Name: Imagerie confocale à haute résolution de la barrière hémato - encéphalique : imagerie, Reconstruction 3D et la Quantification de la transcytose (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Découvrez une méthode d'imagerie confocale haute résolution pour la barrière hémato-encéphalique chez la souris. Cette technique permet la reconstruction 3D et la quantification des organelles subcellulaires dans l'unité neurovasculaire.

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R.V. travail a été soutenu par une bourse postdoctorale de Roche (2014-2017).

<ol><li>Blanchette, M., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+maintenance+of+the+BBB%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Formation and maintenance of the BBB.</a> Mech Dev. 138, Pt 1 8-16 (2015).</li>
<li>Chow, B. W., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Molecular+Constituents+of+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Molecular Constituents of the Blood-Brain Barrier.</a> Trends Neurosci. 38 (10), 598-608 (2015).</li>
<li>Niewoehner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Brain+Penetration+and+Potency+of+a+Therapeutic+Antibody+Using+a+Monovalent+Molecular+Shuttle%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Increased Brain Penetration and Potency of a Therapeutic Antibody Using a Monovalent Molecular Shuttle.</a> Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).</li>
<li>Yu, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+bispecific+antibodies+cross+the+blood-brain+barrier+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutic bispecific antibodies cross the blood-brain barrier in nonhuman primates.</a> Sci Transl Med. 6 (261), 154(2014).</li>
<li>Preston, J. E., Joan Abbott, N., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcytosis+of+macromolecules+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Transcytosis of macromolecules at the blood-brain barrier.</a> Adv Pharmacol. 71, 147-163 (2014).</li>
<li>De Bock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Into+rather+unexplored+terrain-transcellular+transport+across+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier.</a> Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).</li>
<li>Bien-Ly, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferrin+receptor+%28TfR%29+trafficking+determines+brain+uptake+of+TfR+antibody+affinity+variants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Transferrin receptor (TfR) trafficking determines brain uptake of TfR antibody affinity variants.</a> J Exp Med. 211 (2), 233-244 (2014).</li>
<li>Sade, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+blood-brain+barrier+transcytosis+assay+reveals+antibody+transcytosis+influenced+by+pH-dependent+receptor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding.</a> PLoS One. 9 (4), 96340(2014).</li>
<li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRP-1-mediated+intracellular+antibody+delivery+to+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">LRP-1-mediated intracellular antibody delivery to the Central Nervous System.</a> Sci Rep. 5, 11990(2015).</li>
<li>Hsu, J., Rappaport, J., Muro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+binding%2C+uptake%2C+and+transport+of+ICAM-1-targeted+nanocarriers+across+endothelial+and+subendothelial+cell+components+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Specific binding, uptake, and transport of ICAM-1-targeted nanocarriers across endothelial and subendothelial cell components of the blood-brain barrier.</a> Pharm Res. 31 (7), 1855-1866 (2014).</li>
<li>Siupka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+apical-basal+traffic+of+the+cation-independent+mannose-6-phosphate+receptor+in+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells.</a> J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).</li>
<li>Zlokovic, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+saturable+mechanism+for+transport+of+immunoglobulin+G+across+the+blood-brain+barrier+of+the+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A saturable mechanism for transport of immunoglobulin G across the blood-brain barrier of the guinea pig.</a> Exp Neurol. 107 (3), 263-270 (1990).</li>
