Images en direct de la protéine GLUT4 traite des neurones hypothalamiques primaire de souris au microscope de déconvolution

L’objectif global de cette expérience est d’observer le trafic de protéines en temps réel dans les cellules neuronales primaires telles que GLUT4 dans les neurones hypothalamiques avec un minimum de dommages. Cette méthode peut expliquer des questions clés liées à la régulation neuronale de la signalisation de l’insuline et du métabolisme, comme dans le cas du diabète sucré de type 2. Le principal avantage de cette technique est que les chercheurs peuvent isoler des cultures de cellules primaires et observer l’effet induit par le médicament en temps réel.

L’implication de cette technique est de choisir une thérapie du diabète de type 2 ou de la résistance à l’insuline liée au cerveau, car nous savons maintenant comment ce signal d’insuline est altéré par la chimiokine CCL5 dans les neurones hypothalamiques. Pour commencer cette procédure, enduisez les boîtes de culture avec de la lysine poly-D un jour avant la culture. Pour une parabole à six puits, ajoutez 1,5 mL de lysine poly-D à raison de 0,05 mg/mL dans chaque puits.

Le lendemain, retirez la lysine poly-D et lavez la vaisselle deux fois avec 2 mL de ddH2O. Remplissez ensuite les boîtes de Pétri de 10 cm avec 20 ml de produit de lavage et conservez-les sur de la glace. Remplissez les tubes de 15 ml de produit de lavage et conservez-les sur de la glace.

Pour isoler les tissus cérébraux, stérilisez la plate-forme, le microscope de dissection et les outils chirurgicaux avec de l’éthanol à 75 % pour éviter toute contamination. Après cela, coupez autour de la zone du cordon ombilical pour isoler les chiots sans les endommager. Ensuite, retirez la tête de chaque chiot et fixez-la en place à l’aide de la pince droite à pointe fine.

À l’aide d’une autre pince incurvée à pointe fine, vous pouvez retirer la peau externe et le crâne des deux côtés et les décoller de l’avant vers le dos. Ensuite, conservez les cerveaux isolés dans une boîte de Pétri propre avec un produit de lavage à froid glacé. Retournez le cerveau et gardez le côté ventral vers le haut.

Par la suite, isolez le tissu hypothalamique à l’aide d’une pince incurvée à pointe fine. Tenez le lobe olfactif avec la pince pointue et décollez les fines méninges entourant tout le cerveau avec la pince incurvée. Retournez vers le dessous du cortex et séparez l’hippocampe du cortex en le tirant sur le côté.

Lorsque toutes les régions du cerveau ont été isolées, hachez ces tissus dans les tubes de 15 ml contenant du produit de lavage à froid glacé. Dans cette procédure, rincez les tissus en inversant le tube contenant le tissu deux à trois fois. Ensuite, gardez le tube droit pour permettre aux tissus de se stabiliser.

Retirez le milieu supérieur à l’aide de la pipette Pasteur en verre fixée à un système de vide. Pour laver le mouchoir, ajoutez 15 ml de produit de lavage glacé et retournez le tube deux à trois fois. Après le lavage final, retirez le produit de lavage à l’aide d’une pipette de 1 ml.

Incuber les tissus avec le tampon de digestion Papain-Trypsine dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant sept à 14 minutes. Ensuite, neutralisez l’activité des enzymes en ajoutant un volume de sérum fœtal bovin. Gardez le tube sur une grille et attendez une à deux minutes pour permettre aux mouchoirs de se stabiliser.

Ensuite, retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette de 1 ml. Ajoutez 6 ml de milieu de placage dans le tube à essai et pipetez le tissu de haut en bas 50 fois doucement avec une pipette de 5 ml. Gardez le tube sur le support et attendez une à deux minutes pour permettre aux tissus épais et non dissociés de se déposer.

