Name: Différenciation du mégacaryocyte et plaquettes Formation de l’homme cordon CD34 dérivés du sang des cellules+ (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Découvrez la différenciation des mégacaryocytes et la formation plaquettaire à partir de cellules CD34+ du sang de cordon humain. Cette méthode permet d'isoler des populations cellulaires viables avec une pureté de 90 à 99%.

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Les auteurs tiennent à souligner le soutien de l’Australian Health and Medical Research Council (projet subvention 1012409 liée au BHC).

Ce protocole a été approuvé par la South Eastern Sydney Human Research Ethics Committee et ratifiée par le University of New South Wales' Human Research Ethics Committee. Sang de cordon ombilical provenant de donneurs sains a été fourni par le cordon sang Bank de Sydney (Sydney, NSW, Australie). Volumes d’environ 100 mL ont été utilisés pour cette procédure.
NOTE : Les travaux dans une placard à l’aide d’une technique aseptique de biosécurité classe II. Décontaminer l’extérieur du sac de sang de cordon avec l’éthanol à 70 %. Utiliser des instruments stériles (ciseaux, pince à épiler) pour cette procédure.
1. préparation des cellules sanguines et l’isolement des CD34 de cordon de cellules+
<ol>
	<li>Préparer le tampon de séparation stérile (SB) avec du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS), pH 7,2 et contenant 0,5 % bovine serum albumine et 2 mM EDTA.</li>
	<li>Diluer 10 mL de SB dans un tube conique de 50 mL (un tube par 10 mL de sang est nécessaire). À l’aide d’une aiguille émoussée G18, montée sur une seringue de 10 mL, 10 mL de sang faire sortir du sachet et verser dans les tubes de 50 mL contenant 10 mL de SB.</li>
	<li>Ajouter 15 mL de médias de séparation de lymphocytes (voir Table des matières) jusqu’au fond du tube contenant le sang dilué, créant deux couches. Remarque : Distribuer les médias lentement au fond du tube pour éviter de mélanger les différentes couches.</li>
	<li>Centrifuger les tubes à 1 200 × g pendant 30 min à température ambiante (RT) avec aucune coupure et pas d’accélération.</li>
	<li>Transférer la couche près du centre du tube contenant des cellules mononucléaires (environ 5-10 mL de chaque tube) dans un nouveau tube de 50 mL à l’aide d’une pipette Pasteur. Ajouter SB dans chaque tube pour un volume total de 50 mL.</li>
	<li>Centrifuger à 400 × g pendant 10 min à RT. jeter le surnageant.</li>
	<li>Resuspendre les granules cellulaires soigneusement avec une pipette Pasteur en 5-10 mL de moissonneuse-batteuse SB. les cellules en suspension et porter le volume à 50 mL avec SB.</li>
	<li>Comte de cellules en utilisant une coloration bleu Trypan et un hémocytomètre ou automatisée de cellules encontre (voir Table des matières). Pour déterminer le pourcentage de CD34+ des cellules dans l’échantillon, remettre 2,5 × 105 cellules dans 100 µL de SB et tache en ajoutant 10 µL d’anticorps anti-CD34-PE de 15 à 30 min à 4 ° C. Analyse par cytométrie en flux (Figure 1 a).</li>
	<li>Tubes à centrifuger à 400 × g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant. Remarque : si ce n’est nécessaire immédiatement, les cellules mononucléaires peuvent être congelés à ce stade.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules dans 300 µL de SB par 108 cellules. Ajouter 100 µL de FcR IgG humaines (blocage réactif, voir la Table des matières) et 100 µL de billes magnétiques CD34 par 108 cellules. Mélanger doucement et laisser incuber à 4 ° C pendant 30-40 min. Remarque : Une suspension monocellulaire est nécessaire (si nécessaire, passer les cellules même si un filtre de 30 µm avant d’ajouter les réactifs). Utiliser les volumes de réactifs décrits ici pour 10 cellules de8 ou moins. Pour plus de 108 cellules, échelle des réactifs (SB, bloquant la solution et CD34 billes magnétiques) en conséquence.</li>
	<li>Préparer la colonne de séparation LS au cours de la période d’incubation en plaçant la colonne LS dans un support magnétique et de lavage avec 3 mL du SB. jeter l’effluent. Remarque : Les colonnes de séparation LS peuvent être chargés avec jusqu'à 2 × 108 cellules total. Petites et grandes colonnes sont disponibles.</li>
	<li>Ajouter 5 à 10 mL de SB au mélange cellulaire et centrifuger à 400 × g pendant 10 min. éliminer le surnageant.</li>
	<li>Remettre en suspension des cellules dans 1,5 mL de SB et charger la suspension cellulaire (1,5 mL) sur la colonne de LS. Recueillir le débit à travers contenant les cellules non marquées dans un tube de prélèvement de 15 mL (fraction négatif #1). Laisser le liquide vider et laver la colonne avec 1,5 mL de SB.</li>
	<li>Charger le flux collecté à travers (3 mL) dans la colonne et collecter le débit à travers dans le même tube de prélèvement de 15 mL (fraction négatif #1). Laver la colonne LS 3 fois avec 3 mL de SB. Remarque : Si nécessaire, les cellules de la fraction négative (12 mL) peuvent être colorés avec un anticorps anti-CD34 à savoir la capture de CD34+ des cellules de la colonne de LS.</li>
	<li>Retirer la colonne du séparateur magnétique et rincer les cellules lentement avec un piston de la seringue dans un nouveau tube de 15 mL avec 2 mL de SB.</li>
	<li>Replacer la colonne sur séparateur magnétique et charge le 2 mL de cellules dans la colonne. Recueillir le débit à travers et laver avec 2 mL SB. Il s’agit de la fraction négative #2 (4 mL).</li>