<li>Deane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG-assisted+age-dependent+clearance+of+Alzheimer%27s+amyloid+beta+peptide+by+the+blood-brain+barrier+neonatal+Fc+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">IgG-assisted age-dependent clearance of Alzheimer's amyloid beta peptide by the blood-brain barrier neonatal Fc receptor.</a> J Neurosci. 25 (50), 11495-11503 (2005).</li>
<li>Cabezon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+applied+to+study+the+trafficking+of+8D3-coated+gold+nanoparticles+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Serial block-face scanning electron microscopy applied to study the trafficking of 8D3-coated gold nanoparticles at the blood-brain barrier.</a> Histochem Cell Biol. , (2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Collin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+uptake+of+tau%2FpS422+antibody+and+reduced+progression+of+tau+pathology+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Neuronal uptake of tau/pS422 antibody and reduced progression of tau pathology in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Brain. 137 (10), 2834-2846 (2014).</li>
<li>Villasenor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+Endogenous+Immunoglobulins+by+Endothelial+Cells+at+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Trafficking of Endogenous Immunoglobulins by Endothelial Cells at the Blood-Brain Barrier.</a> Sci Rep. 6, 25658(2016).</li>
<li>Villasenor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+permeability+of+the+blood-brain+barrier+upon+pericyte+loss%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Region-specific permeability of the blood-brain barrier upon pericyte loss.</a> J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).</li>
<li>Armulik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+regulate+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes regulate the blood-brain barrier.</a> Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4537058/">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Sibarita, J. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSibarita%2C+JB+%22Deconvolution+Microscopy%22">Deconvolution Microscopy</a>. 95, 201-243 (2005).</li>
<li>Shaw, P. J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-0-387-45524-2_23">Comparison of Widefield/Deconvolution and Confocal Microscopy for Three-Dimensional Imaging</a>. , 453-467 (2006).</li>
<li>Chenouard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective+comparison+of+particle+tracking+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Objective comparison of particle tracking methods.</a> Nat Methods. 11 (3), 281-289 (2014).</li>
<li>Foret, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+theoretical+framework+to+infer+endosomal+network+dynamics+from+quantitative+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A general theoretical framework to infer endosomal network dynamics from quantitative image analysis.</a> Curr Biol. 22 (15), 1381-1390 (2012).</li>
<li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+are+required+for+blood-brain+barrier+integrity+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).</li>
<li>Bell, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+control+key+neurovascular+functions+and+neuronal+phenotype+in+the+adult+brain+and+during+brain+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging.</a> Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).</li>
<li>Ben-Zvi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mfsd2a+is+critical+for+the+formation+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier.</a> Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).</li>
<li>Stewart, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+vesicles+in+the+blood-brain+barrier%3A+are+they+related+to+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial vesicles in the blood-brain barrier: are they related to permeability.</a> Cell Mol Neurobiol. 20 (2), 149-163 (2000).</li>
<li>Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing+-+multi-scale+spatio-temporal+imaging+towards+in+vivo+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing - multi-scale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology.</a> J Cell Sci. 130 (1), 23-38 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs sont sous un emploi rémunéré par Roche.

