Name: Déterminer le taux de décroissance de Genome-wide transcription dans les fibroblastes humains proliférantes et repos (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Apprenez à surveiller les taux de décroissance des transcrits dans les fibroblastes humains proliférants et quiescents. Cette méthode permet d'identifier les gènes à décroissance différentielle et d'étudier la régulation de l'expression génique.

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HAC était le savant Milton E. Cassel de la Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Ce travail a été financé par des dons à la HAC from the National Institute of General Medical Sciences Centre bourse d’Excellence GM071508 P50 (P.I. David Botstein), PhRMA Foundation grant 2007RSGl9572, National Science Foundation Grant OCI-1047879 à David août, National Institute of General Medical Sciences R01 GM081686, Institut National des Sciences médicales générales R01 GM0866465, l’Eli &#38; Edythe Broad Centre de médecine régénératrice &#38; Stem Cell Research, NIH Health Center/UCLA ILEC féminin Iris Cantor Grant UL1TR000124 et la leucémie Lymphoma Society. Recherche rapporté dans cette publication a été financée par le National Cancer Institute de la National Institutes of Health, sous attribution numéro P50CA092131. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit. HAC est membre de l’Eli &#38; Edythe large Centre de médecine régénératrice &#38; Stem Cell Research, l’Institut de biologie moléculaire de UCLA et le programme interministériel de bioinformatique de UCLA.