	<li>Supprimer colonne LS séparateur magnétique et ajouter 2 mL de cellules SB. chasse d’eau régulièrement et fermement avec un piston de la seringue pour recueillir le CD34+ fraction cellulaire. Compter les cellules à l’aide d’une coloration bleu trypan et un hémocytomètre ou compteur de cellules automatisées.</li>
	<li>Tube à centrifuger avec la fraction positive à 400 × g pendant 15 min à 4 ° C. Jeter le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans un milieu sans sérum pour CD34+ cellules (gestion durable des forêts, voir la Table des matières). Remarque : si ce n’est nécessaire immédiatement, les cellules peuvent être congelés dans l’azote liquide à ce stade.</li>
</ol>
2. pureté cocher de CD34 isolé des cellules+
<ol>
	<li>2 x 104 cellules de la fraction positive avec les anticorps anti-CD34-PE µL et les anticorps anti-CD45-PerCP 20 µL pendant 15 min à 4 ° C (utiliser un autre tube pour isotype contrôles) 10 (Figure 1 b).</li>
	<li>Ajouter 1 mL de SB à laver. Centrifuger à 400 × g pendant 10 min. remettre culot dans 200 µL de SB.</li>
	<li>Effectuer l’analyse en cytométrie en flux et porte la population de cellules vivantes pour exclure les débris (Figure 1 b). Fixer la porte pour PE et PerCP les populations positives en utilisant les contrôles d’isotype PE et PerCP (Figure 1 b) et déterminer le pourcentage de CD34+/CD45+ cellules.</li>
</ol>
3. mégacaryocyte différenciation
<ol>
	<li>Graines de 5 × 105 cellules/mL CD34+ cellules dans 2 mL de l’AFD additionné de 50 ng/mL thrombopoïétine humaine recombinante (rhTPO) / puits dans une plaque de 12 puits. Incuber les cellules à 37 ° C, 5 % de CO2 dans une atmosphère humidifiée. Si les cellules sont confluentes avant qu’ils soient nécessaires pour l’analyse, récolter les cellules et divisé en plusieurs loges avec supports neufs et rhTPO. NOTE : Deux ou trois puits devraient être établis spécifiquement pour surveiller la différenciation à des moments différents (p. ex., 7, 9 et 10 jours).</li>
	<li>Récolter les cellules provenant des puits mis de côté pour surveiller la différenciation sans déranger les cellules dans les autres puits.</li>
	<li>Cellules de tache avec anticorps anti-GPIIb/CD41-FITC 20 µL et 10 µL anti-GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 l’anticorps dans un volume final de 100 µL. mis en place un contrôle tube à l’aide de l’anticorps de contrôle respectifs isotype. Incuber pendant 15 à 30 min à 4 ° C.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de SB à laver.</li></ol>Centrifuger à 400 × g pendant 10 min. jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 200-300 µL de l’utilitaire Analyze SB. par cytométrie en flux.
	<li>Pour chaque fluorophore, analyser les contrôles isotype pour définir le processus de blocage pour les populations positives FITC et Alexa farine 647. Analyse des échantillons de cellules colorées afin de déterminer le pourcentage de CD41+/CD42a+ double de cellules positives, qui représentent MK mature (Figure 1).</li>
	<li>Pour une visualisation microscopique des cellules marqueurs de surface tachent cellules tel que décrit à la 3.3.<ol>
		<li>Ajouter 1 mL de SB à laver. Centrifuger à 400 × g pendant 10 min. Resuspendre le culot dans 100 µL de SB et un essorage sur une lame de verre à 1 000 x g pendant 5 min. Fix cellules sur la diapositive en plongeant dans le méthanol pour 30 s. de l’Air sec, ajouter 20 µL de milieux contenant du DAPI de montage (voir Table des matières) , recouvrir d’un lamelle couvre-objet et visualiser à l’aide d’un microscope à fluorescence (Figure 2 a).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pour la visualisation des antigènes intracellulaires, remettre en suspension les cellules dans du PBS et fixer avec du paraformaldéhyde (concentration finale de 1 %) pendant 15 min à température ambiante. Pour permeabilize des cellules, ajouter triton-X 100 (0,1 %) et incuber pendant 15 min. cellules de lavage avec 2 mL PBS/0.1% triton-X 100. Remettre en suspension dans 100 µL de PBS/0.1% triton-X 100, ajouter anti vWf et anti CD62p anticorps (dilution 1 : 200) et incuber 30 min à température ambiante.<ol>
		<li>Laver avec 2 mL PBS/0.1% triton-X 100 et centrifuger à 400 × g pendant 10 min, resuspendre dans 100 µL de tampon de la même et ajouter de anti-souris IgG-Alexa 594 et anti-lapin IgG-Alexa 488 (1/100). Incuber 30 min à température ambiante, laver avec 2 mL PBS/0.1% triton-X 100, remettre en suspension dans 100 µL de tampon de la même et ajouter 20 µL d’anti-CD42b-APC. Puis faites tourner les cellules sur des lames de verre comme indiqué au point 3.6.1 et préparer les échantillons pour la visualisation microscopique comme indiqué au point 3.6.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pour la détermination de la ploïdie, récolter les cellules au jour 12 ou 13 de différenciation. Ajouter 1 mL de SB à laver. Centrifuger à 400 × g pendant 10 min et tache avec 20 anticorps d’anti-GPIIb/CD41-FITC µL dans un volume final de 100 µL. Incuber à 4 ° C pendant 30 min.<ol>
		<li>Laver une fois avec 1 mL de SB et Resuspendre le culot dans 300 µL de citrate hypotonique tampon (1,25 mM du citrate de sodium, chlorure de sodium 2,5 mM, dextrose de 3,5 mM) contenant 20 µg/ml d’iodure de propidium et 0,05 % Triton X 100. Incuber pendant 15 min à 4 ° C, abri de la lumière.</li>
		<li>Ajouter RNase à une concentration finale de 20 µg/mL et incuber 30 min à 4 ° C, abri de la lumière. Déterminer l’intensité de l’iodure de propidium par cytométrie en flux de collecte des événements de 30 000 à 50 000 de la population de CD41-FITC+ (Figure 2).</li>
	</ol>
	</li>