Le protocole décrit ci-dessus décrit la préparation du cerveau sections flottant, immunofluorescence, acquisition d’images et paramètres d’analyse pour la microscopie à haute résolution de la BHE. Cette méthode a été récemment utilisée pour étudier la localisation des anticorps livraison plates-formes3, le transport des IgG endogène à travers le BBB17et l’hétérogénéité de la BHE à perte de pericyte18. Différentes étapes dans le protocole peuvent être modifiés pour s’adapter à l’objectif spécifique de l’expérience. Tout d’abord, l’utilisation d’épaisseur importante (100 µm) facilite leur manipulation pendant les procédures de montage et immunostaining. Il permet également pour la reconstruction 3D du réseau capillaire, l’unité neurovasculaire et pour la génération de capillaire et les coupes NVU. Cependant, pénétration des anticorps au sein des sections de tissu peut varier et la coloration de certains anticorps peut être limitée à la couche superficielle du tissu proche de la lamelle couvre-objet. Le protocole peut être modifié en augmentant la concentration de détergent pendant l’étape de la perméabilisation et/ou la longueur de l’étape de la perméabilisation pour améliorer la pénétration des anticorps dans le tissu. En second lieu, la qualité d’image peut être compromise lors d’une tentative d’acquisition d’images plus profondément dans les tissus (généralement 20 à 30 µm sous la surface) en raison de la diffusion de la lumière ainsi que les aberrations optiques de l’incompatibilité de l’indice de réfraction. Pour contourner ce problème, nouvelles méthodes de compensation des tissus et active en anticorps pénétration20 peuvent être associés à ce protocole aux volumes plus grandes image du tissu. En troisième lieu, déconvolution s’effectue après l’acquisition d’images pour améliorer la résolution axiale de l’image. Le choix de l’algorithme de déconvolution aveugle utilisé dans le présent protocole est fondé sur (i) sa facilité d’utilisation, comme aucun calcul préalable de la fonction de l’écart de points n’est requis, (ii) sa robustesse pour améliorer l’image qualité21et (iii) l’absence d’objets mIgG structures intracellulaires après la mise en œuvre. Selon les structures intracellulaires visualisés dans l’échantillon, autres algorithmes de déconvolution peuvent entraîner une meilleure qualité d’image. Les références suivantes21,22 fournissent une large discussion sur les avantages et les limitations des algorithmes supplémentaires pour la déconvolution d’images. Enfin, l’utilisation d’un progiciel d’analyse image autorisé la segmentation des capillaires et des structures intracellulaires en trois dimensions. Clairement, analyse d’image n’est pas limitée au logiciel décrit dans le protocole et les paquets, par exemple celles mentionnées dans la référence23, peut être utilisé pour des images de segment. L’adéquation des différents logiciels d’analyse des structures intracellulaires à travers la BHE devrait être vérifiée empiriquement par l’évaluation de l’exactitude de la segmentation de l’image.
Étant donné que cette méthode est basée sur des échantillons de fixes, il ne fournit pas des informations directes sur la dynamique de la transcytose à travers la BHE. Toutefois, il peut être associé des expériences de temps24, par exemple par voie intraveineuse par injection de la molécule d’intérêt et en mesurant son accumulation dans les BECs à des moments différents après l’injection, pour reconstruire la cinétique de transport intracellulaire. L’avantage de cette approche est qu’elle permet l’analyse des régions du cerveau profond, comme illustré dans le18, qui sont actuellement inaccessibles aux approches d’imagerie live intravitale. Une étape critique pendant le protocole est le suivi attentif de la fixation du tissu. Fixation avec 4 % PFA réduit considérablement l’immunogénicité des organites intracellulaires et des immunoglobulines endogènes ou périphériquement gérés17 (Figure 1 b). Une limitation du présent protocole est son exigence d’anticorps de haute qualité(p. ex., une coloration non spécifique faible, faible réactivité croisée) appropriés pour l’immunofluorescence. Sous réserve que ces réactifs sont disponibles, la méthode peut être appliquée afin d’étudier la localisation intracellulaire d’une protéine d’intérêt. Par exemple, le protocole servait à identifier les lysosomes dans le cerveau des cellules endothéliales17. Il devrait également noter que, étant donné que ce protocole est basé sur la microscopie confocale, la résolution latérale est limitée par la diffraction et ne peut pas résoudre des structures inférieures à environ 175 à 250 nm (Figure 2).
Des études antérieures ont effectué une analyse détaillée de la composition cellulaire de l’unité neurovasculaire, à l’aide de la microscopie confocale25,26. Cependant, enquête sur le transport intracellulaire à la BHE repose principalement sur l’utilisation de la microscopie électronique de transmission19,27,28. Bien que cette méthode offre la plus haute résolution latérale des structures intracellulaires, microscopie électronique reste une technique difficile avec un faible débit. En outre, le nombre de cibles moléculaires différentes qui peuvent être visualisées par EM est très limité. Ce protocole offre une alternative accessible afin d’étudier le transport intracellulaire à la BHE. La procédure complète, de la collection du cerveau à l’analyse de l’image, peut être effectuée en 5 à 6 jours. Si les anticorps appropriés sont disponibles, immunofluorescence permet la détection simultanée de plusieurs molécules/types des cellules au sein d’un même échantillon. En outre, ce protocole pourrait être associé à des techniques de microscopie de Super-résolution pour surmonter les limitations en résolution spatiale29. Dans l’ensemble, le protocole décrit ci-dessus permet la quantification des changements dans la localisation intracellulaire des protéines d’intérêt au sein de l’unité neurovasculaire. Son application des différentes perturbations génétiques ou pharmacologiques permettra d’enquêter sur les fonctions de structure et de transport intracellulaires du BBB en vivo.