Toutes les expériences décrites ont été approuvées par les comités de révision institutionnelle à l’Université de Princeton et l’Université de Californie, Los Angeles.
1. Préparez les fibroblastes prolifèrent et inhibées par Contact décours temporel ActD
Remarque : Ce protocole utilise un timecourse avec quatre points. Trois échantillons biologiquement indépendants peuvent être collectées par validant en recueillant des plaques de culture de tissus différents dans une expérience, ou l’expérience peut être répétée plusieurs fois avec différentes cultures de cellules. Dans notre expérience, un plat de culture de tissu de 10 cm (diamètre) (une plaque) fournit RNA suffisante pour l’analyse. Si nécessaire, plusieurs plats de culture de tissus peuvent être mis en commun pour chaque échantillon d’augmenter le nombre de cellules à chaque validant. En outre, la même expérience peut être effectuée avec fibroblastes isolées de différents individus comme réplique biologique réellement indépendante.
<ol>
	<li>Établir proliférantes et repos des cultures de cellules pour l’analyse de désintégration de transcription. Pour les cellules en prolifération, fractionner les cellules de tous les trois jours alors que les cellules inhibées par contact deviennent inhibées par contact.
	<ol>
		<li>Pour les cellules inhibées par contact, changer le milieu tous les 2 jours pendant 7 jours. Fractionner les cellules en prolifération 2 jours avant que les fibroblastes contact inhibées sont prêts pour la collection. Un exemple d’un système de culture cellulaire est illustré à la Figure 1. Les étapes restantes de cette section fournissent un protocole détaillé pour l’établissement et la Division des cellules.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Isoler des fibroblastes dermiques primaires de peau néonatale selon les protocoles établis,13. Fibroblastes de passage pour assurer une population homogène. Remarque : Les fibroblastes peuvent être congelés et décongelés, si nécessaire.</li>
	<li>Fondre ou replate des fibroblastes, si nécessaire. Cultiver des fibroblastes en DMEM avec 10 % de sérum dans des conditions stériles dans un incubateur de culture tissulaire à 37 ° C et 5 % de CO2. Utilisez les fibroblastes qui ont été cultivés pour moins de 10 passages. Fibroblastes devraient être &#60; confluente de 80 % le jour de fractionnement de cellules pour rendre les populations proliférantes et repos.</li>
	<li>Pour fractionner une plaque de culture tissulaire en plusieurs plaques, Préchauffer le PBS, la trypsine et support avec du sérum dans un bain-marie à 37 ° C pendant 20 min.</li>
	<li>Aspirer ou utilisez une pipette pour retirer le support de chaque plaque de culture tissulaire avec des cellules pour être replaquées.</li>
	<li>Pipette PBS chaude dans chaque assiette (10 mL de solution pour une plaque de 150 mm, de 5 mL de solution pour une plaque de 100 mm, de 2 mL pour un puits d’une 6 plaque puits) et 1 mL pour un puits d’une plaque bien 12.</li>
	<li>Aspirer ou pipette pour enlever les PBS de chaque plaque de culture de tissus.</li>
	<li>Doucement la pipette 1 x trypsine-EDTA sur chaque plaque (8 mL de solution pour une plaque de 150 mm, 3 mL de solution pour une plaque de 100 mm, 2 mL pour un puits d’une plaque 6 puits et 1 mL pour un puits d’une plaque bien 12). Remarque : Veillez à 1 x trypsine-EDTA en diluant stérile 10 x la trypsine-EDTA dans du PBS stérile. La solution finale 1 x devrait être EDTA de trypsine et 0,02 % 0,05 %.</li>
	<li>Incuber la trypsine avec cellules pendant 5 min.</li>
	<li>Tapoter légèrement la plaque pour déloger les cellules de la plaque.</li>
	<li>Pipette pour remettre en suspension les cellules en suspension monocellulaire.</li>
	<li>Transférer des cellules dans une solution de trypsine dans un tube conique contenant le même volume de DMEM avec 10 % de sérum (8 mL de solution pour une plaque de 150 mm, 3 mL de solution pour une plaque de 100 mm, 2 mL pour un puits d’une plaque 6 puits et bien sur plaque de 1 mL pour un puits de 12).</li>
	<li>Tournez les cellules à 4 ° C pendant 5 minutes à 1 000 g pour enlever la trypsine.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules dans un volume approprié de médium et comptent avec un Hémacytomètre afin de déterminer la concentration cellulaire.</li>
	<li>Graines de 5 x 105 cellules par plaque de vitroplants de 100 mm pour proliférer et inhibées par contact des cellules.</li>
	<li>En utilisant cette méthode, établir les échantillons proliférantes et inhibées par contact requis pour l’analyse (Figure 1).</li>
</ol>
2. évolution temporelle de l’ActD
<ol>
	<li>Resuspendre ActD à une stock concentration de 1 mg/mL (pour 1 mg de ActD, utilisation 950 µL de PBS stérile et 50 µL de DMSO stérile). Remarque : Les solutions mères congelées de ActD devraient être stables pendant un mois à-20 ° C. Solutions diluées doivent être jetées et pas stockées pour une utilisation ultérieure.</li>
	<li>Ajouter ActD au volume approprié du milieu préchauffée pour la culture biologique cellulaire répétées toutes les plaques qui ont été mis en place pour le 0, 120, 240 et 480 min h (Figure 2). Ajouter ActD à une concentration de 15 µg / mL de milieu. Bien mélanger, aspirer hors milieu vieux et ajouter le milieu contenant ActD aux cellules.
	<ol>
		<li>Pour un stock de 1 mg/mL, ajouter 15 µL ActD pour chaque mL de milieu, par exemple, pour 10 mL de milieu pour une plaque de 100 mm, ajouter 150 µL ActD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pour recueillir l’échantillon de validant zéro, aspirez doucement hors l’ActD moyen et pipette préchauffé PBS sur les cellules. Pipette 10 mL de solution pour une plaque de 150 mm, 5 mL de solution pour une plaque de 100 mm, 2 mL pour un puits d’une plaque 6 puits et 1 mL pour un puits d’une plaque bien 12.</li>
	<li>Aspirer doucement ou pipette hors du PBS. Remarque : Toutes les étapes impliquant les ARN devraient être effectuées avec eau exempte de RNase, tubes de microcentrifuge RNase-libre et exempte de RNase pipettes. Gants doivent être portés et changés fréquemment lorsque vous travaillez avec de l’ARN.</li>