4. proplaquettes décompte, énumération plaquettaire et l’Activation des plaquettes
<ol>
	<li>Récolter les cellules (de l’étape 3.1) aux jours 8 ou 9 de différenciation et de semences à 1 × 104 cellules/puits dans les plaques de 48 puits dans 200 µL de GDF frais additionné de 50 ng/mL rhTPO. Culture pendant 5 jours à 37 ° C, 5 % CO2. Remarque : À des fins de quantification, graine de puits en triple exemplaire. Cette faible densité est nécessaire pour la visualisation et le comptage des proplaquettes-roulement MK proplaquettes habituellement commencent à apparaître après 2 jours de culture. Le pic est entre 4 et 5 jours.</li>
	<li>Compter le nombre de porteurs proplaquettes MK dans l’ensemble bien sur un microscope inversé de lumière à l’aide de 10 X ou 20 X objectifs. Remarque : Une platine du microscope chaud (37 ° C) est préférable puisque gardant les cellules à température ambiante pendant une période prolongée provoque le rétrécissement des proplaquettes extensions. Proplaquettes sont observés comme des longues extensions du corps de MK. Chaque MK peut avoir plusieurs protubérances proplaquettes. Développent des proplaquettes, le corps du MK diminue en taille.</li>
	<li>Récolter les cellules et centrifuger à 400 g pendant 10 min à température ambiante. Colorer les cellules anticorps anti-humain CD41-FITC 20 µL comme décrit aux points 3.3 et 3.4. Calculer le pourcentage des proplaquettes-roulement MK (pbMK) : pbMK (%) = [(Proplatelet-roulement MKs/bien) / (Total CD41+ cellules / puits)] x 100</li>
	<li>Pour compter les plaquettes libérées dans le milieu de culture, délicatement mélanger les cellules avec une pipette Pasteur et prélever 100 µL au jour 14 ou 15 de la culture.<ol>
		<li>Coloration à l’anticorps de l’ITCF CD41 anti-humain de 20 µL pendant 20-30 min à 4 ° C. Préparer un tube de contrôle à l’aide de l’anticorps de contrôle respectifs isotype.</li>
		<li>Ajouter 150 µL de SB et 50 µL de compter les perles.</li>
		<li>Pour cytométrie, régler la FSC et le SSC se connecter échelle. Utilisation normale des plaquettes de sang humains de plasma riche en plaquettes colorées au CD41-FITC comme décrit dans section 4.4.1 pour définir le processus de blocage pour les plaquettes (Figure 3 a).</li>
		<li>Analyser les plaquettes colorées avec le comptage des perles par cytométrie en flux. Collecter 1 000 événements de compter les perles à l’aide de la FSC versus diagramme de dispersion des SSC (Figure 3 a). Calculer le nombre de plaquettes basé sur des événements positifs CD41-FITC (Figure 3 b) selon la formule suivante : Plaquettes par µL = [(nombre d’événements positifs CD41-FITC)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/volume de l’échantillon)]</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pour analyser l’activation plaquettaire, délicatement mélanger les cellules avec une pipette Pasteur et prélever 100 µL au jour 14 ou 15 de la culture. Ajouter 1 mL de tampon (137 mM NaCl, KCl 2,7 mM, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 0,2 mM Na2HPO4, 12 mM NaHCO3, 5,5 mM D-glucose, pH 6,5) et la centrifugeuse Tyrode à 200 x g pendant 5 min granuler des cellules.<ol>
		<li>Récupérer le surnageant et centrifuger à 800 g pendant 10 min granuler particules plaquettaire.</li>
		<li>Jeter le surnageant et remettre en suspension dans 100 µL de tampon de Tyrode. Ajouter 20 µL d’anticorps PAC1-FITC et adénosine diphosphate (ADP) à une concentration finale de 20 µM. Incuber à température ambiante pendant 20 min. analyse par cytométrie de flux pour déterminer le pourcentage d’événements positifs FITC. Utiliser les plaquettes humaines fraîches traitées de la même manière qu’un contrôle positif (Figure 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole décrit ici est adapté pour une production constante de MK et de plaquettes dans la culture du sang de cordon ombilical. Ces cellules peuvent servir à étudier les divers processus tels que l’effet de drogues ou d’activités biologiques sur MK prolifération, différenciation, proplaquettes formation et production de plaquettes.
Une variété de combinaisons de cytokines et de milieux de culture ont été présentés dans la littérature. Addition de cytokines telles que le facteur des cellul...