La barrière sang - encéphalique (BHE) est une barrière cellulaire continue formée par les cellules endothéliales, péricytes, neurones et les astrocytes qui sépare le système nerveux central (CNS) de la circulation de sang1. La réglementation du transport à travers la BHE joue un rôle crucial dans le maintien de l’homéostasie du cerveau et est véhiculée par des propriétés spécialisées des cellules endothéliales du cerveau (BECs). La présence de jonctions intercellulaires entre les BECs et un faible taux basal de transcytose limitent le transport paracellulaire et transcellulaire de molécules par voie sanguine, respectivement2. Récemment, la voie de la transcytose à BECs a été mobilisée pour améliorer la prestation des thérapeutiques grosses molécules au cerveau3,4. Cependant, les mécanismes de la transcytose à travers la BHE n’ont pas encore été complètement caractérisé5,6.
Beaucoup de travail a été fait in vitro afin de décrypter les mécanismes cellulaires et moléculaires régissant le transport intracellulaire à travers BECs7,8,9,10, 11, mais ces systèmes ne parviennent pas à récapituler l’architecture complexe et la physiologie de l’unité neurovasculaire (UNV). En revanche, des études in vivo12,13 fournir des informations quantitatives détaillées sur les taux de transport à travers la BHE mais ne fournissent pas de mieux comprendre les mécanismes intracellulaires de transport. Par conséquent, étudie les composants cellulaires et intracellulaires de l’UNV in vivo et ex vivo reste très difficile14. Seulement un nombre limité de techniques est susceptible d’analyser des structures subcellulaires dans les cellules de l’UNV. La plupart des études utilisent la microscopie électronique, mais cette technique est limitée par les protocoles complexes nécessaires à la préparation du tissu adéquate et la manipulation des échantillons. Par conséquent, nous avons établi une méthodologie basée sur la microscopie confocal de haute résolution qui faciliterait le traitement des échantillons de cerveau, l’analyse et la quantification des compartiments subcellulaires dans les cellules de l’UNV.
Nous décrivons ici un protocole qui utilise souris cerveau flottant sections pour effectuer l’imagerie quantitative du BBB et NVU au niveau cellulaire et subcellulaire. Nous avons testé et validé un certain nombre d’anticorps d’image et de reconstruire l’UNV en trois dimensions. En outre, ce protocole permet l’imagerie à la résolution optique maximale de diffraction limitée des organelles dans les capillaires du cerveau. Ainsi que l’analyse d’image, ce protocole peut être utilisé pour étudier le transport intracellulaire des macromolécules à travers la BHE dans des conditions expérimentales différentes, par exemple dans les modèles souris de maladies de la neurodégénérescence.