	<li>Ajouter solution de phénol-guanidine isothiocyanate (1 mL/10 cm plaque avec 4 x 10,5 , 4 x 107 cellules) directement sur la plaque de culture de tissus. NOTE : Phénol-guanidine isothiocyanate solution est une solution de monophasique qui maintient la qualité de RNA tout en lysant des cellules et en séparant les ARN, ADN et protéines de l’autre. ATTENTION : L’isothiocyanate de phénol et de guanidine sont corrosifs. Utilisez une protection appropriée.</li>
	<li>Pipette le phénol-guanidine isothiocyanate solution-cellule mélange monter et descendre plusieurs fois de faire un mélange homogène. NOTE : Solution d’isothiocyanate de phénol-guanidine lysate peut être conservée à 4 ° C durant la nuit ou à-20 ° C pendant un an.</li>
	<li>Collecter chaque point dans le temps après que le laps de temps approprié est passé à l’aide de la méthode décrite dans les étapes 2,3-2,6.</li>
</ol>
3. l’isolement d’ARN Total de phénol-guanidine Isothiocyanate Solution lysat
<ol>
	<li>Incuber les échantillons à la température ambiante pendant 5 min assurer la dissolution complète des complexes ARN-protéine. Remarque : Les étapes du protocole solution phénol-guanidine isothiocyanate peuvent être effectuées à la température ambiante à moins d’indication contraire.</li>
	<li>Introduire des transcriptions de spike-in de contrôle qui peuvent être décelées à la méthodologie utilisée.</li></ol>Introduire chaque échantillon à une quantité connue et une concentration de ces contrôles. Remarque : L’externe RNA control consortium (SCGDE) contrôle spike à mix14 a été spécialement conçu comme un contrôle du pic pour RNA-Seq. Il peut être également utilisé pour Northern blots ou qPCR en temps réel. Spike-dans les contrôles spécialement conçus pour microarray technologies sont également disponibles (voir la Table des matières).
	<li>Transférer le mélange de solution phénol-guanidine isothiocyanate dans un tube de microcentrifuge de 2,0 mL avec une pipette. Ajouter 0,2 mL de chloroforme au mélange phénol-guanidine isothiocyanate solution pour chaque 1 mL de solution de l’isothiocyanate de phénol-guanidine utilisée (par exemple, ajoutez 0,3 mL de chloroforme à 1,5 mL phénol-guanidine isothiocyanate solution de mélange).</li>
	<li>Agiter le tube de microcentrifuge vigoureusement pendant 15 s et puis incuber mélange phénol-chloroforme-guanidine isothiocyanate à température ambiante pendant 3 min.</li>
	<li>Tourner les échantillons à 12 000 x g pendant 20 minutes à 4 ° C. Remarque : Après la rotation initiale, l’échantillon devrait séparer en 3 couches - une couche organique rouge au bas, une interphase blanc/rose au milieu et une couche aqueuse limpide sur la partie supérieure (Figure 3).</li>
	<li>Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube de microtubes de 2,0 mL à l’aide d’une micropipette. Remarque : Veillez à ne pas déranger l’interphase au cours de ce processus. C’est OK de laisser certains de la fraction aqueuse. Il est préférable de laisser certaines de la fraction aqueuse que pour inclure certains des couches interphase, comme notamment l’interphase couche contaminerait l’ARN à l’ADN. La couche aqueuse sera environ la moitié de son volume initial, donc environ 0,9 mL si le mélange de solution/chloroforme de l’isothiocyanate de phénol-guanidine était de 1,8 mL.</li>
	<li>Jeter l’interphase et fractions organiques.</li>
	<li>Ajouter un volume égal de propanol-2 à la fraction aqueuse et inverser le tube 10 fois. Ajouter jusqu'à 1 µL de 20 mg/mL de solution aqueuse de glycogène par 20 µL de l’échantillon, en particulier si le rendement devrait être faible, parce que moins de 106 cellules ont été recueillis. Remarque : Cela se traduira dans un culot dense et solid qui est facile à suivre après les étapes de spin qui suivent.</li>
	<li>Incuber les échantillons à la température ambiante pendant 10 min.</li>
	<li>Tourner les échantillons à 12 000 x g pendant 20 minutes à 4 ° C. Veiller à ce que, à la fin de cette rotation, l’ARN a précipité pour former une pastille blanche au fond du tube.</li>
	<li>Avec une pipette, retirer et jeter le surnageant prenant soin à ne pas déranger le culot de RNA blanc. Remarque : Un embout de la pipette lâche qui s’est tenu dans la main peut être utilisé pour enlever l’excès d’éthanol. Si la pastille de RNA est perturbée, mais pas mis au rebut, l’enquêteur peut répéter le spin et éliminer le surnageant à nouveau. Éviter de jeter le culot qu’il faudra pour l’enquêteur de répéter l’ensemble de la procédure.</li>
	<li>Préparer une solution d’eau de 75 % d’éthanol et 25 % d’exempte de nucléase. Ajouter 1 mL d’éthanol à 75 % par 1 mL de réactif de solution phénol-guanidine isothiocyanate de laver le culot.</li>
	<li>Faites tourner les échantillons à 12 000 x g pendant 10 min à 4 ° C.</li>
	<li>Après avoir enlevé la majeure partie du liquide surnageant, utiliser une pipette de supprimer autant d’éthanol possible, tout en prenant toujours soin pour ne pas déranger le culot. Remarque : Le culot de RNA est moins compact à cette étape et a tendance à bouger. Soyez très prudent lorsque vous manipulez le culot à ce stade pour éviter de perdre de l’ARN.</li>
	<li>Tissent des échantillons 12 000 x g pendant 2 min à température ambiante pour granuler tous les excès d’éthanol.</li>
	<li>Retirer tous les excès d’éthanol du tube à l’aide d’une micropipette en prenant soin de ne pas déranger le culot.</li>
	<li>Laissez l’air de pellet RNA sécher pendant 5 min.</li>
	<li>Ajouter 50 µL d’eau exempte de nucléase dans le culot de RNA et Resuspendre le culot dans l’eau exempte de nucléase.</li>
	<li>Traiter les échantillons avec 1 µL DNase (2 unités/µL) d’enlever les ADN et puis inactiver DNase et cations (voir Table des matières).</li>
	<li>Stocker les échantillons d’ARN dans des tubes de microcentrifuge de 2,0 mL à-80 ° C.</li>

