Déterminer le taux de décroissance de Genome-wide transcription dans les fibroblastes humains proliférantes et repos

L’objectif global de cette procédure est de surveiller les taux de décomposition des transcrits dans les fibroblastes proliférants et quiescents. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie moléculaire, par exemple si les changements dans l’expression des gènes résultent de changements dans le taux de décomposition des transcrits. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit des informations sur le taux de décomposition des transcrits, et pas seulement sur l’abondance des transcrits.

Pour commencer le protocole, établissez des cultures proliférantes et quiescentes de fibroblastes. Les fibroblastes en prolifération doivent être trypsinisés régulièrement. Des cultures au repos peuvent être établies en laissant les plaques atteindre la confluence avec des changements réguliers de milieu.

Ajouter ActD 150 microlitres à un milieu préchauffé de 10 millilitres pour toutes les plaques de culture cellulaire répliquées biologiques. Ajouter ActD à une concentration de 15 microgrammes par millilitre de milieu. Mélangez bien la solution.

Aspirez l’ancien milieu et ajoutez du milieu contenant l’ActD aux cellules. Pour prélever l’échantillon à point temporel zéro, aspirez doucement le milieu ActD et pipetez entre cinq et 10 millilitres de PBS préchauffé sur une plaque de 100 millimètres, cinq millilitres de solution pour une plaque de 100 millimètres, deux millilitres pour un puits d’une plaque de six puits et un millilitre pour un puits d’une plaque de 12 puits. Aspirez doucement le PBS.

Ajoutez ensuite la solution d’isothiocyanate de phénol-guanidine directement dans la plaque de culture tissulaire. Pipetez le mélange cellulaire de solution d’isothiocyanate de phénol-guanidine de haut en bas plusieurs fois pour obtenir un mélange homogène. Collectez chaque point temporel une fois que le laps de temps approprié s’est écoulé, en utilisant la méthode décrite précédemment.

Incuber les échantillons à température ambiante pendant cinq minutes pour assurer la dissolution complète des complexes ARN-protéines. Ensuite, introduisez des transcrits contrôlés de pointe qui peuvent être détectés avec la méthodologie utilisée. Introduire ces témoins dans chaque échantillon à une quantité et à une concentration connues.

À l’aide d’une pipette, transférez le mélange de solution d’isothiocyanate de phénylguanidine dans un tube de microcentrifugation de 2,0 millilitres. Ajoutez ensuite 0,2 millilitre de chloroforme au mélange de solution d’isothiocyanate de phénylguanidine pour chaque millilitre de solution d’isothiocyanate de phénylguanidine utilisé. Agitez vigoureusement le tube de la microcentrifugeuse pendant 15 secondes, puis incubez l’isothiocyanate de phénylguanidine chloroforme.

Après l’incubation, faites tourner les échantillons à 12 000 fois g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. L’échantillon doit se séparer en trois couches. Transférez la couche aqueuse dans un nouveau tube de microcentrifugation de 2,0 millilitres à l’aide d’une micropipette et veillez à ne pas perturber l’interphase pendant ce processus.

Jetez les fractions interphasiques et organiques. Ajoutez ensuite un volume égal de 2-Propanol à la fraction aqueuse et retournez le tube 10 fois. Ajouter jusqu’à un microlitre de 20 milligrammes par millilitre de glycogène aqueux pour 20 microlitres d’échantillon, surtout si le rendement est censé être faible.

Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 minutes. Après l’incubation, essorez les échantillons. Assurez-vous qu’à la fin de l’essorage, l’ARN a précipité pour former une pastille au fond du tube.

À l’aide d’une pipette, retirez et jetez le surnageant en prenant soin de ne pas déranger la pastille d’ARN blanc. Ajouter un millilitre d’éthanol à 75 % par millilitre de réactif de solution d’isothiocyanate de phénylguanidine pour laver la pastille. Faites tourner les échantillons à 12 000 fois g pendant 10 minutes.

Après avoir retiré la majeure partie du surnageant, utilisez une pipette pour retirer autant d’éthanol que possible, mais ne dérangez pas la pastille. Essore les échantillons pour granuler tout excès d’éthanol. La pastille d’ARN est moins compacte à cette étape et a tendance à se déplacer.

Après l’essorage, retirez tout l’excès d’éthanol du tube sans déranger le granulé. Laissez la pastille d’ARN sécher à l’air libre pendant cinq minutes. Ajoutez 50 microlitres d’eau sans nucléase à la pastille d’ARN et remettez la pastille en suspension dans de l’eau sans nucléase.

Traitez les échantillons d’un microlitre de Deanase pour éliminer l’ADN, puis inactivez la Deanase et les cations. Conservez les échantillons d’ARN dans des tubes de microcentrifugation de 2,0 millilitres à moins 80 degrés Celsius. Quantifiez l’ARN et vérifiez sa pureté à l’aide d’un spectrophotomètre.

Après avoir vérifié la pureté, analysez l’ARN avec un gel d’agarose à 1 % pour visualiser l’étendue de la dégradation. Deux bandes claires représentant l’ARNr 18S et 28S doivent être clairement visibles. Si ces bandes ne sont pas visibles, l’ARN peut être dégradé.

Ensuite, surveillez l’abondance des transcrits dans les aliquotes de collecte d’ARN par rapport à l’étalon interne enrichi à l’aide de la qPCR en temps réel. Les microréseaux, le séquençage de l’ARN ou les transferts de Northern peuvent également être utilisés. Les intensités de fluorescence dans le temps correspondent à l’expression des gènes.

Alors que les fibroblastes deviennent inhibés par contact, le Collagène 3A1, un gène très important pour la création de la matrice extracellulaire déposée lors de la cicatrisation des plaies, devient plus stable et ne se décompose pas aussi rapidement. N’oubliez pas que travailler avec du phénol peut être extrêmement dangereux et qu’il est important de ne pas le laisser toucher votre peau. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de surveiller les taux de décomposition des transcrits dans les fibroblastes proliférants et quiescents.

Les changements dans le taux de décomposition des transcrits peuvent être un mécanisme important de la triangulation des gènes.