Isolement d’un nombre suffisant de mégacaryocytes humains primaires (MK) pour une utilisation régulière de laboratoire n’est pas possible en raison de leur faible fréquence dans la moelle osseuse, où ils représentent ~0.01% de cellules nucléées1. Une alternative commode est l’ex vivo de l’expansion et la différenciation des souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices en présence de facteurs de croissance spécifiques. Un certain nombre de cytokines dont stem cell factor (SCF ; c-kit ligand) et interleukine (IL) -3 et IL-11 ont été utilisés dans les systèmes de culture pour produire MKs. thrombopoïétine (TPO) est le facteur de croissance et la différenciation plus efficace pour les cultures megakaryocytic et est efficace seul ou avec d’autres cytokines, telles que le SCF et l’IL-32. TPO peut agir sur les populations de cellules souches se traduire par la prolifération et la maturation de MKs2.
Plaquettes produits MK de protubérances cytoplasmiques appelées proplaquettes et, in vivo, environ 1 x 1011 plaquettes sont formés tous les jours pour soutenir les numérations plaquettaires de 150-400 x 109/l. plaquettes production in vitro est jusqu'à 1000 -plier plus bas que in vivo estime à3, et cela a donné lieu à nombreuses conditions de culture à l’aide de CD34+ cellules progénitrices hématopoïétiques pour améliorer MK et plaquettes production in vitro. La source initiale de CD34+ cellules utilisées pour la différenciation MK était de sang périphérique humain4. Autres sources de cellules incluent la moelle osseuse5,6, les cellules souches embryonnaires et induits pluripotentes cellules souches (ESC/iPSC)7et cordon ombilical sang (UCB)8,9,10 . La moelle osseuse humaine CD34+ 11 et la souris lignée négative la moelle osseuse des cellules5 produits MK et plaquettes in vitro; Néanmoins, le manque de disponibilité de la moelle osseuse humaine limite son utilisation comme source de CD34+ cellules. En revanche, ESC et iPSC représentent une source illimitée de cellules pour la production de plaquettes in vitro . Production de plaquettes de ces cellules nécessite des cellules nourricières tels que les cellules murines OP9 et de plus longues périodes de culture. Plaquettes dérivées dans des conditions sans chargeur semblent être moins fonctionnel12. iPSC-dérivé des plaquettes sont susceptibles d’être d’utilisation en milieu clinique, puisqu’ils peuvent être étendus à grande échelle. Ce processus nécessite transduction LENTIVIRAUX médiée par des facteurs de transcription et à long terme de la culture de cellule13.
UCB est une source accessible de CD34+ cellules qui peuvent être facilement utilisés dans les paramètres de recherche. TPO seul peut favoriser la différenciation du cordon de dérivés du sang CD34+ cellules et cela donne lieu à MKs extrêmement pur, mature sans besoin de supplémentation de sérum ou de co-culture avec des cellules nourricières. Autres cytokines telles que le SCF peut diminuer la différenciation de l’UCB CD34+ cellules, tandis que Flt-3 ligand et IL-11 favorisent la production de mégacaryocytes immatures14. Ce protocole décrit la production de cultures de MK très pures de sang de cordon ombilical CD34+ cellules dans des conditions de milieu sans sérum.