4. analyse de l’abondance de transcription
<ol>
	<li>Quantifier le RNA et vérifier la RNA pureté à l’aide d’un spectrophotomètre. NOTE : Le rapport de l’absorbance à 260 nm à 280 nm devrait être approximativement 2.0 pour l’ARN.</li>
	<li>Analyser les RNA avec un gel d’agarose à 1 % ou une technologie équivalente pour visualiser l’étendue de la dégradation. Remarque : Deux efface bandes représentant 18 s et ARNr 28 s devrait être clairement visible (Figure 4). Si ces bandes ne sont pas visibles, l’ARN peut-être être altérée. Conseils de prise de vue trouble pour la dégradation de l’ARN sont fournis dans la Discussion.</li>
	<li>Moniteur transcription abondance dans les aliquotes recueillies de l’ARN par rapport aux dopés dans étalon interne à l’aide de puces à15, RNA-Seq16, qPCR en temps réel17ou Northern blots18.
	<ol>
		<li>Déterminer l’abondance pour chaque relevé de notes à chaque point dans le temps par rapport à un contrôle pointu d’abondance connue. Remarque : Pour les puces, les valeurs seront intensités de fluorescence. Pour les taches du Nord, bandes sur la radiographie peuvent être quantifiés. Pour qPCR en temps réel, abondance de transcription peut être déterminée par comparaison avec des normes connues avec la méthode 2 duT - σσC19. Pour RNA-Seq, valeurs normalisées peuvent être déterminées comme FPKM ou fragments par kilobases de l’exon par million lectures mappé. Pour la vitesse de décomposition de l’isoforme spécifique, RNA-Seq données peuvent être analysées conformément aux méthodes prenant en charge isoform comme DEXSeq20. Taux de décroissance de l’isoforme spécifique sont mieux déterminées avec RNA-Seq. Si elles sont établies avec les données microarray, puis les données doivent être analysées sur une base de par-sonde plutôt que sur une base de gène par gène. L’analyste doit être prudent dans l’interprétation des informations provenant d’un nombre limité de sondes. Par exemple, il peut y avoir des sondes 5 ou moins qui ont un caractère informatifs sur une isoforme particulière. Dans ce cas, l’analyste devra déterminer si le comportement de ces sondes est une cohérence suffisante afin que les résultats sont fiables.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Effectuer en temps réel qPCR RNA isolés17 dans les échantillons collectés pour analyser les gènes rapidement en décomposition, comme c-Myc et un gène lentement en décomposition comme GAPDH, gagner confiance cette désintégration de transcription taux ont été détectés avec précision. Remarque : Pour une confirmation supplémentaire, isoforme spécifique en temps réel qPCR sondes peuvent être développés et utilisés pour surveiller l’abondance des isoformes spécifiques au fil du temps,21.</li>
</ol>
5.Détermination constante de désintégration taux
<ol>
	<li>Pour chaque validant, Journal-transformer les valeurs d’abondance pour chaque transcription (gène-spécifique ou isoforme spécifique). NOTE : Log-transformer les valeurs convertira les courbes de décroissance exponentielle lignes qui peut être adapté avec une décroissance linéaire modèle22.</li>
	<li>Correspondait au profil d’expression pour chaque relevé de notes (gène-spécifique ou isoforme spécifique) à un modèle de décroissance linéaire. La formule pour un tel modèle est f (t) = C - r * t. Dans cette équation, C est une constante qui représente le montant de départ d’une transcription, r est le taux de déclin, et t est le temps depuis le début de l’expérience. À partir de cette équation, déterminer la vitesse de décroissance comme r*ln(10) (voir référence11). Remarque : Le logiciel maSigPro est une approche axée sur la régression visant à déceler des différences significatives gène expression profil temps cours données23. Exemples de code et de résultats pour maSigPro sont disponibles à : https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf.</li>
	<li>Filtrer les gènes qui ne parviennent pas à s’adapter un modèle log-linéaire de décomposition. Ceci peut être accompli avec un test ANOVA F. NOTE : le test F est basé sur la statistique F, qui est définie comme la variation entre la moyenne de l’échantillon divisée par la variation au sein d’échantillons. Corriger les valeurs de p pour les comparaisons multiples en appliquant le linéaire Step-Up Benjamini et Hochberg fausse découverte procédure24. Q-valeur supérieure à 0,05 avec le F-test peut être utilisé comme un seuil pour les gènes qui ne parviennent pas à s’adapter un modèle log-linéaire de décomposition.</li>
	<li>Effectuer un test ANOVA F pour déterminer les transcriptions d’une durée d’une interaction significative entre une condition catégorique cycle cellulaire et l’heure (taux de fausse découverte, FDR &#60; 0,05).</li>
</ol>