<table><tbody><tr><td>Clone d’anticorps monoclonal de rat ER-MP12 contre CD31/PECAM</td><td>Novus Biologicals</td><td>MCA2388</td><td>Labels Brain Endothelial Cells Utilisation à la dilution 1:100 détecter avec l’âne polyclonal anti-rat IgG (H+L) couplé à un colorant AlexaFluor approprié, utilisé à la dilution 1:400</td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal de rat contre Podocalyxin</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1556</td><td>Labels Lumière des capillaires Utilisation à la dilution 1:100 détecter avec des IgG polyclonales anti-rat (H+L) d’âne couplées à un colorant AlexaFluor approprié, utilisé à la dilution 1:400</td></tr><tr><td>Anticorps polyclonal de lapin contre le collagène</td><td></td><td>Biotrend BT21-5014-70</td><td>Étiquettes Membrane basale des capillaires Utilisation à la dilution 1:100 détecter avec des IgG polyclonales anti-lapin d’âne (H+L) couplées à un colorant AlexaFluor approprié, utilisé à la dilution 1:400</td></tr><tr><td>Anticorps polyclonal de chèvre contre CD13</td><td>R& D Systems</td><td>AF2335</td><td>Étiquettes péricytes Utilisation à la dilution 1:100 détecter avec l’âne polyclonal polyclonal IgG anti-chèvre (H+L) couplé à un colorant AlexaFluor approprié, utilisé à la dilution 1:400</td></tr><tr><td>Clone d’anticorps monoclonal de souris G-A-5 contre GFAP couplé à Cy3</td><td>Abcam</td><td>ab49874</td><td>Étiquettes Astrocytes Utilisation à la dilution 1:100</td></tr><tr><td>Anticorps polyclonal de lapin contre Iba-1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>Étiquettes Microglia Utilisation à la dilution 1:100 détecter avec des IgG anti-rat polyclonaux d’âne (H+L) couplés à un colorant AlexaFluor approprié, utilisé à la dilution 1:400</td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal de rat ABL93 gainst LAMP2</td><td>Fitzgerald</td><td>10R-CD107BBMSP</td><td>Étiquettes Lysosomes Utilisation à la dilution 1:100 détecter avec des IgG anti-rat polyclonaux d’âne (H+L) couplés à un colorant AlexaFluor approprié, utilisé à la dilution 1:400</td></tr><tr><td>anticorps polyclonal d’âne contre les IgG de souris (H+L) AlexaFluor594</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21203</td><td>Utilisation à la dilution 1:400</td></tr> anticorps <tr><td>polyclonal d’âne contre les IgG de souris (H+L) AlexaFluor488</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21202</td><td>Utilisation à la dilution 1:400</td></tr><tr><td>anticorps polyclonal de chèvre contre les IgG de souris (H+L) AlexaFluor555</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21422</td><td>Utilisation à la dilution 1:400</td></tr><tr><td>Papier filtre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA10334347</td><td>Whatman papier filtre qualitatif préplissé Grade 0858 1/2, grainé</td></tr><tr><td>Colle cyanoacrylate</td><td>Roth Carl</td><td>258.1</td><td>Roti Coll 1</td></tr><tr><td>Médium de montage fluorescent</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>Médium de montage fluorescent Dako</td></tr><tr><td>Souris adultes</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>C57BL/6J souris mâles ou femelles âgées de 9 à 19 mois</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047235612</td><td>Leica VT100S Microtome à lame vibrante</td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser</td><td>Leica Microsystems</td><td>NA</td><td>Leica TCS SP8 X avec détecteurs HyD et laser à lumière blanche</td></tr><tr><td>Logiciel de traitement d’image</td><td>Leica Microsystems</td><td>NA</td><td>Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587</td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse d’images</td><td>Logiciel scientifique Bitplane</td><td>NA</td><td>Imaris version 7.6.5 build 31770 pour x64</td></tr><tr><td>Fluorescence SpectraViewer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>NA https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</td></tr></tbody></table>

