Synthèse de noyau-enveloppe dopé Lanthanide Upconversion nanocristaux pour des Applications cellulaires

L’objectif global de cette procédure est de synthétiser des nanocristaux de conversion ascendante dopés aux lanthanides sur la base d’une approche de co-précipitation à haute température et d’effectuer des modifications de surface biocompatibles qui permettent d’autres applications cellulaires. Au cours des dernières années, notre laboratoire a mis au point une conversion ascendante très unique de nanocristaux dopés au lanthanide, qui a indiqué des propriétés optiques très uniques, de sorte qu’ils peuvent absorber la lumière infrarouge de longue longueur d’onde et convertir essentiellement cette lumière en émissions multicolores à courte gamme de longueurs d’onde, y compris les UV visibles même aux fenêtres de lumière infrarouge. De telles structures nanocristallines uniques ont montré des propriétés très prometteuses pour les applications biomédicales.

Cette méthode fournit une approche réalisable pour la synthèse de nanostructures de conversion ascendante cœur-coquille et leur technique de modification de surface biocompatible pour la régulation des protéines de canal membranaire par porte de lumière lors d’un éclairage de lumière proche infrarouge. Pour commencer la procédure, préparez des solutions mères des complexes d’acétate de terres rares dans du méthanol. Préparez des solutions de 20 milligrammes par millilitre d’hydroxyde de sodium et de fluorure d’ammonium dans du méthanol.

Conservez les solutions mères à quatre degrés Celsius. Ensuite, pipetez trois millilitres d’acide oléique et sept millilitres de 1-octadécène dans une fiole de 50 millilitres, à trois cols et à fond rond. Ajoutez à cela 1,089 millilitre de solution d’acétate d’yttrium, 0,608 millilitre de solution d’acétate d’ytterbium, 83,6 microlitres de solution d’acétate de thulium et 128,5 microlitres de solution d’acétate de néodyme.

Équipez la fiole d’un agitateur et d’un thermomètre. Faites chauffer le ballon à 100 degrés Celsius dans un bain d’huile tout en remuant jusqu’à ce que le méthanol se soit évaporé. Ensuite, connectez le ballon à une ligne Schlenk et pompez le ballon pendant deux à trois minutes pour éliminer le méthanol résiduel.

Ensuite, placez le ballon sous une atmosphère d’azote. Chauffez le mélange réactionnel à 150 degrés Celsius pendant une heure tout en remuant à 700 tr/min. Ensuite, laissez le mélange refroidir à température ambiante.

Ensuite, placez dans un tube à centrifuger de 15 millilitres deux millilitres de la solution mère d’hydroxyde de sodium et 2,965 millilitres de la solution mère de fluorure d’ammonium. Fermez hermétiquement le tube et agitez le mélange d’hydroxyde de sodium et de fluorure d’ammonium pendant cinq secondes. Pendant cinq minutes, à l’aide d’une pipette en verre, ajoutez lentement le mélange d’hydroxyde de sodium et de fluorure d’ammonium dans le ballon de réaction tout en remuant.

Ensuite, chauffez le mélange réactionnel à ne pas dépasser 50 degrés Celsius. Maintenez le mélange à cette température pendant 30 minutes. Ensuite, chauffez le mélange à 100 degrés Celsius pour évaporer le méthanol.

Connectez le ballon à la ligne Schlenk et retirez le méthanol résiduel sous vide pendant deux à trois minutes. Remplissez le ballon d’azote gazeux et chauffez le mélange réactionnel à 290 degrés Celsius à cinq degrés Celsius par minute. Maintenez le mélange à 290 degrés Celsius ou légèrement au-dessus de 290 degrés Celsius pendant 1,5 heure.

Ensuite, laissez le mélange refroidir à température ambiante tout en remuant. Transférez le mélange de produit dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Rincez le résidu dans le tube avec 30 millilitres d’éthanol.

Centrifugez le mélange à 4 000 fois g pendant huit minutes à température ambiante. Jetez le surnageant et dispersez les solides dans 10 millilitres d’hexanes par sonication pendant deux minutes. Ajoutez 30 millilitres d’éthanol à la dispersion, centrifugez à nouveau le mélange dans les mêmes conditions et jetez le surnageant.

Dispersez les solides dans cinq millilitres d’hexanes et stockez la dispersion à quatre degrés Celsius. Vérifiez l’émission convertie de la solution UCNs cœur-coquille lors d’une irradiation laser de 808 nanomètres dans l’obscurité. Pour commencer à préparer des UCN modifiés par DBCO, lavez les nanocristaux de noyau-coquille préparés dans 30 millilitres d’éthanol par centrifugation.

Jetez le surnageant et ajoutez 10 millilitres d’une solution aqueuse d’acide chlorhydrique au pH quatre. Soniquez le mélange pendant 30 minutes pour dissoudre les solides. Transférez le mélange dans un flacon en verre et remuez vigoureusement pendant deux heures.

Ensuite, lavez le mélange avec quatre portions de 30 millilitres d’éther diéthylique. Mélangez les fractions d’éther et mettez de côté la couche aqueuse lavée. Récupérez les UCN sans ligands à l’état de traces dans les couches d’éther avec 10 millilitres d’eau désionisée et combinez les couches aqueuses.

Ajoutez 20 millilitres d’acétone aux couches aqueuses combinées et agitez le mélange pendant cinq secondes. Centrifugez le mélange à 35 000 fois g pendant 10 minutes. Jetez le surnageant et dissolvez le précipité dans deux millilitres d’eau déminéralisée pour obtenir une solution d’UCN sans ligand.

