Name: Images en direct de la protéine GLUT4 traite des neurones hypothalamiques primaire de souris au microscope de déconvolution (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Découvrez l'imagerie en direct du trafic de GLUT4 dans les neurones hypothalamiques primaires de souris par microscopie de déconvolution. Cette méthode révèle les mécanismes de signalisation insulinique et le rôle du CCR5.

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Nous sommes reconnaissants pour les subventions accordées par le ministère de la Science et la technologie, Taiwan - MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3), de santé et de bien-être en supplément des produits du tabac - MOHW106-SAB-B-212-144001 à S-Y C.

Tous les protocoles et les méthodes utilisées dans les matières animales ont été approuvés par animalier institutionnel et utilisation comités (IACUC) de l’Université de médecine de Taipei (numéros de protocole : LAC-2013-0278 ; LAC-2015-0397)
1. premier neurone Culture
<ol><li>Préparation avant la culture
	<ol>
<li>Enduisez le Pétri avec poly-D-Lysine (tableau 1) un jour avant la culture. Pour un plat de 6 puits, ajouter 1,5 mL poly-D-Lysine (0,05 mg/mL) dans chaque puits. Pour vivre d’imagerie, les cellules de culture sur une lamelle de 12 x 12 mm en standard une plaque 6 puits.</li>
		<li>Supprimer/recycler la poly-D-lysine et laver la vaisselle deux fois avec 2 mL FD2O.</li>
		<li>Préparer les outils chirurgicaux : une paire de ciseaux micro-dissection, pinces à pointe courbée et pinces de pointe droite standard. Stériliser les instruments chirurgicaux et conservez-les dans de l’éthanol 75 % pendant la chirurgie.</li>
		<li>Remplir les plats de Pétri de 10 cm avec 20 mL de milieu de lavage (tableau 1) et de garder sur la glace.</li>
		<li>Remplir un tube de 15 mL avec 15 mL de milieu de lavage et maintenir le tube sur la glace.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolement de tissu de cerveau de différentes régions du cerveau
	<ol>
<li>Sacrifier les souris femelles enceintes 16-19 jour vieux avec des protocoles standard euthanasie en plaçant des souris en cage sans aération et puis enivrantes de CO2. E15.5 ~ E16.5 embryons sont recommandés pour la culture de neurones hypothalamique et E16.5 ~ E17.5 sont plus adaptés à la culture neuronale hippocampique et corticale.</li>
		<li>Stérilisez la plate-forme, microscope à dissection et outils de chirurgie avec 75 % d’éthanol pour éviter la contamination.</li>
		<li>Couper autour de la zone du cordon ombilical (zone rouge sombre, Figure 1 a, 1 b ligne du tableau de bord) pour isoler les chiots facilement sans les abîmer (Figure 1, 1D).</li>
		<li>Retirer la tête de chaque chiot avec une paire de ciseaux (Figure 1E, F), puis fixez la partie tête à l’aide de la pince droite pointe fine pour la région de le œil (Figure 1). Utiliser qu'une autre pointe fine courbé pinces pour enlever le revêtement extérieur et le crâne des deux côtés et les décoller de la partie antérieure de la direction de dorsale (Figure 1 H, noir flèche pointe vers la direction). Le cerveau doit être isolé sans aucun dommage (Figure 1I). Remarque : Il est essentiel de maintenir l’intégrité du cerveau pour assurer l’exactitude lors de l’isolement des différentes régions du cerveau.</li>
		<li>Garder cerveau isolé dans une propre Pétri avec support glacé de lavage pour les étapes suivantes.</li>
		<li>Retourner le cerveau et garder la face ventrale vers le haut. L’hypothalamus est une structure ronde au milieu du cerveau (Figure 1J, flèche pointe vers la région hypothalamique). Isoler le tissu hypothalamique avec une pince courbée à pointe fine. Supprimer les méninges (qui ont une couleur rouge-jaunâtre) avec soin. ATTENTION : L’élimination complète des méninges est une étape cruciale pour éviter la contamination des fibroblastes.</li>
		<li>Tenez le lobe olfactif avec la pince forte et décollez les minces méninges entourant le cerveau entier avec la pince courbée (Figure 1, K, L).</li>
		<li>L’hippocampe est une forme de banane qui est incorporée dans la partie inférieure du cortex. Retourner à la partie inférieure du cortex et l’hippocampe séparer le cortex en tirant sur le côté avec la pince courbée (Figure 1, MN et O). N’oubliez pas de supprimer tous les méninges restantes entourant le tissu cérébral.</li>
		<li>Lorsque toutes les régions du cerveau ont été isolées, hacher ces tissus dans les tubes de 15 mL contenant le support de lavage glacé avec l’aide de la pince (étape 1.1.5). Remarque : Les tissus cérébraux peuvent être maintenus dans le milieu de lavage glacée pendant 2-3 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Culture, de placage et de digestion de tissu
	<ol>
<li>Rincer les tissus en renversant le tube de 15 mL de tissu contenant 2 ou 3 fois et puis garder le tube de droite pour permettre les tissus se calment (1-3 min).</li>
		<li>Retirez le support supérieur à l’aide de la pipette Pasteur en verre lié à un système de vide. Pour laver les tissus, ajouter 15 mL de milieu de lavage à froid glace et inverser le tube 2 - 3 fois. Répétez les étapes de lavage 3 fois avant l’étape suivante. ATTENTION : Méfiez-vous des tissus sur le fond lorsque vous retirez le support supérieur à l’aide d’un système déprimogène.</li>
		<li>Après le lavage final, retirez le support de lavage à l’aide d’une pipette de 1 mL.</li>
		<li>Incuber les tissus avec tampon de digestion de papaïne-trypsine (tableau 1) dans un bain-marie à 37 ° C pendant 7-14 min. Shake les tubes toutes les deux minutes pour s’assurer que tous les tissus sont correctement exposés vers le tampon de la digestion. NOTE : Temps d’Incubation et le volume de tampon de digestion peuvent être réglés selon la taille du tissu. Pour tissu hypothalamique prélevé dans 6-8 petits, 300 µL papaïne-trypsine digestion tampon et 7 min temps d’incubation est recommandé. Plus de tissu nécessitera plus tampon de digestion.</li>
		<li>Neutraliser l’activité de l’enzyme en ajoutant 1 volume de sérum de veau fœtal. Agiter le tube à essai 3 - 5 fois à la température ambiante.</li>
		<li>Maintenir le tube sur les paniers et attendre 1-2 min permettre les tissus se sédentariser ; Retirez le surnageant soigneusement avec une pipette de 1 mL.</li>
		<li>Ajouter 6 mL d’électrodéposition moyen (tableau 1) dans le tube à essai et pipette le tissu va-et-vient 50 fois avec une pipette de 5 mL doucement (pour une plaque 6 puits, 1,5 mL de milieu de placage / puits est recommandée). La plupart des cellules vont se dissocient en cellules individuelles après plusieurs pipetage. NOTE : Essayez d’éviter la formation de bulles lors de cette étape. Plupart des laboratoires permet de dissocier le tissu verre flambé pâturage pipettes. Une pipette de 5 mL avec un embout étroit peut être une bonne alternative pour cette étape.</li>
		<li>Garder un tube sur la grille et attendre 1-2 min permettre les tissus chunky, non dissociées se sédentariser. Prendre la phase supérieure contenant dissociée des cellules dans un nouveau tube et diluer avec placage medium (5 x médium placage volume par volume 1 x des cellules dissociées. Par exemple, ajouter 5 mL moyen pour les cellules 1 mL dissocié de placage).</li>
		<li>Calculer la densité des cellules à l’aide d’un hémocytomètre et le nombre requis de cellules des graines dans la plaque de culture recouverte de poly-D-lysine comme au point 1.1.1. Nous vous recommandons 2-4 x 105 cellules / puits pour un plat de 6 bien plat/35 mm ont été recommandées pour le neurone études d’imagerie. Une densité plus élevée serait nécessaire pour la collecte de la protéine et l’analyse. Remarque : N’ajoutez pas trop moyen d’électrodéposition, 1 à 1,5 mL de milieu de placage dans un plat de 6 puits est suffisante pour la fixation. Une quantité excessive de médium prolongera le délai nécessaire à la fixation des cellules appropriées.</li>
		<li>Attendez 2-3 h et vérifier les neurones ensemencées au microscope. Neurones commencera à croître névrite quand ils attachent correctement.</li>
		<li>Enlever le support de l’électrodéposition et ajouter 2 mL chauffé lavage moyen (37 ° C) dans le plat à laver le médium placage. Répéter cette étape deux fois.</li>
		<li>Ajouter 2 mL milieu de culture complet (tableau 1) dans chaque puits dans le plat de 6 puits.</li>
		<li>La moitié du milieu change tous les 3-4 jours. Préparer le milieu complet fraîchement chaque fois. Neurones cultivés de régions du cerveau de souris différents auront différente morphologie et caractéristiques (Figure 2).</li>
	</ol></li>
</ol>2. la transfection d’ADN plasmidique dans primaire neurone avec système de Liposome
ATTENTION : Pour la transfection de neurone, un kit de purification d’ADN plasmide exempte d’endotoxine (Table des matières) est recommandé pour la préparation de l’ADN. Précipitation d’éthanol supplémentaire peut supprimer les excès de solvant et améliore la concentration d’ADN.
<ol><li>
Transfection d’ADN axée sur les liposomes dans des neurones primaires. NOTE : Le temps de transfection dépend de l’état de maturation requis dans les expériences. Les neurones hypothalamiques ont été transfectées à DIV 7-10 (jours in vitroDIV).<ol>
<li>L’ADN : Préparation Liposome mélange : diluer GFP-GLUT4 plasmide ADN16 (2 µg) dans une micro-centrifugeuse tube de milieu de culture contenant du 300 µL sérique. Préparer un autre tube de microcentrifuge avec 2 liposome µL de milieu de culture de 300 µL sérique et incuber pendant 5 min à température ambiante.</li>