<table><tbody><tr><td>Réactifs de culture cellulaire</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Recombinant Human TPO</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-013</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM II</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>9605</td><td>Milieux sans sérum pour cellules CD34+</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>CD34 Réactifs d’isolation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD34 MicroBead kit ultra-pur</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-453</td><td>Ce kit comprend le réactif de blocage des IgG humaines FcR et des microbilles CD34. Ces billes contiennent le clone d’anticorps anti-CD34 QBEND/10. Utilisez un autre clone anti-CD34 pour le contrôle de pureté (par exemple, le clone 8G12).</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Alere Technologies</td><td>1114545</td><td>Milieux de séparation des lymphocytes (densité 1,077 g/mL)</td></tr><tr><td>Tampon de séparation stérile (SB)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td>Ce tampon contient une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,2 contenant 0,5 % d’albumine sérique bovine et 2 mM d’EDTA. Il peut être préparé à l’aide de composants stériles de qualité culture cellulaire. Dégazez avant utilisation car les bulles d’air peuvent bloquer la colonne.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Cytométrie en flux et réactifs de coloration cellulaire</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Souris anti-Human CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>340669</td><td>Clone 8G12. Cela peut être utilisé pour le contrôle de la pureté du CD34. Concentration finale d’anticorps dilution 1:10.</td></tr><tr><td>Souris PerCP anti-humaine CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>347464</td><td>dilution 1:10</td></tr> Contrôle <tr><td>des isotypes PerCP</td><td>BD Biosciences</td><td>349044</td><td>dilution 1:10</td></tr><tr><td>FITC Souris anti-humaine CD41a</td><td>BD Biosciences</td><td>340929</td><td>Concentration finale d’anticorps Dilution 1:5.</td></tr><tr><td>APC Souris anti-Human CD42b</td><td>BD Biosciences</td><td>551061</td><td>Cet anticorps peut également être utilisé pour détecter les MK matures (le pourcentage de cellules positives est généralement inférieur à celui de l’anti CD42a). Concentration finale d’anticorps dilution 1:10.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Souris anti-Humain CD42a</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA1227A647T</td><td>Actuellement distribué par Bio-Rad. Concentration finale d’anticorps dilution 1:10.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Souris Contrôle Négatif</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA928A647</td><td>Actuellement distribué par Bio-Rad. Anticorps de contrôle d’isotype</td></tr><tr><td>Anti von Willebrand facteur de lapin polyclonal</td><td>Abcam</td><td>AB6994</td><td>dilution 1:200</td></tr><tr><td>souris V450 anti-humna CD41a</td><td>BD Biosciences</td><td>58425</td><td>dilution 1:20</td></tr><tr><td>V450 contrôle d’isotype</td><td>BD Biosciences</td><td>580373</td><td>dilution 1:20</td></tr><tr><td>Anticorps PAC1-FITC BD</td><td>Biosciences</td><td>340507</td><td>dilution 1:10</td></tr><tr><td>souris Anti CD62p monoclonal</td><td>Abcam</td><td>AB6632</td><td>dilution 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 chèvre anti lapin IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>dilution 1:100</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 chèvre anti souris IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11020</td><td>dilution 1:100</td></tr><tr><td>Ig Isotype Control cocktail-C</td><td>BD Biosciences</td><td>558659</td><td>Isotype control anticorps Iodure</td></tr> de <tr><td>propidium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Perles de comptage absolues</td><td>Sondes moléculaires, Invitrogen</td><td>C36950</td><td>Perles de comptage</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Des colonnes plus petites et plus grandes sont également disponibles dans le commerce</td></tr><tr><td>MidiMACS Aimant séparateur</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5mL tubes FACS en polypropylène à fond rond, avec Snap Cap, technologies</td><td>stériles in vitro</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Lames en</td> <td>verreMenzel-Glaser</td><td>J3800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Supports de montage avec DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Supports de montage anti-décoloration avec DAPI</td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé</td> Microscope inversé <td>Leica</td><td>DMIRB Microscope</td><td></td></tr><tr><td>à fluorescence</td><td>Zeiss</td><td>Vert.A1</td><td></td></tr><tr><td>Analyseur de cellules</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Canto II</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin</td><td>centrifugeuse ThermoScientific Cytospin</td><td>4</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Catalog Numéro</td><td>Commentaires</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse de cellules</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Diva Software</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse de cellule unique</td><td>Tree Star</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de microscope fluorescent</td><td>Zeiss</td><td>Zen 2 blue edition</td><td></td></tr></tbody></table>

différenciation du mégacaryocyte et plaquettes formation de l’homme cordon cd34 dérivés du sang des cellules+

