.

Aspirez une seule cellule en utilisant un microlitre de tampon au maximum. Lors du transfert de la cellule dans la solution de lyse, assurez-vous de voir des bulles sortir de la solution, indiquant que tout le volume aspiré a été transféré. Pour la microdissection laser, cytocentrifugez la totalité des 300 microlitres de suspension cellulaire sur une lame recouverte d’une membrane à 300 g pendant cinq minutes.

Ensuite, placez la lame recouverte d’une membrane sur un microscope capable de microdissection laser. Ensuite, pipetez 4,5 microlitres de mélange maître de lyse cellulaire dans le capuchon du tube PCR de 0,2 millilitre. Placez le capuchon au-dessus de l’échantillon et prélevez une seule cellule par microdissection laser.

Immédiatement après, vérifiez la présence de cellules isolées dans le capuchon de la PCR, retirez le tube de la PCR du microscope de microdissection laser et fermez le tube. Récupérez tout le liquide au fond du tube avec une courte rotation. Transférez l’échantillon sur de la glace et procédez à l’amplification du génome entier basée sur l’adaptateur de liaison.

Assurez-vous de récupérer la cellule microdisséquée au laser. Par conséquent, il est important de couvrir l’ensemble du capuchon du tube avec la solution de lyse. Après la microdissection, vérifiez que le capuchon du tube n’est pas en présence de la cellule.

Pour montrer les cellules qui sont colorées avec CFSE et Hoechst 33342, l’imagerie par immunofluorescence a été réalisée avant de charger le fil, pendant que les cellules étaient attachées au fil, puis détachées du fil, et enfin sur la lame. Les images d’immunofluorescence des cellules avant la charge montrent une coloration nucléique brillante en bleu, tandis que le cytoplasme des cellules montre une coloration CFSE verte avec une intensité intercellulaire hétérogène. Un motif de coloration similaire est également observé pour les cellules qui sont attachées puis détachées du fil.

Pour vérifier la qualité de l’ensemble des produits d’amplification du génome, un gel d’agarose à 1 % a été analysé. Le gel d’agarose présente un frottis d’ADN allant de 0,2 à plus de 1 kilobase pour les produits PCR d’amplification du génome entier. Les produits PCR de contrôle qualité 4plex obtenus à partir de la cellule unique produisent des produits de 100, 200, 300 et 400 paires de bases.

Les produits qui présentent moins de trois bandes sont exclus de l’analyse plus approfondie. Une fois maîtrisée, cette technique permet d’isoler des cellules uniques à partir de suspensions cellulaires en quatre heures si elle est effectuée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de garder les cellules immergées dans un tampon, en particulier pendant le temps où les cellules sont attachées au fil pour éviter d’endommager les cellules.

À la suite de cette procédure, des méthodes d’analyse telles que l’hybridation génomique comparative de zone, le séquençage de nouvelle génération et la PCR spécifique à la cible peuvent être effectuées afin de caractériser des cellules uniques en fonction des variations du nombre de copies et des mutations. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et de récupérer des cellules à partir de suspensions cellulaires à l’aide d’un fil fonctionnalisé et de la façon d’échantillonner des cellules uniques pour une analyse génétique moléculaire multiple en aval. N’oubliez pas que travailler avec du sang humain présente un risque d’infection, c’est pourquoi le port de gants et d’une blouse de laboratoire est obligatoire lors de l’exécution de cette procédure.