		<li>Combiner le contenu de deux tubes et incuber pendant 20-30 min à température ambiante.</li>
		<li>Enlever le milieu de culture de neurone de la boîte de Pétri. Ajouter le mélange de l’ADN-liposome 600 µL dans chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 4 à 6 h.</li>
		<li>Après 4 à 6 h, retirez le mélange de l’ADN-liposome et ajouter 2 mL de milieu de culture.</li>
		<li>Des signaux fluorescents, comme seul GFP et protéine GLUT4 conjugué avec étiquette GFP (Figure 3 et Figure 4), peuvent être observées après 18 à 72 heures.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. enregistrement d’images en direct
<ol><li>
Préparation des cellules pour vivent d’imagerie
	<ol>
<li>WT et CCR5- / - neurones hypothalamiques cellules exprimant la protéine de fluorescence verte étiquetée transporteur de glucose 4 (GFP-GLUT4) sur le #1.5 (ou 0,17 mm d’épaisseur) la culture lamelle de verre qui ont été recouvert de poly-D-Lysine à l’étape 1.1.1 dans le puits de 6 plaque.</li>
		<li>Soigneusement, enlever le couvre-objet avec les neurones avec une pincette et placez-la sur les lames de verre avec prudence.</li>
		<li>Retirez le médium/le liquide en excès avec la tâche délicate de lingettes. Plier les lingettes deux fois et placez-les délicatement sur le dessus de la lamelle. Appuyer doucement les lingettes sans déplacer la lamelle. ATTENTION : N’appuyez pas sur la lamelle couvre-objet contre la lame de verre avec force. Cette étape vise à s’assurer que la lamelle ne pas déplacer/dérive lors de l’acquisition d’image causée par la force de flottabilité.</li>
		<li>Placez correctement lamelles couvre-objet et glisse sur la platine du microscope déconvolution, avec le couvre-objet face vers le bas et sécurisé. Cette étape consiste à s’assurer que la position reste constante, afin que les utilisateurs peuvent suivre le même ensemble de cellules cibles plus tard.</li>
		<li>Observer les WT et CCR5- / - neurones hypothalamiques cellules avec un x 60 / 1,42 NA huile d’immersion objectif.</li>
		<li>Traiter les échantillons de la cellule sélectionnée avec CCL5 (10 ng/mL) ou de l’insuline (10 U/mL) pour un min. Ajouter 1,5 µL d’insuline dilué sur le bord de la lamelle couvre-objet.</li>
		<li>Visualiser et enregistrer les échantillons de la cellule sélectionnée immédiatement. Programmer le logiciel d’enregistrement vidéo pour enregistrer pendant 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Déconvolution microscopie et analyse Remarque : Cette partie du protocole exige l’utilisation d’un microscope de déconvolution et des logiciels spécialisés pour l’analyse.<ol>
<li>Mettre en marche le système d’imagerie, permettre la platine du microscope initialiser correctement, puis tournez sur la source de lumière LED.</li>
		<li>Ajoute huile d’immersion (indice de réfraction 1.520 pour des échantillons vivants à 37 ° C) sur un objectif de 60 x 1,42 NA. Placer la lame de l’échantillon sur le microscope avec la lamelle orienté vers l’objectif et fixer la lame correctement.</li>
		<li>Éclairement lumineux-zone ou la fluorescence permet d’identifier les cellules cibles. Ajuster le focus jusqu'à ce que les cellules cibles sont clairement observables. Ne pas déplacer la lentille de l’objectif en dehors de la zone de la lamelle couvre-objet pour éviter les rayures inutiles.</li>
		<li>Identifier vert protéine fluorescente conjugué 4 transporteur de Glucose (GLUT4-GFP) par le signal GFP. Identifier les cellules cibles souhaitées pour l’acquisition d’images. Position de cellule cible sélectionné peut être mémorisée pour référence ultérieure (Figure 4).</li>
		<li>Configuration des paramètres expérimentaux appropriés (y compris le nombre de pixels, onde d’excitation, pourcentage de transmission, temps d’exposition, pile d’une épaisseur, intervalle de temps et temps d’imagerie total) sur chaque cellule cible. Dans cette expérience, le nombre de pixel d’image était fixé à 512 x 512 (il peut être fixé à 1 024 x 1 024 pour une résolution plus élevée) pour les signaux GFP. Le temps d’exposition a été mis entre 0.025 à 0,05 s pour chaque 5 min. mineur latérale x, y et ajustements z peut être contrôlé par le logiciel recommandé ( Tabledematières ).</li>
		<li>Définissez le paramètre d’exposition à environ 2 000 à 3 000 chefs d’accusation pour atteindre l’intensité des pixels maximum. Pour minimiser le photoblanchiment de fluorescence, réduire le pourcentage de la transmission de lumière d’excitation autant que possible alors que l’exposition de maintien de temps inférieure à 1 s. répéter ces étapes pour chaque canal/canaux fluorescence supplémentaire et chaque zone d’intérêt.</li>
		<li>Fixer la limite supérieure et inférieure de la Z-pile sur chaque cellule cible. Ceci peut être réalisé en déplaçant la platine du microscope jusqu'à ce que le haut et le bas de la cellule cible sont à la fois légèrement floue. Les utilisateurs peuvent ajuster la résolution de l’axe z, en définissant le nombre d’images entre la limite supérieure et inférieure (qui peut être fait en réglant la distance entre chaque image).</li>
		<li>Piles d’images ont été deconvolved et plus tard analysés à l’aide du logiciel respectif – vitesse de PerkinElmer en l’espèce.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La capacité de contrôler des cellules vivantes, par stimulation de CCL5 ou de l’insuline, est extrêmement importante pour l’étude de l’effet rapide du CCL5 ou de l’insuline sur mouvement GLUT4. En fait, il nous permet de visualiser la différence significative entre les versions WT et CCR5 neurones hypothalamiques- / - après stimulation par l’insuline. Nous avons effectué l’étiquetage surface des protéines endogènes GLUT4 WT et CCR5 neurones hypothalamiques- / - à des moments différents après stimulation de l’insuline17. Le marquage des protéines de surface cellulaire nécessite haute spécificité anticorps avec faible bruit de fond. En outre, quantification de la fluorescence de surface peut également être difficile et fastidieux. Ainsi, Time-lapse enregistrement nous permet d’être certain que l’effet de la CCL5 ou l’insuline est un vrai changement physiologique issu des conditions expérimentales, et non une variation statistique. Avec surface de marquage de GLUT4 endogène, nous fournissons des preuves solides et expériences pour démontrer comment CCL5 et CCR5 participent à GLUT4 translocation et signalisation de l’insuline.
En biologie cellulaire moderne et des études de biologie moléculaire, de nombreuses expériences nécessitent l’utilisation de la microscopie de fluorescence. Cette technologie permet aux scientifiques de visualiser les relations spatiales entre les protéines et/ou des organites cellulaires, en plus de la direction du mouvement et vitesse, effets stimulants, des changements morphologiques et traite des protéines. Cependant, cette technologie a encore ses limites : lorsque les fluorophores sont excités, les signaux émis par la protéine cible (ou zone) peuvent être accablé par fluorescence de fond. En conséquence, images de fluorescence peuvent apparaître flous avec signaux attendus enterrés profondément dans les signaux de fond. Ce phénomène est particulièrement évident pour l’observation des protéines membranaires.
Total interne réflexion Fluorescence Microscopy (TIRFM) a été mis au point pour surmonter cette difficulté. Il permet aux scientifiques de visualiser l’excitation des fluorophores sélectionnés de surface-bondissent sans affecter les fluorophores de fond. Il permet aux scientifiques caractériser sélectivement les fonctionnalités et les événements sur une région de surface très mince comme une membrane plasmique. La microscopie de déconvolution est une technique qui est rendue possible grâce aux avancées technologiques ces dernières années de traitement d’image par le calcul intensive. Il a été fréquemment utilisé pour améliorer la résolution des images numériques de fluorescence. Tel que mentionné précédemment, lorsque fluorophores sont été excitées par n’importe quel type d’éclairage (par exemple, laser ou LED), fluorochromes émet signaux lumineux sans se soucier si elles sont en discussion, ou non, donc l’image apparaîtra toujours floue. Ce flou est causée par un phénomène appelé « Point Spread Function » (PSF), comme la lumière provenant d’une petite source fluorescente (lueur d’espoir) sera étalé plus loin et devenir flou (blur). En principe, cet événement va produire un signal fluorescent en forme de sablier-like, et une image de fluorescence peut être composée de nombreux ces signaux lumineux. Le processus de déconvolution peut réattribuer tous les signaux de fluorescence à sa forme originale de spot lumineux et éliminer la plupart de la lumière d’out-of-focus pour améliorer le contraste de l’image.
Ces dernières années, les algorithmes de déconvolution ont généré des images avec une résolution comparable à celle d’un microscope confocal. En outre, par rapport à TIRFM, qui empêche out-of-focus flou d’être détecté par une région limitée excitation, microscopie à champ large permet de lumière tous les signaux pour être détectée et réaffecte leur retour à leur source à travers le processus de déconvolution. Par conséquent, dans la pratique, microscopie de déconvolution est devenu non seulement une méthode d’acquisition image plus efficace, mais aussi une méthode plus rentable par rapport à la microscopie FRBR.