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Production de plaquettes se produit principalement dans la moelle osseuse dans un processus appelé Thrombopoïèse. Au cours de la Thrombopoïèse, cellules progénitrices hématopoïétiques différencient aux précurseurs de plaquettes de forme appelés mégacaryocytes, qui se différencient en phase terminale pour libérer les plaquettes des processus longs cytoplasmiques appelés proplaquettes. Mégacaryocytes sont rares cellules confinés à la moelle osseuse et sont donc difficiles à récolter en nombre suffisant pour utilisation en laboratoire. Une production efficace de mégacaryocytes humaines peut être obtenue in vitro en cultivant CD34+ des cellules dans des conditions appropriées. Le protocole détaillé ici décrit l’isolement des CD34+ cellules par cellule magnétique de tri des échantillons de sang de cordon ombilical. Les mesures nécessaires pour produire des mégacaryocytes extrêmement purs, matures dans des conditions sans sérum sont décrites. Détails des analyses phénotypiques de la différenciation du mégacaryocyte et détermination des proplaquettes production formation et plaquettes sont également fournis. Effecteurs qui influencent la différenciation mégacaryocyte et/ou formation proplaquettes, tels que les anticorps antiplaquettaires ou mimétiques de la thrombopoïétine, peuvent être ajoutés à des cellules cultivées à examiner la fonction biologique.

Ce protocole permet la préparation de cultures très pures de MK de cordon dérivés du sang CD34+ cellules. Le pourcentage de CD34+ des cellules dans le cordon sang est d’environ 1,3 %15 (Figure 1 a) et le nombre total de cellules mononucléées (étape 1.8) s’étend de 90-300 x 106 unitaire de l’UCB. La pureté du CD34 + / CD45 + cellules après isolement s’étend de 90 à 99 % (Figure 1 b</...

Une population très pure de mégacaryocytes peut provenir de cordon dérivés du sang CD34+ cellules. Une méthode pour CD34+ la différenciation des cellules d’isolement et mégacaryocyte est décrite ici.

Différenciation du mégacaryocyte et plaquettes Formation de l’homme cordon CD34 dérivés du sang des cellules+

