Multiplex Cytokine profilage des splénocytes de souris stimulés à l’aide d’une plateforme axée sur la cytométrie de flux perle Immunoassay

L’objectif global de ce protocole est de quantifier simultanément plusieurs cibles de cytokines dans des surnageants de culture tissulaire collectés à partir de splénocytes de souris stimulés à l’aide d’un immunodosage basé sur des billes multiplex et d’un cytomètre en flux. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie, telles que : quels sont les profils de cytokines uniques qui orchestrent la réponse immunitaire dans le contexte d’états pathologiques spécifiques ? Le principal avantage de cette technique est que la quantification simultanée de plusieurs annélides peut être effectuée en utilisant des volumes d’échantillons beaucoup moins importants que les formats ELISA traditionnels, tout en réduisant les liaisons non spécifiques.

Nicholas Johnsen, un associé de recherche de notre équipe de développement de produits, fera la démonstration de la procédure. Commencer cette procédure par la préparation de l’échantillon biologique comme décrit dans le protocole textuel. Pour préparer les billes prémélangées immobilisées par des anticorps, sonicez le flacon de billes prémélangées pendant une minute dans un bain sonicateur à température ambiante.

Puis agitez pendant 30 secondes avant de l’utiliser. S’il n’y a pas de bain sonicateur, augmentez le temps du vortex à une minute. Pour la préparation standard, ajoutez 250 microlitres de tampon de dosage pour reconstituer le cocktail lyophilisé Mouse Th Cytokine Standard.

Mélangez en remuant brièvement et laissez reposer le flacon à température ambiante pendant 10 minutes. Transférez le cocktail standard dans un tube de microcentrifugation en polypropylène étiqueté C7. Cela sera utilisé comme la norme supérieure. Étiquetez six tubes de microcentrifugation en polypropylène comme étant de C1 à C6. Ajoutez 75 microlitres de tampon de dosage dans chacun de ces tubes.

Ensuite, transférez 25 microlitres de la norme supérieure, C7, dans le tube C6, et mélangez bien par vortex. Il s’agira de la norme C6. Continuez à effectuer des dilutions en série d’une à quatre, en utilisant une nouvelle pointe de pipette pour chaque tube afin d’ajouter 25 microlitres de l’étalon précédent aux 75 microlitres de tampon de dosage dans le tube étalon le plus bas suivant.

Suivez chaque ajout par vortex. Utilisez le tampon de dosage comme étalon de zéro picogramme par millilitre. Pour effectuer le test, laissez tous les réactifs se réchauffer à température ambiante avant de les utiliser.

Des plaques filtrantes en polypropylène sont utilisées dans cette démonstration. Il est absolument essentiel que la plaque soit maintenue verticale pendant toute la procédure de dosage, y compris les étapes de lavage, pour éviter de perdre les billes. Pré-mouillez le papier filtre en ajoutant 100 microlitres de tampon de lavage 1X dans chaque puits et laissez reposer les plaques pendant une minute à température ambiante.

Retirez le volume de tampon à l’aide du collecteur à vide. Épongez l’excès de tampon de lavage du bas de l’assiette en appuyant l’assiette sur une pile d’essuie-tout propres. Ensuite, placez la plaque sur le couvercle de la plaque inversée.

Pour les échantillons de surnageant de culture cellulaire, ajoutez 25 microlitres de tampon de dosage dans tous les puits. Ajoutez 25 microlitres de chaque étalon dans les puits étalons. Enfin, ajoutez 25 microlitres de chaque échantillon dans les puits d’échantillon.

Agitez les billes mélangées pendant 30 secondes. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de billes mélangées dans chaque puits, en secouant la bouteille de perles par intermittence pour éviter que les billes ne se déposent. Scellez la plaque avec une scelleuse de plaques.

Une fois scellée, enveloppez toute la plaque, y compris le couvercle de la plaque inversée, avec du papier d’aluminium. Placez la plaque sur un agitateur à assiettes, fixez-la et secouez-la à environ 500 tr/min pendant deux heures à température ambiante. Sans renverser, placez la plaque sur le collecteur d’aspirateur et appliquez le vide comme précédemment.

Ensuite, ajoutez 200 microlitres de tampon de lavage 1X dans chaque puits. Retirez le contenu des puits de la plaque de dosage par filtration sous vide. Épongez l’excès de tampon de lavage du bas de l’assiette avec un tampon absorbant ou des serviettes en papier avant de répéter cette étape une fois de plus.