Diabète de type 2 (T2DM) est une crise de santé mondiale. T2DM se caractérise par l’insuline signalisation déficience et une inflammation chronique dans les tissus périphériques. L’hypothalamus est le centre de contrôle qui régule l’homéostasie énergétique du corps, l’appétit et les rythmes circadiens. Plus important encore, l’hypothalamus est également le médiateur réactivité de signal de l’insuline pour réguler le métabolisme systémique1,2,3,4,5. Perturber l’insuline hypothalamique signalisation voie pouvait induire l’insuline résistance6,7. L’hypothalamus coordonne le statut d’énergie cellulaire et la sécrétion des hormones, comme l’insuline et les adipokines (p. ex., leptine) dans les tissus périphériques, pour réguler le métabolisme du glucose systémique, la réactivité de l’insuline et la prise alimentaire. Fixation de l’insuline pour le récepteur de l’insuline active l’insuline récepteurs substrat (IRS) des protéines qui puis activent molécules signalisation en aval d’insuline, tels que PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase) et AKT (protéine kinase B (PKB/AKT)), pour induire la GLUT4 translocation de la membrane. Les neurones ne sont pas la cible majeure pour la captation du glucose en réponse à l’insuline ; Cependant, des niveaux significatifs d’expression GLUT4 ont été identifiés dans la région de noyau arqué hypothalamique (ARC). Par conséquent, le règlement de GLUT4 dans les neurones hypothalamiques jouerait un rôle important dans la signalisation dans l’axe cerveau-périphérique d’insuline.
De nombreuses études ont suggéré que l’inflammation chronique et des chimiokines inflammatoires dans l’hypothalamus également jouent un rôle important dans le développement du diabète et l’obésité, et l’inhibition de l’inflammation hypothalamique peut inverser la résistance à l’insuline induite par l’alimentation 8 , 9 , 10. en outre, chemokine-CCL5 (ligand de motif C-C 5, également connu sous le nom de RANTES, Regulated-on-Activation-Normal-T-cell-Expressed-and-Secreted) et ses niveaux de récepteurs CCR5 également mettre en corrélation avec le développement de T2DM11,12. Les rôles de CCL5 et CCR5 dans le métabolisme de l’insuline glucose et fonction restent floues. Une étude a signalé que CCR5 carence protégeait les souris de l’inflammation induite par l’obésité, le recrutement de macrophages et insuline résistance11; en revanche, une autre étude indique que la carence CCR5 entrave systémique au glucose, ainsi que l’insuline musculaires et les adipocytes, signalisation12. CCL5 se trouve à augmenter l’absorption du glucose dans les cellules-T et à réduire la prise alimentaire par le biais de son action sur l’hypothalamus13,14, cependant, les deux le mécanisme d’action et les récepteurs impliqués doivent encore être identifiés.
Il est difficile d’étudier les mécanismes cellulaires qui sous-tendent l’effet d’une inflammation des tissus périphériques sur l’insuline fonctionne dans les neurones hypothalamiques. C’est en raison des réglementations de rétroaction circuit cellulaires hétérogénéité et neuron. Pour cette raison, un modèle de culture in vitro cellule fournit un modèle propre afin d’étudier les effets de la chimiokine sur règlement signal insuline hypothalamique. Bien qu’il y a que beaucoup à établir des lignes des neurones hypothalamiques immortalisés pour la recherche, ces lignées cellulaires ont exprimé différents marqueurs et représentent donc les différents types de neurones hypothalamiques15. Même si les cultures hypothalamiques primaires peuvent être difficiles à maintenir, ils peuvent fournir la réponse la plus réaliste des neurones hypothalamiques lors de la stimulation de l’insuline et peuvent également éviter le potentiel des effets inconnus qui entrent en jeu lors de la maintenance des cellules à long terme dans le milieu de culture avec des facteurs de croissance artificielles.
Dans les présentes, nous utiliser des neurones hypothalamiques primaires du CCR5 knockout (CCR5- / -) souris C57BL/6 souris de type sauvage (WT) et et transfecter les deux types de cellules avec GFP-GLUT4 construct. Afin d’étudier la contribution du CCR5 à insuline véhiculée par GLUT4 membrane traite, GFP-GLUT4 transfectées neurones ont été traités avec l’insuline ou CCL5 recombinante. Ensuite, nous caractériser le mouvement de GFP-GLUT4 sur la membrane plasmique dans des neurones hypothalamiques primaires avec la microscopie de déconvolution.

