Mesurer l’effet des produits chimiques sur la croissance et la Reproduction de Caenorhabditis elegans

L’objectif général de cette procédure est de mesurer l’effet de produits chimiques, tels que l’inhibiteur de la topoisomérase étoposide, sur la croissance et la reproduction de l’animal modèle Caenorhabditis elegans. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la toxicologie, telles que l’évaluation toxicologique pour le développement de médicaments et l’évaluation des risques liés aux substances toxiques pour l’environnement. Le principal avantage de cette technique est que la toxicité de divers produits chimiques peut être vérifiée dans des systèmes non mammifères, de sorte que cette technique est pratique et rentable.

La démonstration de la procédure sera faite par So Young Lee, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Pour commencer, préparez deux bouteilles en verre propres de 200 millilitres en ajoutant 0,6 gramme de chlorure de sodium, 0,5 gramme de peptone, 3,4 grammes d’agar, 195 millilitres d’eau distillée et un agitateur magnétique à une bouteille. Ajoutez ensuite un agitateur magnétique à l’autre bouteille vide.

Autoclavez les bouteilles pendant 15 minutes à 121 degrés Celsius, puis refroidissez les bouteilles au bain-marie pendant 30 minutes à 55 degrés Celsius. Ensuite, dans la bouteille remplie, ajoutez 0,2 millilitre d’une molaire de chlorure de calcium, 0,2 millilitre de cinq milligrammes de cholestérol, 0,2 millilitre d’une molaire de sulfate de magnésium et cinq millilitres d’une molaire de phosphate de potassium. Mélangez ensuite la solution en agitant magnétiquement sur une plaque chauffante à 55 degrés Celsius.

Versez la moitié du milieu NGM mélangé dans la bouteille vide de 200 millilitres. Ajoutez ensuite un millilitre de DMSO dans une bouteille et utilisez une agitation magnétique pour le mélanger à nouveau. Conservez l’autre bouteille dans un bain-marie à 55 degrés Celsius.

Ensuite, aliquote trois millilitres de boîtes de Pétri de taille moyenne à 35 x 10 millimètres contenant du DMSO. Retirez l’autre bouteille du bain-marie et utilisez une agitation magnétique pour la mélanger. Ajoutez ensuite un millilitre d’étoposide de 75 millimolaires.

Et après avoir mélangé à nouveau, répétez la procédure d’aliquotage. Refroidissez les plaques NGM contenant des produits chimiques en les laissant à température ambiante pendant environ trois heures et conservez-les à quatre degrés Celsius jusqu’à utilisation. Pour le test chimique, étalez 100 microlitres d’E.coli OP50 inactivé par la chaleur sur chaque plaque NGM.

Laissez les plaques sécher pendant la nuit dans un incubateur C.elegans à 20 degrés Celsius. Transférez les œufs de C. elegans synchronisés selon l’âge dans une plaque NGM complétée par 1 % de DMSO ou 750 micromolaires d’étoposide. Placez les C.elegans dans un incubateur à 20 degrés Celsius pendant quatre jours.

Observez et prenez des images microscopiques de C. elegans au stéréomicroscope tous les jours. Prenez également une image microscopique du micromètre de la platine du microscope pour l’étalonnage de la taille du ver. Pour mesurer la longueur du corps de C. elegans traités au DMSO ou à l’étoposide à chaque point temporel, dans ImageJ, ouvrez l’image micrométrique de la platine du microscope.

Ensuite, à l’aide de l’outil Ligne droite, faites glisser une ligne de 1 000 micromètres sur l’image. Cliquez sur Analyser, puis sur Définir l’échelle, puis saisissez 1 000 et micromètres dans les zones Distance connue et Unité de longueur, respectivement. Cochez ensuite la case Global et cliquez sur OK. Ouvrez les images du ver à l’aide de Fichier, puis Ouvrir.

Ensuite, à l’aide de l’outil Ligne à main levée, tracez une ligne le long de l’entité de chaque ver. Obtenez les données de longueur du corps en cliquant sur Analyser, puis sur Mesurer. Répétez ces étapes pour 50 vers.

Incuber les œufs synchronisés selon l’âge sur la plaque NGM contenant du DMSO ou de l’étoposide à 20 degrés Celsius pendant 64 heures jusqu’au stade de jeune adulte. Transférez cinq vers adultes dans de nouvelles plaques NGM sans produits chimiques ou de nouvelles plaques NGM contenant le même prétraitement chimique, et incubez-les pendant 24 heures. Transférez les adultes dans de nouvelles plaques NGM, comme nous venons de le démontrer, et comptez le nombre d’œufs chaque jour.

De plus, comptez les vers qui se sont échappés, sont morts ou ont éclos à l’intérieur. Effectuer des calculs selon le protocole texte. Comme le montre ici, le traitement par l’étoposide à 24 à 96 heures a considérablement retardé la croissance de C. elegans.

Après 96 heures d’incubation, les vers traités à l’étoposide ont atteint une longueur corporelle de 0,86 millimètre, tandis que les vers traités au véhicule ont atteint 1,04 millimètre. Un retard de croissance a également été observé au stéréomicroscope, comme on le voit sur ces images de vers traités à l’étoposide, par rapport aux vers traités par contrôle. Après 72 heures d’incubation, des œufs de vers traités par véhicule ont été observés.

En revanche, des œufs ont été observés après 96 heures de traitement à l’étoposide, ce qui soulève la possibilité que le traitement à l’étoposide ait retardé l’heure de la première naissance de C. Elegans. Comme le montrent ces graphiques, une diminution du nombre total d’œufs par traitement à l’étoposide a été observée lorsque les jeunes vers adultes ont été cultivés, en présence ou en l’absence d’un traitement continu à l’étoposide. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une semaine si elle est correctement exécutée.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer la toxicité chimique de C. elegans, un nématode modèle.