Ensuite, ajoutez 25 microlitres d’anticorps de détection dans chaque puits. Après avoir scellé la plaque avec une scelleuse de plaque neuve, enveloppez toute la plaque, y compris le couvercle de la plaque inversée, avec du papier d’aluminium. Placez la plaque sur un agitateur à assiette et secouez à environ 500 tr/min pendant une heure à température ambiante.

Sans aspirer, ajoutez 25 microlitres de réactif de phycoérythrine streptavidine directement dans chaque puits. Fermez et enveloppez l’assiette comme précédemment. Ensuite, placez la plaque sur un agitateur à assiette et secouez à environ 500 tr/min pendant 30 minutes à température ambiante.

Après avoir répété deux fois l’étape de filtration sous vide, ajoutez 200 microlitres de tampon de lavage 1X dans chaque puits. Suspendez à nouveau les perles sur un agitateur à assiette pendant une minute. À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez les échantillons de la plaque filtrante dans des tubes FACS afin de lire les échantillons sur un cytomètre en flux.

Démarrez le cytomètre en flux et le logiciel d’acquisition conformément aux instructions du fabricant fournies avec l’instrument. Créez un diagramme à points avec une dispersion vers l’avant sur l’axe X et une dispersion latérale pour l’axe Y. Réglez la diffusion vers l’avant et la diffusion latérale en mode linéaire.

Vortex la fiole de perles brutes incluse dans le kit pendant 30 secondes pour remettre les perles en suspension. Transférez 400 microlitres de billes brutes dans un nouveau tube FACS. Réglez le débit du cytomètre en flux sur faible.

Faites fonctionner les billes brutes en ajustant soigneusement le gain et la tension pour la diffusion vers l’avant et la diffusion latérale afin que les deux tailles de ces billes soient visiblement séparées et faciles à contrôler. Ajustez le seuil de diffusion vers l’avant pour exclure les événements indésirables. Dans le graphique de dispersion vers l’avant et vers le côté, dessinez une porte qui inclut toutes les populations de billes.

Affichez les populations de billes fermées à partir du nuage de points avant par rapport au nuage latéral sur le deuxième graphique à points avec PE sur l’axe X et APC pour l’axe Y. Ajustez la tension PMT pour le canal de fluorescence APC de sorte que le signal APC pour toutes les populations de billes ait une intensité de fluorescence médiane, ou MFI, comprise entre 10 et 5 000. Ensuite, faites tourbillonner le flacon de perles de configuration PE pendant 30 secondes pour remettre les billes en suspension.

Transférez 400 microlitres de billes de PE remises en suspension dans un nouveau tube FACS. Remplacez le tube à billes brutes dans le cytomètre en flux par le tube à billes PE. Ajustez la tension du tube photomultiplicateur pour le réglage du canal de fluorescence PE afin que la MFI des billes de PE se situe dans la plage spécifique au lot indiquée sur le flacon de billes de PE.

Pour effectuer l’acquisition de données, définissez le nombre d’événements de billes à acquérir à environ 300 par anolyte. Vortex chaque échantillon pendant cinq secondes avant l’analyse. Ensuite, lisez les échantillons.

Lors de la lecture des échantillons, réglez d’abord le cytomètre en flux en mode de configuration et attendez que la population de billes soit stabilisée avant de passer en mode d’acquisition. Exportez uniquement les événements contrôlés plutôt que le nombre total d’événements avant d’effectuer l’analyse des données comme décrit dans le protocole texte. Des courbes standard représentatives pour les anolytes cibles ont été générées à l’aide du panel de cytokines T auxiliaires de souris.

Des tests correctement exécutés montreront des courbes avec de larges plages dynamiques, comme illustré ici. Des courbes standard doivent être exécutées à chaque fois que le test est effectué. Des splénocytes de souris ont été cultivés dans diverses conditions pendant 48 heures.

Des surnageants de culture ont été collectés, puis les concentrations de 13 cibles ont été quantifiées à l’aide du panel de cytokines T auxiliaires de souris. Les profils différentiels d’expression des cytokines, en réponse aux conditions de stimulation, sont clairement visibles. Une fois maîtrisée, la paillasse de laboratoire de cette technique peut être réalisée en moins de cinq heures et demie si elle est effectuée correctement.

Les temps d’acquisition des données et d’analyse en aval varieront en fonction du nombre d’échantillons. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser ce protocole, quantifier les concentrations d’anolytes dans les échantillons biologiques à l’aide d’un immunodosage cytométrique basé sur des billes. Cela comprend la préparation du réactif, les étapes d’incubation et la configuration du cytomètre en flux pour l’acquisition des données.