<table><tbody><tr><td>Microscope à déconvolution DeltaVision</td><td>Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science)&nbsp ;</td><td></td><td>équipé d’un objectif à immersion dans l’huile 60x/1,42 NA ; utilisé pour la prise d’images de cellules en direct</td></tr><tr><td>Logiciel d’application SoftWorX</td><td>Applied Precision Inc.</td><td></td><td>utilisé pour contrôler le microscope et la caméra</td></tr><tr><td>Logiciel VoloCITY</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>utilisé pour analyser les images</td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Actrapid, Danemark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liposome</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Lipofectamine&reg ; 2000, utilisé pour la transfection de l’ADN plasmidique</td></tr><tr><td>GFP contrôle l’ADN</td><td></td><td></td><td>plasmidique fourni par le professeur Samuel Cushman</td></tr><tr><td>ADN plasmidique GFP-GLUT4</td><td>fourni par le professeur Samuel Cushman</td>Anti-souris Alex-488 Invitrogen#A-11001 Anitbody secondaire Anti-lapin IgG -Alex-568 Invitrogen#A-11036 Anitbody secondaire CCL5/RANTES R&<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> D Systems</td><td>478-MR-025</td><td>10ng/ml</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>#FL42572A</td><td>0,17mm épaisseur</td></tr><tr><td>12 mm Couverture de microscope</td><td>Deckglaser</td><td>#41001112</td><td>utilisé pour l’étude de</td></tr><tr><td>micro-dissection de ciseaux de micro-dissection</td><td>Klappenecker</td><td></td><td>Outil chirurgical</td></tr> pince à <tr><td>pointe incurvée</td><td>Ideal-tek</td><td></td><td>Outil</td></tr> <tr><td>chirurgicalpince standard à pointe droite</td><td>Ideal-tek</td><td></td><td>Outil chirurgical</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td>Purify Endotoxin free plasmidique DNA</td></tr><tr><td>5 ml pipette</td><td>Corning costar&nbsp ;</td><td>4487</td><td>dissocier le tissu cérébral</td></tr></tbody></table>