imagerie confocale à haute résolution de la barrière hémato - encéphalique : imagerie, reconstruction 3d et la quantification de la transcytose

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

La barrière sang - encéphalique (BHE) est une interface multicellulaire dynamique qui réglemente le transport des molécules entre le cerveau et la circulation. Transcytose à travers la BHE réglemente la fourniture des anticorps thérapeutiques, métabolites et hormones pour le parenchyme du cerveau. Nous présentons ici un protocole qui allie immunofluorescence des sections flottantes à balayage laser microscopie confocale et analyse d’images pour visualiser les organites subcellulaires au sein des cellules endothéliales à la BHE. La combinaison de cet ensemble de données avec logiciel d’analyse image 3D permet la segmentation semi-automatique et quantification du volume capillaire et superficie, ainsi que le nombre et l’intensité des organites intracellulaires à la BHE. La détection des immunoglobulines endogènes de la souris (IgG) au sein de vésicules intracellulaires et leur quantification à la BHE est utilisée pour illustrer la méthode. Ce protocole peut potentiellement être appliqué à l’étude des mécanismes contrôlant la transcytose BBB de différentes molécules in vivo.

Comme exemples représentatifs d’images obtient à partir du protocole décrit ici, sections de cerveau de souris ont été colorées avec les anticorps reconnaissant les différentes composantes de l’UNV dont la membrane basale, les astrocytes, les péricytes et les cellules endothéliales (voir Table des matières pour les anticorps spécifiques utilisés) (Figure 1 a, D et E). Avec cette résolution, il est possible de distinguer les différents processus astrocytaires et fin-pieds qui sont en contact direct avec les capillaires.
Pour mettre en évidence les qualités du présent protocole pour la détection des structures intracellulaires, sections de cerveau d’animaux injectés en périphérie de l’humain anti-Tau mAb86 anticorps16 ont été colorées avec un anticorps fluorescent anti-humain ( Figure 1B). mAb86 sait précisément les neurones cibles exprimant une forme pathologique de Tau16. En utilisant le protocole décrit dans les présentes, mAb86 a été détectée avec une résolution limitée par la diffraction au sein des structures vésiculaires individuels dans les neurones (Figure 1B-C). En outre, souris endogène IgG a été détectée dans des structures intracellulaires dans les cellules endothéliales mais pas dans les péricytes (D-E de laFigure 1et Figure 2).
L’acquisition de haute résolution confocal z-cheminées de la vascularisation du cerveau permet une segmentation en trois dimensions des capillaires et des vésicules intracellulaires à la BHE. La figure 2 montre un exemple du processus de rendu et de segmentation d’un capillaire avec CollagenIV et souris IgG positif intracellulaire vésicules. En quantifiant un ensemble complet de données images segmentées, par exemple en mesurant le nombre de vésicules par volume capillaire, il est possible d’étudier les changements dans les processus de transport intracellulaire dans des conditions différentes. Figure 3 B-C montre les différences de mIgG vésicule nombre et fluorescence intensité correspondant à mIgG dans le parenchyme du cerveau, respectivement, à l’appauvrissement dans le modèle murin pdgf-bret/ret pericyte comme indiqué précédemment 17. la même approche a été récemment utilisée pour analyser les changements dans le transport intracellulaire à la BHE entre cerveau différentes régions18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig1.jpg"> 
Figure 1 : Etiquetage des plusieurs types de cellules et des structures subcellulaires de la neurovasculaire unité Images représentatives de l’unité neurovasculaire (A et D) et de vésicules intracellulaires contenus dans les neurones (B) ou de cellules endothéliales (E) obtenus avec ce protocole. L’image projetée en intensité maximale à A (haut) montre la répartition des astrocytes GFAP-positive (rouges) qui entourent les capillaires labellisés par le CollagenIV (verts). Flèches pointent vers des processus astrocytaires individuels. Echelle = 20 µm. Avec cette résolution, les processus individuels astrocyte et fin-pieds sont clairement visibles, comme illustré dans l’image zoomée de la région en boîte (en bas). Pointes de flèche pointent vers fin-pieds astrocytaires. Echelle = 10 µm. L’image b montre l’accumulation d’un anticorps injectés en périphérie, mAb86 (vert), au sein d’un neurone hippocampe. Pointes de flèche pointent vers les vésicules mAb86 positifs individuels. Echelle = 10 