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser des échantillons de sang de cordon ombilical humain pour isoler des cellules CD34 positives pures afin d’étudier les effets de médicaments d’intérêt spécifiques sur la différenciation des mégacaryocytes, la formation de proplaquettes et la production de plaquettes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur le domaine des mégacaryocytes et des plaquettes, telles que les effets d’un traitement spécifique sur la différenciation des mégacaryocytes et la production et la fonction plaquettaires. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une méthode pour l’isolement cohérent de cellules CD34 positives viables à partir de sang de cordon ombilical frais.Grâce à cette méthode, d’autres types de cellules tels que les lymphocytes, les érythrocytes et les macrophages peuvent également être étudiés. Commencez par ajouter 10 millilitres de tampon de séparation dans un tube conique de 150 millilitres pour 10 millilitres de sang de cordon. À l’aide d’une aiguille émoussée de calibre 18 montée sur une seringue de 10 millilitres, transférez 10 millilitres de sang dans chaque tube, puis ajoutez 15 millilitres de milieu de séparation des lymphocytes au fond de chaque tube.Séparez les cellules par centrifugation à gradient de densité, puis à la fin de la rotation, collectez soigneusement cinq à 10 millilitres de cellules mononucléées contenant une couche de couche leucocytaire dans un nouveau tube par échantillon. Portez le volume total de chaque tube à 50 millilitres avec un tampon de séparation frais et centrifugez à nouveau les cellules. Remettez les granulés en suspension dans cinq à 10 millilitres de tampon de séparation frais et regroupez les échantillons de cellules.Ajustez le volume à 50 millilitres avec un tampon de séparation frais pour le comptage et mettez de côté 100 microlitres de cellules pour déterminer le pourcentage de cellules CD34 positives par cytométrie en flux. Centrifugez à nouveau les cellules et remettez la pastille en suspension dans 300 microlitres de tampon de séparation, 100 microlitres de réactif bloquant les IgG humaines du récepteur FC et 100 microlitres de billes magnétiques CD34 par fois 10 à la huitième cellule. Mélangez doucement les cellules avant de les placer à quatre degrés Celsius pour une incubation de 30 à 40 minutes.Pendant l’incubation, placez une colonne de séparation des billes magnétiques de taille appropriée dans le support magnétique correspondant et lavez la colonne avec trois millilitres de tampon de séparation. À la fin de l’incubation, retirer les billes non liées par centrifugation dans cinq à 10 millilitres de tampon de séparation et remettre en suspension la bille magnétique et la pastille de cellule dans 1,5 millilitre de tampon de séparation frais. Chargez les cellules étiquetées sur la colonne et collectez le flux non étiqueté dans un tube de collecte de 15 millilitres.Chargez l’effluent sur la colonne et recueillez le deuxième cycle d’écoulement dans le même tube de collecte. Ensuite, lavez la colonne trois fois avec trois millilitres de tampon de séparation et retirez la colonne de l’aimant. À l’aide du piston de colonne, rincez progressivement deux millilitres de tampon de séparation à travers la colonne dans un nouveau tube de 15 millilitres et remettez la colonne dans l’aimant.Rechargez les cellules vidées sur la colonne. Récupérez le flux et lavez la colonne avec deux millilitres de tampon de séparation comme nous venons de le démontrer. Après avoir retiré la colonne de l’aimant, rincez la colonne avec deux millilitres de tampon de séparation frais pour collecter la fraction de cellules CD34-positive comme cela vient d’être démontré, et collectez les cellules CD34-positives par centrifugation.Ensuite, mettez la pastille en suspension dans un milieu sans sérum pour les cellules CD34 positives. Pour la différenciation des mégacaryocytes, ensemencer cinq x 10 à la cinquième cellule CD34 positive par millilitre dans 2 millilitres de milieu sans sérum, complétée par de la thrombopoïétine humaine recombinante par puits dans une plaque à 12 puits pour leur incubation à 37 degrés Celsius, et 5 % de dioxyde de carbone, dans une atmosphère humidifiée. Aux points temporels appropriés de surveillance de la différenciation, prélever les cellules de deux à trois puits par point temporel sans perturber les cellules des autres puits, et colorer les cellules collectées avec des anticorps anti-CD41 et anti-CD42a pour déterminer le pourcentage de mégacaryocytes matures dans les cultures.Pour une visualisation microscopique au niveau des marqueurs de surface des cellules, lavez les cellules récoltées dans 1 millilitre de tampon de séparation et remettez la pastille en suspension dans 100 microlitres de tampon frais. Utilisez un cytospin pour ensemencer les cellules sur une lame de verre, et fixez les cellules à la lame avec une immersion de 30 secondes dans du méthanol. Après le séchage à l’air, étiquetez les cellules avec 20 microlitres de milieu de montage complété par DAPI et recouvrez les cellules d’une lamelle de recouvrement pour une visualisation par microscopie fluorescente.Pour compter les proplaquettes, récoltez les cellules au huitième ou neuvième jour de différenciation, et ensemencez les cellules collectées à un x 10 à quatre cellules par 200 microlitres de milieu frais sans sérum, complété par de la thrombopoïétine humaine recombinante par puits dans une plaque de 48 puits. Après cinq jours à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, comptez le nombre de mégacaryocytes porteurs de proplaquettes par puits sur un microscope à lumière inversée, en utilisant l’objectif 10 ou 20 fois. Pour analyser l’activation plaquettaire, au 14e ou 15e jour de culture, mélangez délicatement les cellules à l’aide d’une pipette Pasteur et prélevez 100 microlitres de cellules.Ajoutez 1 millilitre de tampon Tyrode aux cellules et granulez-les par centrifugation. Récupérez le surnageant pour la centrifugation afin de granuler les particules de la taille d’une plaquette, et remettez les particules en suspension dans 100 microlitres de tampon Tyrode frais, puis marquez les particules avec un anticorps anti-PAK1, activez-les avec l’adénosine diphosphate pendant 20 minutes à température ambiante, et analysez le pourcentage d’événements positifs PAK1 par cytométrie en flux. Le pourcentage typique de cellules CD34 positives dans le sang de cordon ombilical est d’environ 1,3 % et la pureté des cellules CD34 positives CD34 positives après isolement varie de 90 à 99 %. Les mégacaryocytes CD41 positifs sont observés tôt dans les cultures cellulaires CD34 positives sans sérum, le pourcentage de mégacaryocytes CD42a positifs matures atteignant 30 à 40 % au jour 7, et les niveaux les plus élevés de cellules doublement positives observées entre les jours 10 et 12 de la différenciation.Les mégacaryocytes en culture se présentent sous la forme de grandes cellules, généralement multinucléées, qui expriment le facteur CD42b de Von Willebrand et la P-sélectine dans leur cytoplasme. Au moins trois classes de ploïdie sont également couramment observées dans ces cultures cellulaires. Le pourcentage de mégacaryocytes qui portent des proplaquettes, de longues fibres perlées qui s’étendent à partir du corps des mégacaryocytes, est généralement d’environ 1,3 %La plupart des plaquettes du surnageant de culture cellulaire tombent dans la porte analytique des plaquettes du sang périphérique, sont positives pour le marqueur plaquettaire CD41, peuvent être activées par des agonistes plaquettaires comme l’adénosine diphosphate, comme le démontre une liaison accrue de l’anticorps monoclonal PAK1 spécifique de l’activation.Après avoir regardé cette vidéo, vous aurez une bonne compréhension de la façon d’isoler les cellules CD34 positives du sang de cordon. Vous serez également en mesure de mettre en place des cultures de différenciation des mégacaryocytes, de compter les proplaquettes et d’analyser les plaquettes et les mégacaryocytes produits in vitro. N’oubliez pas que travailler avec des échantillons humains peut être dangereux et que des précautions, telles que le travail dans une enceinte de sécurité biologique de classe II, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

megakaryocyte-differentiation-platelet-formation-from-human-cord

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo démontre une technique de différenciation des mégacaryocytes et de formation des plaquettes. Les cellules souches progénitrices hématopoïétiques – isolées du sang de cordon ombilical humain – se différencient en mégacaryocytes matures en présence de thrombopoïétine. Les mégacaryocytes matures produisent des extensions cytoplasmiques appelées proplaquettes, qui donnent naissance à des plaquettes individuelles.