images en direct de la protéine glut4 traite des neurones hypothalamiques primaire de souris au microscope de déconvolution

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Diabète de type 2 (T2DM) est une crise de santé mondiale qui se caractérise par l’insuline signalisation déficience et une inflammation chronique dans les tissus périphériques. L’hypothalamus dans le système nerveux central (SNC) est le centre de contrôle de l’énergie et l’insuline signal réponse règlement. Inflammation chronique des tissus périphériques et des déséquilibres de certaines chimiokines (comme CCL5, TNFα et IL-6) contribuent à l’obésité et de diabète. Cependant, les mécanismes fonctionnels reliant chimiokines et règlement de signal insuline hypothalamique encore demeurent incertains.
Modèles de culture in vitro neurone primaires sont modèles simples et pratiques qui peuvent être utilisées pour étudier les règlement de signal de l’insuline dans les neurones hypothalamiques. Dans cette étude, nous avons introduit exogènes GLUT4 protéine conjuguée avec GFP (GFP-GLUT4) dans les neurones hypothalamiques primaires pour suivre la translocation de membrane GLUT4 lors de la stimulation de l’insuline. Time-lapse images du trafic de la protéine GFP-GLUT4 ont été enregistrées par microscopie de déconvolution, qui permettait aux utilisateurs de générer des images à grande vitesse et à haute résolution sans endommager les neurones significativement tandis que mène l’expérience. La contribution de CCR5 dans la translocation de GLUT4 insuline réglementée a été observée chez neurones hypothalamiques déficients CCR5, qui ont été isolées et cultivées de souris knock-out CCR5. Nos résultats démontrent que l’efficacité de la translocation de membrane GLUT4 est réduite dans les neurones hypothalamiques déficients CCR5 après stimulation par l’insuline.

