Étudier le Signal hypothalamique de l’insuline à l’intolérance au Glucose périphérique avec un système de perfusion continue de drogues dans le cerveau de souris

L’objectif global de cette expérience est d’étudier le rôle de la signalisation hypothalamique C-C-L-5 dans la fonction de l’insuline dans le système périphérique et le métabolisme du glucose en manipulant la signalisation C-C-L-5 en administrant l’antagoniste Met-C-C-L-5 par le biais d’un système d’administration ventriculaire intercérébrale, la pompe micro-osmotique. Ce médicament peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la physiologie biochimique, telles que la chimiokine C-C-L-5 dans le contrôle du métabolisme du glucose corporel et la réponse à l’insuline dans le cerveau. Le principal avantage de cette mesure est que l’expérimentateur peut facilement manipuler certaines signaux dans le cerveau pendant un certain temps, comme le C-C-L-5 ici, sans effet compensatoire ni développer de trouble, ce qui se passe généralement lorsque nous faisons de la manipulation génétique chez les rongeurs.

La démonstration visuelle de cette procédure est importante car l’insertion d’une pompe micro-osmotique et la mesure précise de l’insuline et du taux de glucose dans le sang nécessitent des compétences et de la précision. Un jour avant l’opération, préparez des pompes micro-osmotiques pour le cerveau en utilisant une seringue d’un millilitre et une aiguille à tête émoussée pour remplir les pompes de liquide céphalo-rachidien artificiel, ou A-C-S-F. Ensuite, plongez la pompe dans A-C-S-F et placez-la sur un shaker pour une légère agitation pendant la nuit.

Le lendemain, retirez l’A-C-S-F de la pompe et remplissez-la complètement avec une solution médicamenteuse préalablement préparée diluée dans A-C-S-F jusqu’à ce que l’excès s’échappe. Ensuite, utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper les tubes du cathéter à la longueur souhaitée. À l’aide d’une aiguille de perfusion cérébrale à extrémité émoussée, fixez les tubes au kit de perfusion cérébrale.

Ensuite, remplissez les tubes du kit de perfusion avec la solution médicamenteuse. Après avoir assemblé le kit, fixez-le à la pompe micro-osmotique. Enfin, pour éviter que la pompe ne se dessèche, plongez le réglage de perfusion cérébrale de la pompe osmotique dans A-C-S-F dans un tube stérilisé de 50 millilitres.

Pour commencer la chirurgie, montez et fixez la tête d’une souris anesthésiée sur un appareil stéréotaxique. À l’aide d’une paire de ciseaux chirurgicaux et de pinces, coupez la peau externe recouvrant le crâne. Ensuite, utilisez de l’iode pour nettoyer le crâne périphérique.

Ensuite, utilisez une paire de ciseaux à tête émoussée près de la région du cou pour séparer la couche la plus externe de la peau de la peau sous-cutanée pour l’implantation de l’ensemble de fusion cérébrale de pompe osmotique. Utilisez l’appareil stéréotaxique pour marquer le point de perfusion par rapport à la carte cérébrale. Utilisez une perceuse à ongles pour percer un trou autour de la zone marquée sur le crâne, en faisant attention de ne pas casser les méninges et les vaisseaux sanguins de la souris.

Ensuite, placez l’ensemble de fusion cérébrale de la pompe micro-osmotique contenant le médicament d’intérêt, ou A-C-S-F comme contrôle, sous la peau derrière la région du cou. Pour infuser le médicament dans le cerveau, insérez l’aiguille de perfusion cérébrale dans le trou percé. Utilisez un gel désensibilisant de surface pour fixer l’aiguille en place sur le crâne et attendez que la colle sèche.

Coupez la partie saillante sur le dessus de l’aiguille. Avant de commencer le test de tolérance au glucose, préparez la solution de glucose en dissolvant 3,75 grammes de glucose et 15 millilitres d’eau distillée. Établissez un calendrier avec des intervalles appropriés entre chaque examen sanguin pour enregistrer les lectures pendant l’expérience.

Ensuite, pesez chaque souris après le jeûne pour calculer la quantité appropriée de glucose pour l’injection. Ensuite, sur le plan de travail, préparez une minuterie, une puce de glucose, un glucomètre, une seringue à insuline et des lames de rasoir. Pour mesurer la glycémie, insérez d’abord une nouvelle puce de glucose dans le glucomètre et appuyez sur le bouton de démarrage pour régler le zéro.

Ensuite, prenez la souris à l’arrière du cou et caressez sa queue pour assurer une circulation sanguine suffisante. Utilisez une nouvelle lame de rasoir pour couper un petit morceau de la queue, puis pressez une goutte de sang dans la puce de glucose. À l’aide de la technique de lavage intragastrique, nourrissez la souris avec du glucose et démarrez immédiatement la minuterie.

Mesurez le glucose à différents moments. Pour commencer le test de tolérance à l’insuline, préparez 0,25 unité de solution d’insuline humaine. Ensuite, pesez chaque souris après le jeûne pour calculer la quantité appropriée d’insuline pour l’injection.

Ensuite, établissez un calendrier pour enregistrer les lectures pendant l’expérience. Enfin, après l’injection d’insuline, mesurez le taux de glucose dans le sang comme vous l’avez fait précédemment. Le métabolisme du glucose a été mesuré par le test de tolérance au glucose par voie orale après la chirurgie, après l’administration orale de glucose chez la souris.

Les changements de la glycémie chez les souris perfusées avec A-C-S-F, ou perfusées avec l’antagoniste C-C-L-5, sont enregistrés et montrés ici. Le test de sensibilité à l’insuline a également été effectué et la glycémie chez les souris perfusées avec l’antagoniste C-C-L-5 n’était que légèrement réduite par rapport aux souris témoins, suggérant des altérations de la fonction de l’insuline sur le métabolisme périphérique du glucose chez les souris traitées avec C-C-L-5. Pour analyser l’activation du signal de l’insuline, la protéine de substrat du récepteur de l’insuline, ou phosphorylation I-R-S-1, a été évaluée dans l’hypothalamus.

Chez les souris traitées avec l’antagoniste C-C-L-5 lorsqu’elles étaient nourries normalement, la phosphorylation de I-R-S-1 était régulée à la hausse par rapport au groupe témoin. Pour analyser plus en détail l’activation du signal de l’insuline, les niveaux de sérine 4-7-3 Akt phosphorylée, molécule de signalisation de l’insuline en aval, ont également été évalués. Par la suite, le signal A-K-T de provocation à l’insuline a été augmenté chez les souris témoins traitées par A-C-S-F, mais pas chez les souris traitées par antagoniste C-C-L-5.

Une fois maîtrisé, l’insertion de la pompe micro-osmotique ne prendra qu’une demi-heure si elle est effectuée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de s’assurer que la tête de la souris est légèrement soulevée et que la colonne vertébrale est droite sur l’appareil stéréotaxique. Cette technique fournit au chercheur un moyen en endocrinologie d’explorer l’effet d’un médicament, d’une chimiokine ou d’une fonction protéique dans le cerveau du rongeur.

À la suite de cette procédure, des mesures supplémentaires telles que la manipulation de l’expression génique avec une livraison intracérébrale d’un virus, ou Crisper 9, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que : comment le C-C-L-5 et le récepteur C-C-L-5 participent-ils au circuit de digestion et de métabolisme des aliments ?