Caractérisation des Polysaccharides pariétaux Mannan chez les plantes à l’aide de rythme

L’objectif global de cette expérience est de caractériser les polysaccharides de la paroi cellulaire végétale. Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie de la paroi cellulaire végétale, notamment la structure et la quantité de glucomannane. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne nécessite pas de formation spécialisée ou d’équipement coûteux.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à interpréter les gels, de sorte que l’inclusion et la compréhension de tous les contrôles décrits sont essentielles. L’alcool et les résidus solubles, ou AIR, sont préalablement préparés à partir de matières végétales récoltées comme décrit dans le protocole textuel. Pesez six milligrammes d’AIR dans un tube à centrifuger de 15 millilitres et ajoutez de l’eau à une concentration finale de deux milligrammes par millilitre.

Vortex pour obtenir une suspension uniforme. Aliquote 500 microgrammes dans des tubes microfuges. Séchez les aliquotes à l’aide d’une centrifugeuse sous vide à 30 degrés Celsius pendant la nuit.

Prétraiter l’AIR avec une aliquote pour un contrôle de l’AIR sans enzyme avec une molaire d’hydroxyde de sodium pendant une heure à température ambiante. Après une heure, ajoutez 200 microlitres d’eau et 20 microlitres d’acide chlorhydrique molaire dans chaque tube pour neutraliser l’hydroxyde de sodium. Vérifiez que le pH est d’environ six à sept en retirant un microlitre et en le repérant sur les bandes indicatrices de pH en papier.

Ajoutez 50 microlitres d’un tampon molaire d’acétate d’ammonium pH 6,0 et ajoutez de l’eau à un volume total de 500 microlitres dans chaque tube. Pour commencer cette procédure, ajoutez une quantité prédéterminée de mannanases aux aliquotes et au tampon AIR. Incluez des contrôles négatifs appropriés ainsi qu’un contrôle positif.

Vortex, puis tournez brièvement pour recueillir le mélange réactionnel au fond du tube. Incuber à 37 degrés Celsius avec une légère agitation pendant la nuit. Le lendemain, arrêtez la réaction en incubant à 95 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Centrifuger à vitesse maximale pendant 10 minutes. Conservez le surnageant et remettez en suspension chaque granulé dans 250 microlitres d’eau. Centrifugez à nouveau et conservez le surnageant.

Combinez les deux surnageants et séchez-les dans une centrifugeuse sous vide à 30 degrés Celsius pendant environ trois heures. Avant la procédure de dérivation, préparez les réactifs nécessaires comme décrit dans le protocole texte. Réchauffez la solution mère de 0,2 molaire d’ANTS à 60 degrés Celsius pour dissoudre complètement le solide.

À chaque échantillon, ajoutez cinq microlitres d’ANTS, cinq microlitres de bicoline-borane et 10 microlitres de tampon de dérivatisation. Tournez brièvement pour recueillir dans le fond du tube, tourbillonnez complètement, puis tournez à nouveau brièvement. Incuber les échantillons pendant la nuit à 37 degrés Celsius à l’abri de la lumière.

Le lendemain, faites sécher les échantillons dans une centrifugeuse sous vide à 30 degrés Celsius pendant environ deux heures. Remettre chaque échantillon en suspension dans un étalon d’oligosaccharide et 100 microlitres d’urée à trois molaires. Conserver à moins 20 degrés Celsius à l’abri de la lumière jusqu’à ce que vous en ayez besoin.

L’assemblage de l’équipement de coulée de gel dépendra de la marque. Pour l’équipement utilisé dans cette démonstration, un gel équivaut à 50 millilitres. Dans un tube à centrifuger de 50 millilitres, mélangez 20,2 millilitres d’eau, cinq millilitres de tampon 10x PACE, 24,6 millilitres d’acrylamide/bis-acrylamide à 40 %, 200 microlitres d’APS et 20 microlitres de TEMED.

Retournez doucement pour mélanger en faisant attention de ne pas introduire de bulles d’air. À l’aide d’une pipette sérologique ou d’une autre pipette de grand volume, versez le gel de résolution à environ quatre centimètres sous le haut des plaques de verre. Recouvrir soigneusement le gel d’alcool isopropylique.

Laissez le gel polymériser pendant 20 à 30 minutes. Videz la couche supérieure. Séchez tout excès de liquide à l’aide de papier buvard.