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Les auteurs n’ont aucun intérêt concurrentes de divulguer.

Quiescence peut être induite par des signaux externes, y compris le retrait des mitogènes ou le sérum, le manque d’adhésion cellulaire et l’inhibition de contact. Inhibition de contact, un des plusieurs méthodes possibles pour induire la quiescence, est un processus hautement évolutives conservé dans lequel les cellules sortie prolifératif cycle cellulaire en réponse à un contact cellule-cellule. Nous nous concentrons ici sur l’inhibition de contact à titre d’exemple d’une méthode pour induire la quiescence. Des études a...

Niveaux de l’état stationnaire de transcriptions reflètent la contribution de synthèse de transcription et de désintégration de la transcription. Réglementé et décomposition de transcription coordonnée est un mécanisme important pour contrôler les processus biologiques1,2,3,4. Par exemple, la vitesse de décomposition transcription ont démontré à contribuer à la série temporelle des événements après l’activation par le facteur de nécrose tumorale de cytokines inflammatoires5.
Nous avons déjà montré que la transition entre la prolifération et de la quiétude dans les fibroblastes humains primaires est associée aux changements dans les niveaux de transcription de nombreux gènes6. Certains de ces changements reflètent des différences dans l’activité de facteurs de transcription entre ces deux États.
Changements dans les taux de décroissance de transcription peuvent également contribuer à des changements dans le niveau d’expression d’un transcrit dans deux États différents7,8. D’après nos constatations antérieures que la transition entre la prolifération et la quiescence est associée aux changements dans les niveaux de multiples microARN9, nous avons demandé s’il y a également une contribution de désintégration de transcription différentielle dans les changements expression des gènes chez prolifèrent par rapport aux fibroblastes quiescentes.
Afin de contrôler la stabilité de la transcription, nous avons déterminé le taux de décomposition des transcriptions Génome-large en proliférant versus cellules quiescentes. Pour ce faire, nous avons mesuré la vitesse de décomposition en proliférant versus quiescentes fibroblastes en introduisant un inhibiteur de la nouvelle transcription et surveillance de la fréquence à laquelle des relevés de notes individuels ont disparu au fil du temps. L’avantage de cette approche est que, comparativement aux méthodes qui surveillent tout simplement l’expression des gènes globale, en inhibant la synthèse nouvelle transcription, nous serons en mesure de déterminer la vitesse de décroissance de ces transcriptions indépendamment de la vitesse à laquelle ils doivent transcription de l’acte.
ActD traitement d’inhiber la nouvelle transcription et déterminer le taux de décroissance de transcription a été appliqué avec succès dans plusieurs études antérieures. ActD a été utilisé pour disséquer l’importance de la stabilité du RNA dans les changements dans l’abondance de transcription qui résultent d’un traitement par des cytokines pro-inflammatoires,5. Une approche similaire a également servie à disséquer les différences dans les taux de décroissance de transcription en multiplient par rapport aux cellules C2C12 différenciées qu’ils adoptent un muscle différenciée phénotype10. Comme autre exemple, global mRNA demi-vies ont également été détectés dans pluripotentes et11des cellules souches embryonnaires de souris différenciées. Dans ces exemples, dégradation de l’ARNm s’est avérée être important pour réglementer l’abondance de la transcription et la transition de cellules à cellules différents États.
Appliquant les méthodes décrites ci-dessous, nous avons découvert changements dans les taux de décroissance de transcription dans environ 500 gènes lorsque l'on compare les fibroblastes prolifèrent et quiescentes États12. En particulier, nous avons découvert que les cibles des miARN miR-29, qui est diminuée dans les cellules quiescentes, sont stabilisés lorsque des cellules de transition de quiescence. Nous décrivons ici la méthodologie que nous permet de déterminer la vitesse de décomposition dans les cellules prolifèrent et repos. Cette méthode est utile pour comparer global taux de décomposition des ARNm dans deux distincts mais comparables si l'on cherche des informations sur la décomposition rapide des gènes. Il pourrait également être utilisé pour traiter d’autres questions telles que l’effet des conditions de culture cellulaire sur la décomposition de transcription, par exemple, en deux dimensions par rapport à trois dimensions cultures. La vitesse de décomposition peut être déterminée Génome-large avec des méthodes telles que les puces ou RNA-Seq. alternativement, en temps réel qPCR ou Northern blot peut être utilisé pour déterminer le taux de décomposition sur une base de gène par gène ou isoform-par-isoforme. Ces taux permet ensuite de calculer la demi-vie de chaque gène surveillé et d’identifier les gènes avec des taux de décomposition qui sont différents dans les deux conditions.