Les neurones hypothalamiques cultivés de souris ont été encore identifiés par immunomarquage à protéines associées aux microtubules de hypothalamique protéine spécifique - pro-opiomélanocortine (POMC) anticorps et marqueur neuronal - 2 (MAP2) (Figure 2 a). Nous avons confirmé que les neurones hypothalamiques en culture primaire exprimé hypothalamique protéine POMC. L’expression du récepteur CCR5 et CCL5 dans les neurones hypothalamiques ont été identifiées avec des anticorps spécifiques et étiquetés conjointement avec anticorps POMC (Figure 2 a, 2 b).
Après 3 jours de culture, les neurones ont été transfectées avec GFP ADN (Figure 3) ou GFP conjugué GLUT4 (Figure 4). Expression de la GFP peut habituellement être trouvée partout que la cellule sans un modèle spécifique (Figure 3) mais la GLUT4-GFP exprimera comme une structure ponctuée dans le cytosol (Figure 4). Le kit de transfection utilisé dans cette étude n’est pas la méthode la plus efficace pour la transfection de neurone ; Cependant, c’est une méthode moins rigoureuse pour la survie des cellules mieux après la transfection, qui contribue à mieux vivre-cellule imagerie/enregistrement plus tard. Les images des neurones exprimant GFP-GLUT4 ont été prises avant les films Time-lapse (Figure 4 a-B, supplémentaire 1 vidéo, 2) après stimulation par l’insuline ou la stimulation CCL5 (Figure 4, 3 vidéo supplémentaire). Les signaux de GFP et GFP-GLUT4 sont claires et fortes dans les neurones.
Des neurones hypothalamiques avec transfection GLUT4-GFP ont été plus traités par insuline (40 U) pour caractériser le trafic de GFP-GLUT4. Vidéos représentative du mouvement GLUT4-GFP lors de la stimulation de l’insuline dans les WT et CCR5- / - les neurones hypothalamiques sont montrés comme vidéo 1 et vidéo 2, respectivement.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56409/56409fig1.jpg"> Figure 1 : isolement des tissus provenant de différentes régions du cerveau de souris au stade embryonnaire (jour 16,5). (A-D) Les étapes de la séparation des petits du placenta. (E, F) La dissection d’une tête de chiot de l’organisme. (G-I) Les étapes de l’isolement de tout le cerveau du crâne. La flèche noire dans le sens d’être tiré tout en retirant le crâne avec une pincette. (J) l’isolement de l’hypothalamus. La flèche noire pointe vers la région hypothalamique entre les pinces. (K-L) Isolement du cortex du cerveau de souris. L’astérisque noir indique la région corticale du cerveau de la souris et la flèche blanche à la séparation du cortex du cerveau entier. (M-O) La séparation de la partie hippocampique du cortex. La flèche blanche du haut marque le tissu hippocampique et la flèche inférieure blanche marque le tissu cortical. Barreaux de l’échelle = 1 cm (A-F), 200 µm (G.-O.). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/56409fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56409/56409fig2.jpg"> Figure 2 : caractérisation des hypothalamique marqueur neuronal - POMC et la co-expression de CCL5 et CCR5. (A) des neurones hypothalamiques cultivés primaires sont marquées avec le marqueur neuronal hypothalamique - POMC (rouge), la co-expression de CCR5 (vert) et le neurone marqueur MAP2 (gris). (B), le CCL5 (vert) expression dans les neurones hypothalamiques positives POMC (rouge) (adapté des données supplémentaires de référence17). Ici, le DAPI étiqueté le noyau avec la couleur bleue. Barreaux de l’échelle = 50 µm dans (A) et (B). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/56409fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56409/56409fig3.jpg"> Figure 3 : expression de la protéine GFP dans des neurones de souris primaire. L’ADN plasmidique GFP transfectés dans des neurones en culture primaire après culture de 4 jours (DIV4) avec liposome et exprimé pour encore 3 jours (DIV7). (A-B) GFP est exprimée dans les névrites et soma. (C-D) Neurones avec maquette transfection ; DAPI étiqueté le noyau (B, D). Barreaux de l’échelle = 100 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/56409fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56409/56409fig4.jpg"> Figure 4 : les instantanés de GFP-GLUT4 dans les neurones hypothalamiques. (A, C) Protéine GFP-GLUT4 exprimés dans les neurones hypothalamiques type sauvage (WT) et (B) CCR5- / - neurones hypothalamiques. Neurones ont été stimulés par l’insuline (A, B) ou CCL5 (C). Les flèches pointent vers la GFP-GLUT4 ponctuée dans la névrite avant (-) et après (+) l’insuline ou la stimulation CCL5 et astérisques pointent vers la surface GLUT4-GFP avant (-) et après (+) la stimulation CCL5 en (C). (Adaptée de référence17la figure). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/56409fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>5 x tampon boumendil</td>
			<td>Compagnie</td>
			<td>Numéro de catalogue</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acide borique</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td>1,55 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Borax</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71997</td>
			<td>2,375 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Filtrée, conserver à 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 x stock de Poly-D-Lysine</td>
			<td>Compagnie</td>
			<td>Numéro de catalogue</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Filtrée, conserver à-20 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 x Poly-D-Lysine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 x Poly-D-Lysine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 x tampon boumendil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>75 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Total</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Conserver à 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Support de lavage</td>
			<td>Compagnie</td>
			<td>Numéro de catalogue</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM-High glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12800-017</td>
			<td>495 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antibiotique-Antimyotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Total</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Conserver à 4° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampon de papaïne-trypsine de digestion :</td>
			<td>Compagnie</td>
			<td>Numéro de catalogue</td>
			<td>Concentration du volume/Final</td>
		</tr>
<tr>
<td>Papaïne (10 mg/mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4762</td>
			<td>200 µL (2 mg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>La trypsine-EDTA (0,25 %)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-072</td>
			<td>200 ΜL (0,05 %)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Support de lavage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>600 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Total</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 000 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Conserver à-20 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Moyen de placage :</td>
			<td>Compagnie</td>
			<td>Numéro de catalogue</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>Neurobasal moyen</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>176 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sérum de veau fœtal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamate (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antibiotique-Antimyotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Total</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>200 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Conserver à 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Milieu de culture complet</td>
			<td>Compagnie</td>
			<td>Numéro de catalogue</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>Neurobasal moyen</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>95 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Supplément de N2 (x 100)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Supplément de B27 (x 50)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-04</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamate (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antibiotique-Antimyotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Total</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fraîchement préparés</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Digestion tampon et médias composition utilisée dans cette étude.
Vidéo supplémentaire 1 : L’insuline stimulée par le mouvement de GFP-GLUT4 dans les neurones hypothalamiques WT. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/JoVE-Video-1.mov">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Vidéo supplémentaire 2 : L’insuline stimule mouvement GFP-GLUT4 CCR5- / - neurones hypothalamiques. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/JoVE-Video-2.mov">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Vidéo supplémentaire 3 : CCL5 a stimulé le mouvement GFP-GLUT4 dans les neurones hypothalamiques WT (Vidéo adapté de référence17). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/JoVE-Video-3.mov">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>

Ce protocole décrit une technique pour l’observation des temps réel Green Fluorescence Protein (GFP) tag protéines 4 transporteur de Glucose (GLUT4) après stimulation par l’insuline et la caractérisation du rôle biologique de CCR5 dans l’insuline – GLUT4 voie avec la microscopie de déconvolution de signalisation.