Ensuite, transférez la phase supérieure contenant les cellules dissociées dans un nouveau tube et diluez-la avec un milieu de placage. Ensuite, ajoutez 2 ml de milieu de culture complet dans chaque puits du plat à six puits. Pour préparer les cellules à l’imagerie en direct, retirez soigneusement les lamelles avec les neurones à l’aide d’une pince et placez-les sur la lame de verre avec précaution.

Ensuite, retirez l’excès de support avec des lingettes délicates en les pliant deux fois et en les plaçant soigneusement sur la lamelle sans la déplacer. Il est essentiel d’enlever l’excès de fluide pour éviter tout mouvement inutile sur la lamelle. Ensuite, traitez les échantillons de cellules sélectionnés avec du CCL5 à 10 ng/mL ou de l’insuline à 10 unités/mL pendant une minute.

Ensuite, ajoutez 1,5 mcL d’insuline diluée sur le bord des lamelles. Ensuite, ajoutez de l’huile d’immersion sur un objectif à 60 fois grossissement de 1,52 NA. Ensuite, placez les lamelles sur la platine du microscope à déconvolution avec les lamelles vers le bas et correctement fixées.

Utilisez un éclairage en fond clair ou en fluorescence pour identifier les cellules cibles. Ensuite, ajustez la mise au point jusqu’à ce que les cellules cibles soient clairement observées. Ne déplacez pas l’objectif en dehors de la zone de recouvrement pour éviter les rayures inutiles.

Ensuite, identifiez GFP-GLUT4 par le signal GFP. Identifiez ensuite les cellules cibles souhaitées pour l’acquisition d’images. Par la suite, définissez les paramètres expérimentaux appropriés sur chaque cellule cible, notamment le nombre de pixels, la longueur d’onde d’excitation, le pourcentage de transmission, le temps d’exposition, l’épaisseur de la pile, l’intervalle de temps et le temps total d’imagerie.

Ajustez le paramètre d’exposition à environ 2000 à 3000 points pour obtenir une intensité de pixel maximale. Pour minimiser le photoblanchiment par fluorescence, réduisez autant que possible le pourcentage de transmission de la lumière d’excitation tout en maintenant le temps d’exposition inférieur à une seconde. Réglez les limites supérieure et inférieure de la pile Z sur chaque cellule cible en déplaçant la platine du microscope jusqu’à ce que le haut et le bas de la cellule cible soient tous deux légèrement flous.

Il est très important de minimiser le photoblanchiment fluorescent dans la mort des neurones suite à l’image de la lumière. Cette figure montre que les neurones hypothalamiques primaires cultivés ont été marqués avec le marqueur neuronal MAP2. Le marqueur neuronal hypothalamique POMC et leur co-expression de CCR5.

L’image co-localisée montre que CCL5 est exprimé dans les neurones hypothalamiques positifs au POMC. Ces images montrent l’expression de la protéine GFP-GLUT4 dans les neurones hypothalamiques de type sauvage et les neurones hypothalamiques double négatifs CCR5. Les neurones ont été stimulés avec de l’insuline ou du CCL5.

Les flèches pointent vers le ponctué GFP-GLUT4 dans la névrite avant ou après la stimulation par l’insuline ou CCL5, et les astérisques indiquent la surface GLUT4-GFP avant ou après la stimulation CCL5. Une fois maîtrisé, cet enregistrement en laboratoire de la technique de la cellule primaire peut être effectué entre une et quatre heures, selon les exigences de l’expérience et s’il est fait correctement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer la possibilité de caractériser l’effet immédiat induit par le médicament dans la culture de cellules primaires.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler un neurone hypothalamique primaire, un neurone de l’hippocampe et un neurone cortical. En plus du laboratoire, vous pouvez également savoir comment effectuer un enregistrement en direct de la molécule en série lors de différentes stimulations. N’oubliez pas de mettre votre blouse de laboratoire et vos gants et d’utiliser fréquemment de l’éthanol pour éviter la contamination par des bactéries et des champignons d’animaux.

Soyez également très prudent lorsque vous traitez des lamelles et des neurones tout au long de cette procédure.