<table><tbody><tr><td>Centrifugeuses pour tubes de microcentrifugation capables d’atteindre 12 000 x g et 4&deg ; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Équipement pour l’utilisation de gels d’agarose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire stériles et tubes</td><td></td><td></td><td></td>coniques</tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>VWR</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques, pipettes et pointes de pipette stériles pour la culture tissulaire</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes, pointes de pipette et tubes jetables sans RNase emballés individuellement pour l’isolement et l’analyse</td><td></td><td></td><td></td>de l’ARN</tr><tr><td>Gants jetables à porter lors de la manipulation de réactifs et d’échantillons</td><td></td><td></td><td></td>d’ARN</tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td>Pour décontaminer les surfaces de travail des tubes</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td>EPPENDORF RNase<td>2,0 ml</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA&nbsp ; Solution 10X</td><td>Millipore Sigma</td><td>9002-07-07</td><td></td></tr><tr><td>Stérile PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycine D</td><td>Millipore Sigma</td><td>A1410-2 mg</td><td>inhibe la transcription</td></tr><tr><td>DMSO stérile</td><td>Fisher Scientific</td><td>31-761-00ML</td><td>solvant pour actinomycine D</td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ICN19400225</td><td>MP Biomedicals, Inc produit</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618500</td><td>biologie moléculaire Éthanol</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>BP28184</td><td>biologie moléculaire Glycogène</td></tr><tr><td>sans RNase (20 mg/ml solution aqueuse)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0551</td><td>transporteur pour la précipitation de l’ARN</td></tr><tr><td>Kit TURBO sans ADN</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1907</td><td>élimine l’ADN avec la DNase, puis, dans une étape ultérieure, inactive l’ADN et élimine les cations divalents</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ICN820721</td><td>MP Biomedicals, Inc produit</td></tr><tr><td>Colorant de chargement pour gel d’ARN</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0641</td><td>adapté même pour la dénaturation des</td></tr><tr><td>marqueurs</td> <td>d’ARN MilleniumThermo Fisher Scientific</td><td>AM7150</td><td>Échelle d’ARN</td></tr><tr><td>Unicolore Kit de pointe d’ARN</td><td>Agilent Technology</td><td>5188-5282</td><td>Exemple de contrôle de pointe pour l’analyse des microréseaux Agient</td></tr><tr><td>Base Tris Base Fisher</td><td></td><td>Scientific BP152-1</td><td>Biologie moléculaire, pour tampon TAE</td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>pour tampon TAE</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td>grade d’électrophorèse, pour gels</td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7637</td><td>pour la biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Consortium de contrôles d’ARN externes Mélange de pointes d’ARN Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>4456740</td><td>Contrôle de pointes pour le séquençage d’ARN</td></tr><tr><td>TruSeq Kit de préparation de bibliothèque d’ARNm brin A (48 échantillons, 12 indices)</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2101</td><td>pour le séquençage d’ARN</td></tr><tr><td>Plaque PCR 96 puits 0,3 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0600</td><td>pour qPCR en temps réel</td></tr><tr><td>Joints adhésifs Microseal B</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td>pour qPCR en temps réel</td></tr><tr><td>Réservoirs de réactifs sans Rnase/Dnase</td><td>VWR</td><td>89094-662</td><td>pour qPCR en temps réel</td></tr><tr><td>Sans Rnase/Dnase Huit bandelettes et capuchons de tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>AM12230 pour qPCR</td></tr> <tr><td>en temps réelSuperScript Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18090010</td><td>pour qPCR en temps réel</td></tr><tr><td>Perles AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>pour qPCR en temps réel</td></tr></tbody></table>

déterminer le taux de décroissance de genome-wide transcription dans les fibroblastes humains proliférantes et repos

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Quiétude est un état temporaire, réversible dans lequel les cellules ont cessé la division cellulaire, mais conservent la capacité à proliférer. Plusieurs études, y compris la nôtre, ont démontré que la quiescence est associée aux changements répandus dans l’expression des gènes. Certains de ces changements se produisent à travers des changements dans le niveau ou l’activité des facteurs associés à la prolifération de transcription E2F et MYC. Nous avons démontré que carie ARNm peut également contribuer aux changements dans l’expression des gènes entre les cellules prolifèrent et repos. Dans ce protocole, nous décrivons la procédure pour établir les cultures de fibroblastes humains par voie cutanée prépuce proliférantes et repos. Nous décrivons ensuite les procédures permettant d’inhiber la nouvelle transcription dans des cellules proliférantes et repos avec l’actinomycine D (ActD). ActD traitement représente une approche simple et reproductible de dissociant nouvelle transcription de désintégration de la transcription. Un inconvénient du traitement ActD, c’est que le cours du temps doit être limité à un court laps de temps parce que ActD affecte la viabilité des cellules. Les niveaux de transcription sont surveillés au fil du temps afin de déterminer le taux de décroissance de transcription. Cette procédure permet l’identification des gènes et des isoformes qui présentent une carie différentielle chez prolifèrent par rapport aux fibroblastes quiescentes.

Nous avons déjà rapporté les résultats d’analyses de microarray de taux de décroissance de transcription dans les fibroblastes humains primaires proliférantes et inhibées par contact sur un cours de 8 heures12. Une liste de gènes avec un changement important dans la stabilité de transcription en comparant les fibroblastes proliférants et inhibées par contact est fournie dans le Tableau complémentaire 1. Les intensités de fluorescence au temps zéro ...

Les auteurs décrivent un protocole pour générer la prolifération et quiescentes fibroblastes dermiques humains primaires, surveillance des taux de décomposition de transcription et d’identifier les gènes différentiellement en décomposition.