µm. Le graphique en C indique l’intensité de profil de ligne d’une vésicule simple. La vésicule a été estimée de la pleine largeur à mi-hauteur d’un ajustement gaussien (ligne noire épaisse) de la courbe d’intensité (ligne verte et des cercles). Les images d montrent une reconstruction tridimensionnelle d’une cellule endothéliale (verte) entourée d’un pericyte (rouge) au sein de la couche basale (CollagenIV, gris). Les panneaux inférieurs montrent les canaux individuels de fluorescence. Echelle = 10 µm. Les images en E montrent la localisation du mIgG (rouge) dans les vésicules intracellulaires dans les cellules endothéliales (panneau, CD31 en vert à gauche) mais pas en péricytes (panneau de droite, CD13 en vert). Dans toutes les images, DAPI teinté noyaux sont indiqués en bleu. Echelle = 5 µm. panneaux D et E ont été modifiés de référence17. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig2.jpg"> 
Figure 2 : Rendu tridimensionnel des capillaires et des vésicules intracellulaires à la barrière hémato - encéphalique. Avec le protocole décrit, haute résolution images confocales de capillaires CollagenIV séropositifs (verts) et de la souris IgG vésicules intracellulaires (rouge) ont été acquises (A). Le panneau de gauche montre une coupe optique unique avec les coupes. Les flèches pointent vers les vésicules mIgG positifs individuels dans les cellules endothéliales du cerveau. Le groupe d’experts sur la reconstruction de droite montre la 3D de la z-pile complète à l’aide logiciel de traitement d’image (voir la Table des matières). Le volume capillaire (B) et des vésicules (C) ont été rendus en trois dimensions et quantifiées à l’aide de logiciels de traitement d’image (voir la Table des matières). Dans toutes les images, DAPI teinté noyaux sont indiqués en bleu. Barreaux de l’échelle = 5 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig3.jpg"> 
Figure 3 : Quantification de la localisation intracellulaire mIgG à la BHE. Les images représentatives démontrant reconstructions tridimensionnelles (A) des capillaires (étiquetés avec collagenIV, vert) et la distribution de mIgG (rouge) chez les souris C57BL/6 et pdgf-bret/ret pericyte appauvri souris précédemment décrits dans19. Barreaux de l’échelle = 10 µm. Les images b montrent la segmentation des vésicules intracellulaires dans le masque de CollagenIV. Thgraphique de e à B présente la quantification et la comparaison du nombre de vésicules mIgG par volume capillaire. Chaque point représente les mesures des segments individuels de capillaires. La ligne continue indique la moyenne et les barres d’erreur représentent l’écart type des données. Les images du spectacle C le mIgG signal de fluorescence à l’extérieur du masque de CollagenIV. De même, le graphique en C montre la quantification et la comparaison de l’intensité de fluorescence mIgG dans le parenchyme du cerveau entre les souris C57BL/6 et le pdgf-bret/ret pericyte appauvri souris. Unités d’intensité de fluorescence ont été normalisées par l’intensité de parenchyme mIgG moyenne mesurée dans toutes les souris C57BL/6. Ce chiffre a été modifié par référence17. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Nous présentons ici un protocole microscopie d’imagerie à haute résolution et une reconstruction tridimensionnelle de la souris, unité neurovasculaire et la barrière hémato - encéphalique, en utilisant des sections flottant de cerveau. Cette méthode permet la visualisation, l’analyse et quantification des organites intracellulaires à la BHE.

Imagerie confocale à haute résolution de la barrière hémato - encéphalique : imagerie, Reconstruction 3D et la Quantification de la transcytose

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

L’objectif global de cette méthode est de fournir un protocole basé sur la microscopie pour l’imagerie à haute résolution et la reconstruction tridimensionnelle de la barrière hémato-encéphalique de la souris. Il combine l’immunofluorescence de sections flottantes avec la microscopie confocale pour analyser les organites subcellulaires dans les cellules endothéliales du cerveau. Cette méthode permet d’apprendre la préparation de coupes flottantes cérébrales, la coloration par immunofluorescence, l’acquisition d’images et les paramètres d’analyse pour la microscopie à haute résolution de la barrière hémato-encéphalique. Le principal avantage de la technique est qu’elle permet de quantifier les organites subcellulaires au sein des cellules de l’unité neurovasculaire. La démonstration de la procédure sera assurée par Roberto Villase

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