Images en direct de la protéine GLUT4 traite des neurones hypothalamiques primaire de souris au microscope de déconvolution

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

L’objectif global de cette expérience est d’observer le trafic de protéines en temps réel dans les cellules neuronales primaires telles que GLUT4 dans les neurones hypothalamiques avec un minimum de dommages. Cette méthode peut expliquer des questions clés liées à la régulation neuronale de la signalisation de l’insuline et du métabolisme, comme dans le cas du diabète sucré de type 2. Le principal avantage de cette technique est que les chercheurs peuvent isoler des cultures de cellules primaires et observer l’effet induit par le médicament en temps réel.L’implication de cette technique est de choisir une thérapie du diabète de type 2 ou de la résistance à l’insuline liée au cerveau, car nous savons maintenant comment ce signal d’insuline est altéré par la chimiokine CCL5 dans les neurones hypothalamiques. Pour commencer cette procédure, enduisez les boîtes de culture avec de la lysine poly-D un jour avant la culture. Pour une parabole à six puits, ajoutez 1,5 mL de lysine poly-D à raison de 0,05 mg/mL dans chaque puits.Le lendemain, retirez la lysine poly-D et lavez la vaisselle deux fois avec 2 mL de ddH2O. Remplissez ensuite les boîtes de Pétri de 10 cm avec 20 ml de produit de lavage et conservez-les sur de la glace. Remplissez les tubes de 15 ml de produit de lavage et conservez-les sur de la glace.Pour isoler les tissus cérébraux, stérilisez la plate-forme, le microscope de dissection et les outils chirurgicaux avec de l’éthanol à 75 % pour éviter toute contamination. Après cela, coupez autour de la zone du cordon ombilical pour isoler les chiots sans les endommager. Ensuite, retirez la tête de chaque chiot et fixez-la en place à l’aide de la pince droite à pointe fine.À l’aide d’une autre pince incurvée à pointe fine, vous pouvez retirer la peau externe et le crâne des deux côtés et les décoller de l’avant vers le dos. Ensuite, conservez les cerveaux isolés dans une boîte de Pétri propre avec un produit de lavage à froid glacé. Retournez le cerveau et gardez le côté ventral vers le haut.Par la suite, isolez le tissu hypothalamique à l’aide d’une pince incurvée à pointe fine. Tenez le lobe olfactif avec la pince pointue et décollez les fines méninges entourant tout le cerveau avec la pince incurvée. Retournez vers le dessous du cortex et séparez l’hippocampe du cortex en le tirant sur le côté.Lorsque toutes les régions du cerveau ont été isolées, hachez ces tissus dans les tubes de 15 ml contenant du produit de lavage à froid glacé. Dans cette procédure, rincez les tissus en inversant le tube contenant le tissu deux à trois fois. Ensuite, gardez le tube droit pour permettre aux tissus de se stabiliser.Retirez le milieu supérieur à l’aide de la pipette Pasteur en verre fixée à un système de vide. Pour laver le mouchoir, ajoutez 15 ml de produit de lavage glacé et retournez le tube deux à trois fois. Après le lavage final, retirez le produit de lavage à l’aide d’une pipette de 1 ml.Incuber les tissus avec le tampon de digestion Papain-Trypsine dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant sept à 14 minutes. Ensuite, neutralisez l’activité des enzymes en ajoutant un volume de sérum fœtal bovin. Gardez le tube sur une grille et attendez une à deux minutes pour permettre aux mouchoirs de se stabiliser.Ensuite, retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette de 1 ml. Ajoutez 6 ml de milieu de placage dans le tube à essai et pipetez le tissu de haut en bas 50 fois doucement avec une pipette de 5 ml. Gardez le tube sur le support et attendez une à deux minutes pour permettre aux tissus épais et non dissociés de se déposer.Ensuite, transférez la phase supérieure contenant les cellules dissociées dans un nouveau tube et diluez-la avec un milieu de placage. Ensuite, ajoutez 2 ml de milieu de culture complet dans chaque puits du plat à six puits. Pour préparer les cellules à l’imagerie en direct, retirez soigneusement les lamelles avec les neurones à l’aide d’une pince et placez-les sur la lame de verre avec précaution.Ensuite, retirez l’excès de support avec des lingettes délicates en les pliant deux fois et en les plaçant soigneusement sur la lamelle sans la déplacer. Il est essentiel d’enlever l’excès de fluide pour éviter tout mouvement inutile sur la lamelle. Ensuite, traitez les échantillons de cellules sélectionnés avec du CCL5 à 10 ng/mL ou de l’insuline à 10 unités/mL pendant une minute.Ensuite, ajoutez 1,5 mcL d’insuline diluée sur le bord des lamelles. Ensuite, ajoutez de l’huile d’immersion sur un objectif à 60 fois grossissement de 1,52 NA. Ensuite, placez les lamelles sur la platine du microscope à déconvolution avec les lamelles vers le bas et correctement fixées.Utilisez un éclairage en fond clair ou en fluorescence pour identifier les cellules cibles. Ensuite, ajustez la mise au point jusqu’à ce que les cellules cibles soient clairement observées. Ne déplacez pas l’objectif en dehors de la zone de recouvrement pour éviter les rayures inutiles.Ensuite, identifiez GFP-GLUT4 par le signal GFP. Identifiez ensuite les cellules cibles souhaitées pour l’acquisition d’images. Par la suite, définissez les paramètres expérimentaux appropriés sur chaque cellule cible, notamment le nombre de pixels, la longueur d’onde d’excitation, le pourcentage de transmission, le temps d’exposition, l’épaisseur de la pile, l’intervalle de temps et le temps total d’imagerie.Ajustez le paramètre d’exposition à environ 2000 à 3000 points pour obtenir une intensité de pixel maximale. Pour minimiser le photoblanchiment par fluorescence, réduisez autant que possible le pourcentage de transmission de la lumière d’excitation tout en maintenant le temps d’exposition inférieur à une seconde. Réglez les limites supérieure et inférieure de la pile Z sur chaque cellule cible en déplaçant la platine du microscope jusqu’à ce que le haut et le bas de la cellule cible soient tous deux légèrement flous.Il est très important de minimiser le photoblanchiment fluorescent dans la mort des neurones suite à l’image de la lumière. Cette figure montre que les neurones hypothalamiques primaires cultivés ont été marqués avec le marqueur neuronal MAP2. Le marqueur neuronal hypothalamique POMC et leur co-expression de CCR5.L’image co-localisée montre que CCL5 est exprimé dans les neurones hypothalamiques positifs au POMC. Ces images montrent l’expression de la protéine GFP-GLUT4 dans les neurones hypothalamiques de type sauvage et les neurones hypothalamiques double négatifs CCR5. Les neurones ont été stimulés avec de l’insuline ou du CCL5.Les flèches pointent vers le ponctué GFP-GLUT4 dans la névrite avant ou après la stimulation par l’insuline ou CCL5, et les astérisques indiquent la surface GLUT4-GFP avant ou après la stimulation CCL5. Une fois maîtrisé, cet enregistrement en laboratoire de la technique de la cellule primaire peut être effectué entre une et quatre heures, selon les exigences de l’expérience et s’il est fait correctement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer la possibilité de caractériser l’effet immédiat induit par le médicament dans la culture de cellules primaires.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler un neurone hypothalamique primaire, un neurone de l’hippocampe et un neurone cortical. En plus du laboratoire, vous pouvez également savoir comment effectuer un enregistrement en direct de la molécule en série lors de différentes stimulations. N’oubliez pas de mettre votre blouse de laboratoire et vos gants et d’utiliser fréquemment de l’éthanol pour éviter la contamination par des bactéries et des champignons d’animaux.Soyez également très prudent lorsque vous traitez des lamelles et des neurones tout au long de cette procédure.