Ensuite, préparez le gel d’empilage. Dans un tube à centrifuger de 15 millilitres, mélangez 6,8 millilitres d’eau, un millilitre de tampon 10x PACE, 2,8 millilitres d’acrylamide/Bis-acrylamide, 80 microlitres d’APS et huit microlitres de TEMED. Retournez pour mélanger et superposez sur le gel de résolution polymérisé.

Insérez doucement le peigne en évitant de piéger des bulles d’air sous les dents du peigne. Une fois le gel polymérisé, enveloppez-le dans un tissu humide, puis dans une pellicule plastique, et conservez-le à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Pour aider à garder une trace de l’ordre de chargement et à identifier où se trouvent les puits une fois le peigne retiré, utilisez un marqueur permanent pour étiqueter les positions des puits sur le verre.

Retirez le peigne. Remplissez les puits avec un tampon One-X PACE. À l’aide d’une microseringue de 10 microlitres, chargez deux microlitres d’étalons et d’échantillons dans les puits.

Évitez d’utiliser les voies les plus à l’extérieur qui ont tendance à mal faire fonctionner les échantillons et laissez une voie vide entre les échantillons. Assemblez la chambre supérieure de l’appareil de fonctionnement du gel et placez le gel dans un réservoir de fonctionnement refroidi contenant un tampon PACE d’un X. Remplissez la chambre supérieure avec un tampon One-X PACE.

Allumez l’appareil et faites fonctionner le gel à 200 volts pendant 30 minutes. Après 30 minutes, augmentez la tension à 1 000 volts pendant une heure et 40 minutes. Protégez le gel de la lumière.

Commencez par essuyer le système d’imagerie sur gel avec un chiffon humide non pelucheux pour vous assurer qu’il est exempt de poussière. Retirez le gel du réservoir PACE et observez brièvement pendant que le gel est encore dans les plaques de verre pour déterminer si la face du colorant est toujours sur le gel. Utilisez un outil de coin pour ouvrir le gel et pendant que le gel est encore sur une plaque de verre, utilisez un coupe-pizza pour retirer à la fois le gel d’empilage et le bas du gel si la façade du colorant est toujours sur le gel.

Versez environ cinq millilitres d’eau sur la surface du transilluminateur, puis transférez le gel directement sur le transilluminateur. À l’aide du logiciel, réglez le filtre sur UV 605 et allumez le transilluminateur UV à ondes longues. Prenez plusieurs images à différents temps d’exposition, en veillant à éteindre la lumière UV entre les images pour éviter de dégrader la fluorescence.

Assurez-vous qu’au moins deux des images n’ont pas de bandes saturées. Enregistrez les fichiers sous forme d’images TIFF haute résolution. Un gel représentatif d’un test PACE standard de la teneur en mannane de la paroi cellulaire est présenté.

Les voies un, deux et trois montrent une échelle d’oligosaccharides achetés dans le commerce à cinq, 10 et 50 picomoles respectivement à une concentration de picomole. La quatrième voie montre une digestion à la mannanase du glucomannane de konjac qui sert de contrôle positif à la fois pour la digestion enzymatique et la réaction de dérivatisation en présence de l’enzyme et des sels tampons. Le couloir cinq montre l’empreinte PACE d’une tige d’Arabidopsis de type sauvage.

Le couloir six montre l’empreinte PACE de la tige d’une plante d’Arabidopsis dépourvue de la tige principale, la mannane synthase. Par rapport au type sauvage, seule une petite quantité de mannane est présente, comme en témoignent les intensités de bande réduites pour tous les oligosaccharides dérivés de la mannanase. Le couloir 10 montre l’empreinte PACE du bois de pin qui contient du galactoglucomannane et présente un motif d’oligosaccharides libérés nettement différent de celui d’Arabidopsis.

Les voies sept, huit, neuf et 11 sont des contrôles négatifs variés qui révèlent des bandes non spécifiques marquées d’astérisques qui devraient être exclues de l’analyse. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une très bonne compréhension de la façon d’analyser la structure du mannane à l’aide de PACE. Une fois maîtrisée, cette technique peut être appliquée à d’autres polysaccharides d’intérêt à l’aide de différentes hydrolases de glycosyle.

Nous avons réussi à appliquer cette technique à de nombreuses autres espèces végétales en plus d’Arabidopsis, ainsi qu’à d’autres espèces non végétales telles que la levure, le mannane.