Déterminer le taux de décroissance de Genome-wide transcription dans les fibroblastes humains proliférantes et repos

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

L’objectif global de cette procédure est de surveiller les taux de décomposition des transcrits dans les fibroblastes proliférants et quiescents. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie moléculaire, par exemple si les changements dans l’expression des gènes résultent de changements dans le taux de décomposition des transcrits. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit des informations sur le taux de décomposition des transcrits, et pas seulement sur l’abondance des transcrits.Pour commencer le protocole, établissez des cultures proliférantes et quiescentes de fibroblastes. Les fibroblastes en prolifération doivent être trypsinisés régulièrement. Des cultures au repos peuvent être établies en laissant les plaques atteindre la confluence avec des changements réguliers de milieu.Ajouter ActD 150 microlitres à un milieu préchauffé de 10 millilitres pour toutes les plaques de culture cellulaire répliquées biologiques. Ajouter ActD à une concentration de 15 microgrammes par millilitre de milieu. Mélangez bien la solution.Aspirez l’ancien milieu et ajoutez du milieu contenant l’ActD aux cellules. Pour prélever l’échantillon à point temporel zéro, aspirez doucement le milieu ActD et pipetez entre cinq et 10 millilitres de PBS préchauffé sur une plaque de 100 millimètres, cinq millilitres de solution pour une plaque de 100 millimètres, deux millilitres pour un puits d’une plaque de six puits et un millilitre pour un puits d’une plaque de 12 puits. Aspirez doucement le PBS.Ajoutez ensuite la solution d’isothiocyanate de phénol-guanidine directement dans la plaque de culture tissulaire. Pipetez le mélange cellulaire de solution d’isothiocyanate de phénol-guanidine de haut en bas plusieurs fois pour obtenir un mélange homogène. Collectez chaque point temporel une fois que le laps de temps approprié s’est écoulé, en utilisant la méthode décrite précédemment.Incuber les échantillons à température ambiante pendant cinq minutes pour assurer la dissolution complète des complexes ARN-protéines. Ensuite, introduisez des transcrits contrôlés de pointe qui peuvent être détectés avec la méthodologie utilisée. Introduire ces témoins dans chaque échantillon à une quantité et à une concentration connues.À l’aide d’une pipette, transférez le mélange de solution d’isothiocyanate de phénylguanidine dans un tube de microcentrifugation de 2,0 millilitres. Ajoutez ensuite 0,2 millilitre de chloroforme au mélange de solution d’isothiocyanate de phénylguanidine pour chaque millilitre de solution d’isothiocyanate de phénylguanidine utilisé. Agitez vigoureusement le tube de la microcentrifugeuse pendant 15 secondes, puis incubez l’isothiocyanate de phénylguanidine chloroforme.Après l’incubation, faites tourner les échantillons à 12 000 fois g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. L’échantillon doit se séparer en trois couches. Transférez la couche aqueuse dans un nouveau tube de microcentrifugation de 2,0 millilitres à l’aide d’une micropipette et veillez à ne pas perturber l’interphase pendant ce processus.Jetez les fractions interphasiques et organiques. Ajoutez ensuite un volume égal de 2-Propanol à la fraction aqueuse et retournez le tube 10 fois. Ajouter jusqu’à un microlitre de 20 milligrammes par millilitre de glycogène aqueux pour 20 microlitres d’échantillon, surtout si le rendement est censé être faible.Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 minutes. Après l’incubation, essorez les échantillons. Assurez-vous qu’à la fin de l’essorage, l’ARN a précipité pour former une pastille au fond du tube.À l’aide d’une pipette, retirez et jetez le surnageant en prenant soin de ne pas déranger la pastille d’ARN blanc. Ajouter un millilitre d’éthanol à 75 % par millilitre de réactif de solution d’isothiocyanate de phénylguanidine pour laver la pastille. Faites tourner les échantillons à 12 000 fois g pendant 10 minutes.Après avoir retiré la majeure partie du surnageant, utilisez une pipette pour retirer autant d’éthanol que possible, mais ne dérangez pas la pastille. Essore les échantillons pour granuler tout excès d’éthanol. La pastille d’ARN est moins compacte à cette étape et a tendance à se déplacer.Après l’essorage, retirez tout l’excès d’éthanol du tube sans déranger le granulé. Laissez la pastille d’ARN sécher à l’air libre pendant cinq minutes. Ajoutez 50 microlitres d’eau sans nucléase à la pastille d’ARN et remettez la pastille en suspension dans de l’eau sans nucléase.Traitez les échantillons d’un microlitre de Deanase pour éliminer l’ADN, puis inactivez la Deanase et les cations. Conservez les échantillons d’ARN dans des tubes de microcentrifugation de 2,0 millilitres à moins 80 degrés Celsius. Quantifiez l’ARN et vérifiez sa pureté à l’aide d’un spectrophotomètre.Après avoir vérifié la pureté, analysez l’ARN avec un gel d’agarose à 1 % pour visualiser l’étendue de la dégradation. Deux bandes claires représentant l’ARNr 18S et 28S doivent être clairement visibles. Si ces bandes ne sont pas visibles, l’ARN peut être dégradé.Ensuite, surveillez l’abondance des transcrits dans les aliquotes de collecte d’ARN par rapport à l’étalon interne enrichi à l’aide de la qPCR en temps réel. Les microréseaux, le séquençage de l’ARN ou les transferts de Northern peuvent également être utilisés. Les intensités de fluorescence dans le temps correspondent à l’expression des gènes.Alors que les fibroblastes deviennent inhibés par contact, le Collagène 3A1, un gène très important pour la création de la matrice extracellulaire déposée lors de la cicatrisation des plaies, devient plus stable et ne se décompose pas aussi rapidement. N’oubliez pas que travailler avec du phénol peut être extrêmement dangereux et qu’il est important de ne pas le laisser toucher votre peau. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de surveiller les taux de décomposition des transcrits dans les fibroblastes proliférants et quiescents.Les changements dans le taux de décomposition des transcrits peuvent être un mécanisme important de la triangulation des gènes.