Méthode in vitro pour la différenciation des mégacaryocytes et la formation plaquettaire

Nous présentons ici pluripotentes humaines protocoles de culture de cellules souches (hPSC), utilisés pour différencier les hPSCs en CD34+ progéniteurs hématopoïétiques. Cette méthode utilise la manipulation spécifique au stade de canonique WNT de signalisation indiquer les cellules exclusivement pour le programme hématopoïétique de définitif ou primitif.

Réalisé la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitif des cellules souches pluripotentes humaines

Ici, nous présentons un protocole pour la caractérisation immunophenotypic et la différenciation induite par cytokine du sang de cordon dérivé CD34- cellules hématopoïétiques de tige et progénitrice aux quatre lignées myéloïdes. Les applications de ce protocole comprennent des études sur l'effet des mutations de la maladie myéloïde ou de petites molécules sur la différenciation myéloïde descellules CD34.

Différenciation pan-myéloïde du sang de cordon humain Dérivé CD34- Cellules hématopoïétiques de tige et progénitrice

Cette méthode décrit la purification par cytométrie en flux de MEP et de MKp à partir de fémurs, de tibias et d’os pelviens de souris.

Isolement des progéniteurs mégacarytaires de souris

Ce protocole décrit en détail toutes les étapes impliquées dans l’obtention de progéniteurs hématopoïétiques CD34+ dérivés de leucofiltres et leur différenciation et maturation in vitro en mégacaryocytes proplaquettaires capables de libérer des plaquettes dans le milieu de culture. Cette procédure est utile pour l’analyse approfondie des mécanismes cellulaires et moléculaires contrôlant la mégacaryopoïèse.

Filtres de leucodeplétion Des cellules CD34+ dérivées comme source cellulaire pour étudier la différenciation des mégacaryocytes et la formation de plaquettes

Ici, nous présentons une stratégie d’immunophenotyping pour la caractérisation de la différenciation de megakaryocyte, et montrons comment cette stratégie permet le tri des megakaryocytes à différentes étapes avec un trieur de cellules fluorescence-activé. La méthodologie peut être appliquée aux tissus primaires humains, mais aussi aux mégacaryocytes générés en culture in vitro.

Immunophénotypage et tri cellulaire des MKs humains provenant de sources primaires humaines ou différenciés in vitro à partir de progéniteurs hématopoïétiques

La modélisation de l’érythropoïèse offre une occasion précieuse de comprendre l’importance biologique des acteurs de ce processus et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques susceptibles d’atténuer les défauts de différenciation. Nous décrivons ici une méthode simple et fiable pour différencier efficacement les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices CD34+ ex vivo.

Un pipeline complet pour évaluer l’efficacité de l’érythropoïèse humaine in vitro et ex vivo

Nous décrivons une méthode pour générer des cellules T régulatrices, de mémoire et naïve d'un donneur de sang humain unique. Polarisée Tregs peut être ensuite comparé à des sous-ensembles d'autres dans une variété d'applications génétiques et fonctionnelles avec une homogénéité génétique, y compris un test de suppression aussi détaillé ici.

Génération de cellules T régulatrices induites de l&#39;homme primaires cellules T naïves et mémoire

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Nous rapportons ici une technique expérimentale de la microscopie de fluorescence intravitale de visualiser hétérotypiques plaquettes neutrophiles interactions sur l'endothélium activé lors de l'inflammation vasculaire et la formation de thrombus chez des souris vivantes. Cette technologie microscopique seront très utiles pour étudier le mécanisme moléculaire de la maladie vasculaire et de tester des agents pharmacologiques dans des conditions physiopathologiques.

Imagerie en temps réel des hétérotypique plaquettes neutrophiles interactions sur l&#39;endothélium activé lors de l&#39;inflammation vasculaire et la formation de thrombus chez des souris vivantes

Découvrez la différenciation des mégacaryocytes et la formation plaquettaire à partir de cellules CD34+ du sang de cordon humain. Cette méthode permet d'isoler des populations cellulaires viables avec une pureté de 90 à 99%.

Différenciation du mégacaryocyte et plaquettes Formation de l’homme cordon CD34 dérivés du sang des cellules⁺

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