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En marquant les domaines extracellulaires des récepteurs membranaires avec pHluorin superecliptic, et par imagerie par ces récepteurs de fusion dans les neurones de souris en culture, on peut directement visualiser les différents événements d'insertion vésiculaires des récepteurs à la membrane plasmique. Cette technique permet de contribuer à élucider les mécanismes moléculaires qui régissent l'insertion du récepteur à la membrane plasmique.

Imagerie pHluorin-étiqueté insertion du récepteur de la membrane plasmique dans les neurones primaires de souris en culture

Cette vidéo démontre une approche d’alimentation en anticorps pour étudier le trafic des récepteurs du glutamate dans les cultures neuronales primaires de l’hippocampe. Cette approche permet d’observer les populations de récepteurs à la fois au niveau du plasma et des membranes internes. La discrimination entre ces sous-ensembles est obtenue en marquant les récepteurs avant et après la perméabilisation membranaire, en utilisant le même anticorps primaire mais des anticorps secondaires conjugués...

Une technique in vitro pour étudier le trafic des récepteurs du glutamate dans les neurones de l’hippocampe

Cette vidéo démontre l’évaluation de la libération et de la clairance du glutamate au niveau de synapses corticostriatales uniques dans une tranche de cerveau de souris. La stimulation électrique facilite la libération de glutamate au niveau de la synapse. Le glutamate libéré modifie la fluorescence de la protéine du capteur, qui diminue avec le temps, indiquant l'efficacité de la libération et de l'élimination.

Analyse de la libération et de la clairance du glutamate au niveau d’une synapse d’un seul neurone dans une tranche de cerveau de souris

Source : Changou, C. A., et. al. Images en direct du trafic de la protéine GLUT4 dans les neurones hypothalamiques primaires de souris à l’aide de la microscopie à déconvolution. J. Vis. Exp. (2017). Cette vidéo présente l’imagerie de la translocation de GLUT4 induite par l’insuline dans les neurones hypothalamiques, en utilisant la microscopie à déconvolution pour capturer et analyser la dynamique de trafic GFP-GLUT4 avec une haute résolution.

Imagerie du trafic de la protéine GLUT4 dans les neurones hypothalamiques primaires de souris à l’aide de la microscopie à déconvolution

L'activité des neurones isolés à partir de souris adultes, âgées peut être étudiée en dissociant les neurones à partir de régions spécifiques du cerveau et en utilisant l'imagerie de colorant potentiel de membrane fluorescent. Par les réponses de test à des changements dans le glucose, cette technique peut être utilisée pour étudier la sensibilité au glucose des neurones hypothalamiques ventromédians adultes.

Potentiel de membrane Dye Imaging de ventromédian hypothalamus neurones de souris adulte à étudier Glucose Sensing

Nous présentons un protocole pour évaluer l’équilibre entre la libération de glutamate et le dégagement aux synapses glutamatergics corticostriatal simples dans des tranches aigues des souris adultes. Ce protocole utilise le capteur fluorescent iGluu pour la détection de glutamate, une caméra sCMOS pour l’acquisition du signal et un dispositif pour l’éclairage laser focal.

Indicateurs synapses uniques de la libération et de l’absorption des glutamates dans les tranches cérébrales aigues des souris normales et huntingtones

Ici, nous présentons un protocole pour mesurer in vitro Ca2 + flux dans les neurones midbrain et leurs effets en aval sur caspase-3 en utilisant les cultures primaires de la souris midbrain. Ce modèle peut être employé pour étudier les changements pathophysiologiques liés à l’activité anormale de Ca2+ dans les neurones midbrain, et pour dépister de nouvelles thérapies pour des propriétés anti-apoptotiques.

Quantification spontanée Ca2+ Fluxes et leurs effets en aval dans les neurones midbrains de souris primaires

L’imagerie in vivo est un outil puissant pour l’étude de la biologie dans la santé et la maladie. Ce protocole décrit l’imagerie transpupillaire de la rétine de la souris avec un microscope standard à deux photons. Il démontre également différentes méthodes d’imagerie in vivo pour marquer par fluorescence plusieurs cohortes cellulaires de la rétine.

Transpupillaire Imagerie in vivo à deux photons de la rétine de souris

Ici, nous démontrons comment combiner la transfection des neurones primaires de rongeurs de l’hippocampe avec l’imagerie confocale de cellules vivantes pour analyser les effets induits par les protéines pathologiques sur le transport axonal et identifier les voies mécanistes médiant ces effets.

Utilisation de l’imagerie de cellules vivantes pour mesurer les effets de protéines pathologiques sur le transport axonal dans les neurones primaires de l’hippocampe

Découvrez l'imagerie en direct du trafic de GLUT4 dans les neurones hypothalamiques primaires de souris par microscopie de déconvolution. Cette méthode révèle les mécanismes de signalisation insulinique et le rôle du CCR5.

Images en direct de la protéine GLUT4 traite des neurones hypothalamiques primaire de souris au microscope de déconvolution

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