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Genetics

Génétique

Nous décrivons les méthodes de récupération, y compris photoblanchiment de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) et la perte de fluorescence En Photobleaching (FLIP) pour suivre la dynamique des protéines dans la chromatine souches embryonnaires (ES) cellules. La dynamique des protéines de la chromatine, ce qui est considéré comme l'un des moyens d'étudier la plasticité de la chromatine, est augmentée dans les cellules pluripotentes.

Photobleaching essais (FRAP et FLIP) pour mesurer la dynamique des protéines de la chromatine dans Vivre cellules souches embryonnaires

L'ARN polymérase II cinétiques transcriptionnelles sont mesurés sur des gènes spécifiques dans les cellules vivantes. ARNm transcrit à partir du gène d'intérêt sont marqués par fluorescence et de l'utilisation de récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) la cinétique in vivo de l'élongation de la transcription sont obtenues.

Mesure de la cinétique de la transcription d&#39;ARNm dans les cellules vivantes simples

L'ARN cellulaire total donne un mauvais modèle pour l'étude des changements à court terme dans la synthèse d'ARN et de la décomposition ainsi que les cinétiques de maturation de l'ARN. Ici, nous décrivons marquage métabolique des ARN transcrits récemment avec 4 thiouridine suivie par biotinylation et purification thiol-spécifique des ARN transcrits nouvellement permettant de surmonter ces limitations.

Marquage métabolique de l&#39;ARN récemment transcrits pour une grande résolution profil d&#39;expression génique de l&#39;ARN de synthèse, le traitement et Decay en culture cellulaire

Le niveau de l'état d'équilibre des ARNm spécifiques est déterminée par le taux de synthèse et de la décomposition de l'ARNm. Taux de dégradation de l'ARNm pangénomiques ou les taux d'ARNm spécifiques de désintégration peuvent être mesurés en déterminant ARNm demi-vies. Ce protocole met l'accent sur ​​la mesure du taux d'ARNm de désintégration dans Saccharomyces cerevisiae.

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Ce protocole décrit une méthode pour déterminer la protéine demi-vies dans cellules adhérentes de vie unique, en utilisant des impulsions d’étiquetage et de Time-lapse imagerie de fluorescence des protéines de fusion SNAP-tag.

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Sur le développement neurologique des processus tels que la prolifération, la migration et la croissance des neurites sont souvent perturbées dans les maladies neuropsychiatriques. Ainsi, nous présentons des protocoles afin de rapidement et de façon reproductible évaluer ces processus neurologique dans humain iPSC dérivés PNJ. Ces protocoles permettent également l’évaluation des effets des facteurs de croissance et de la thérapeutique sur le développement de NPC.

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Système efficace d’expression plasmide contrôlée par transcription pour l’étude de la stabilité des transcriptions de l’ARNm dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires

Ce protocole décrit le flux de travail pour le marquage métabolique des cellules sénescentes et non divisées avec SILAC pulsé, l’analyse par spectrométrie de masse non ciblée et un calcul rationalisé des demi-vies des protéines.

Mesure des taux de renouvellement des protéines dans les cellules cultivées sénescentes et non divisées avec marquage métabolique et spectrométrie de masse

Ce protocole mesure quantitativement la stabilité et la demi-vie des ARN amplificateurs intergéniques et intragéniques dans les cellules souches embryonnaires de souris grâce au traitement à l’Actinomycine D, RT-qPCR et analyse de régression non linéaire. Des stratégies de normalisation spécifiques à la position sont intégrées pour modéliser avec précision la dynamique de désintégration de l’ARNe, de manière dépendante du contexte.

Évaluation quantitative optimisée de la stabilité de l’ARN d’amélioration dans les cellules souches embryonnaires de souris

Cet article présente un protocole LysoTracker pour cellules vivantes afin de mesurer le remodelage lysosomal pendant la sénescence chez les fibroblastes humains IMR-90.

Profilage lysosomal avec LysoTracker pour une évaluation quantitative de la sénescence cellulaire chez les fibroblastes humains

Apprenez à surveiller les taux de décroissance des transcrits dans les fibroblastes humains proliférants et quiescents. Cette méthode permet d'identifier les gènes à décroissance différentielle et d'étudier la régulation de l'expression génique.

Déterminer le taux de décroissance de Genome-wide transcription dans les fibroblastes humains proliférantes et repos

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