Ensuite, dissolvez 200 milligrammes d’acide polyacrylique dans 20 millilitres d’eau déminéralisée par sonication pendant 20 minutes. Ajoutez à cela la solution d’UCN sans ligand tout en remuant vigoureusement. Ajustez le pH du mélange à 7,4 avec une solution molaire d’hydroxyde de sodium.

Sonicez le mélange pendant 30 minutes et remuez le mélange pendant 24 heures à température ambiante. Ensuite, centrifugez le mélange à 35 000 fois g pendant 10 minutes. Laver les solides par centrifugation dans 10 millilitres d’eau déminéralisée quatre fois.

Dispersez les solides lavés dans huit millilitres d’eau désionisée pour obtenir une solution de 10 milligrammes par millilitre de UCN modifiés aux polymères. Centrifugez un milligramme d’UCN modifiés aux polymères à 35 000 fois g pendant 10 minutes. Conservez le reste de la solution à quatre degrés Celsius.

Laver les solides par centrifugation dans des portions d’un millilitre de DMF sec trois fois. Ensuite, dissolvez le précipité dans 200 microlitres de DMF sec. Ajoutez à cette solution 12,2 milligrammes de HOBT, 14 milligrammes d’EDC, cinq milligrammes de DBCO-amine et 16 microlitres de DIPEA.

Remuez le mélange à température ambiante pendant 24 heures. Ensuite, centrifugez le mélange pendant 10 minutes à 35 000 fois g. Laver les solides quatre fois par centrifugation dans des portions d’un millilitre de DMSO.

Dispersez les UCN modifiés par DBCO dans 0,2 millilitre de DMSO et stockez la dispersion à quatre degrés Celsius. Tout d’abord, ensemencez une fois 10 les cinquièmes cellules HEK293 dans une plaque à 12 puits et incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Ensuite, dans un tube de microcentrifugation, combinez un microgramme du plasmide choisi avec deux microlitres d’agent de transfection P3000 dans 100 microlitres de MEM.

Dans un autre tube de microcentrifugation, combinez 1,5 microlitre de réactif de transfection avec 100 microlitres de MEM. Incuber les deux mélanges à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, combinez les mélanges et ajoutez 400 microlitres de MEM à faible teneur en sérum.

Ensuite, lavez deux fois les cellules incubées avec des portions d’un millilitre de DMEM sans sérum. Répartissez le mélange de transfection de 600 microlitres dans les puits de la plaque à 12 puits. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant quatre heures.

Ensuite, retirez le milieu et lavez les cellules deux fois avec des portions d’un millilitre de DMEM. Répartissez dans les puits un millilitre d’une solution tétra-acétylée de N-azidoacétyl-mannosamine dans du DMEM. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant deux jours.

Ensuite, lavez, trypsinisez et recultivez les cellules dans une boîte confocale pendant la nuit. Ensuite, remplacez le milieu par un millilitre de DMEM frais contenant deux microlitres d’une solution de 50 milligrammes par millilitre de DBCO-UCN. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant deux heures et laver les cellules deux fois avec du DMEM.

Éteignez la lumière de la hotte et ajoutez les solutions tampons de diène appropriées dans les cellules pour l’imagerie calcique, puis incubez les cellules pendant 30 minutes dans l’obscurité. Lavez les cellules avec du DMEM sans sérum. Irradiez les cellules avec une lumière proche infrarouge de 808 nanomètres délivrant 0,8 watt par centimètre carré.

Alternez cinq minutes d’irradiation avec des pauses de cinq minutes jusqu’à ce que les cellules aient été irradiées pendant 20 minutes. Imagez les cellules à l’aide d’un microscope confocal. La microscopie électronique à transmission des UCN du cœur et de la coquille du cœur a montré des structures sphériques d’une épaisseur de coquille d’environ cinq nanomètres.

La MET à haute résolution a montré un espacement d compatible avec des nanostructures hautement cristallisées. Après modification de surface, les UCN ont été facilement dispersés dans une solution tampon. La diffusion dynamique de la lumière a indiqué que le diamètre hydrodynamique des DBCO-UCN en solution aqueuse est d’environ 96 nanomètres.

Les potentiels zêta des UCN modifiés par le PAA et le DBCO indiquent des surfaces chargées négativement, ce qui est cohérent avec la solubilité et la stabilité dans les solutions tampons aqueuses. Des tests d’émission convertis ont montré que les UCN modifiés par PAA et DBCO avaient les mêmes profils d’émission que les UCN de base lorsqu’ils étaient irradiés avec une lumière de 808 nanomètres. Des cellules HEK293 marquées à l’azoture exprimant des protéines de canal photodébilisé ont été utilisées pour tester les bioapplications des DBCO-UCN.

La localisation des UCN au niveau des marqueurs azides a été attribuée à la coloration des groupes DBCO avec un colorant contenant de l’azoture. Lorsque ces cellules ont été exposées à la lumière proche infrarouge, les DBCO-UCN ont facilité le flux d’ions calcium à travers la membrane cellulaire, comme le montrent l’imagerie confocale et la cytométrie en flux avec un indicateur de calcium fluorescent. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer les nanocristaux de conversion ascendante cœur-coquille avec modification de surface biocompatible et leurs autres applications biologiques pour activer le canal ionique photo-dépendant dans les cellules vivantes en suivant cette procédure.