Name: Multiplex Cytokine profilage des splénocytes de souris stimulés à l’aide d’une plateforme axée sur la cytométrie de flux perle Immunoassay (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Apprenez le profilage multiplex de cytokines dans les surnageants de splénocytes de souris stimulés par immunoessai sur billes et cytométrie de flux. Cette méthode permet une quantification simultanée avec des volumes d'échantillon réduits.

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Les auteurs tiennent à souligner les contributions des biomarqueurs et Immuno-essais équipe de développement de produits pour le développement du dosage. En outre, nous tenons à remercier Vigene Tech, Inc. pour leurs efforts de collaboration dans la conception de progiciels des analyse les données.

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</ol>

Les auteurs sont employés par BioLegend, qui fabrique les réactifs décrits dans ce manuscrit. Vigene Tech, Inc. a développé le logiciel d’analyse de données LEGENDplex qui est utilisé pour analyser les données générées par le test décrit dans ce manuscrit.

Le format d’essai décrit dans le présent protocole peut fournir robuste quantification des profils de médiateur soluble dans des échantillons biologiques fournis l’expérimentateur a bon laboratoire technique et adhère au protocole recommandé.
Il y a plusieurs étapes clés qui doivent être suivies pour garantir des résultats fiables. Tout d’abord, les normes recombinants doivent pouvoir reconstituer dans du tampon le recommandé à plein temps et après seulement dilué dans des tubes en polypropylène. Tubes polystyrène peuvent favoriser l’adhérence des protéines de la paroi des tubes, qui peuvent conduire à des signaux faibles lors de la génération de la courbe d’étalonnage. Deuxièmement, secouer pendant les étapes d’incubation adéquate est essentielle. Sans agitation appropriée, les caractéristiques de liaison, des perles d’essai peuvent être gravement entravées. En outre, lavage correcte entre les étapes d’incubation est également requis. L’expérimentateur doit s’assurer que les excès réactifs soient écartés les puits avant de commencer l’étape suivante dans le protocole. Paramètres d’instruments pour le cytomètre en flux utilisés pour interroger les perles de dosage doivent être optimisés aussi bien. En particulier, les paramètres de PMT doivent être réglées de manière séparation appropriée de perle et des plages dynamiques larges pour les courbes standards. Enfin, juste avant d’être analysés sur le cytomètre, les billes doivent être mixés pour assurer une suspension adéquate et d’éviter la formation d’agrégats qui peuvent fausser les résultats.
Ce protocole peut être potentiellement modifié pour analyser des homogénats de tissus ainsi que les types d’échantillons examinés dans ce manuscrit, pourvu que le chercheur est prêt à optimiser leur protocole de lyse avant d’effectuer des essais de plaque grand, plein. La technique réelle dépendra bien sûr de type tissulaire ; Cependant, en général le protocole doit utiliser un tampon de pH neutre contenant des concentrations physiologiques des sels ioniques, sans dénaturation des produits chimiques et préférence pas de détergent. Si un détergent doit être utilisé, les concentrations de détergent non ionique doivent être maintenues au minimum (par exemple pas plus de 1 %). La mémoire tampon doit également contenir des antiprotéases suffisante pour empêcher la dégradation protéolytique de protéines cibles. Quel que soit le protocole de lyse utilisé, les derniers préparatifs doivent être centrifugés pour enlever les particules avant l’analyse.
Au sujet des limites de dosage, les concentrations d’analytes cibles dans types d’échantillons biologiques peuvent varier grandement. Afin de correctement quantifier les concentrations de la substance à analyser, ils doivent être comprise entre les valeurs inférieure et supérieure pour la courbe d’étalonnage. Extrapolation des valeurs de la courbe n’est pas nécessairement fiable et n’est pas recommandé. Les enquêteurs doivent donc optimiser dilutions de leurs échantillons particuliers dans des expériences pilotes avant d’exécuter une analyse complète-plaque. En outre, la préparation minutieuse des échantillons biologiques à doser est primordiale pour le succès de ce format de test. Échantillons lipémiques, hémolysés, ou contenant des débris de la protéine seront affectent les interactions anticorps antigène qui définissent le principe essentiel de ce test immunologique et restituer des résultats ininterprétables.
Ce test est significatif en ce qui concerne les méthodes de quantification existantes pour plusieurs raisons. Lorsque exécuté correctement, le format du test peut doser jusqu'à 13 analytes auprès d’un échantillon en utilisant des volumes beaucoup plus faible qu’il faudrait analyser l’échantillon à l’aide des tests ELISA traditionnelles. Ce format d’essai ne nécessite pas instrumentation dédiée afin d’être exécutée. Il s’agit d’un avantage par rapport aux autres immunologiques perle disponibles dans le commerce comme le dosage peut être exécuté à l’aide de n’importe quel nombre de cytomètres couramment utilisés.
Une enquête scientifique sur le rôle joué par les cytokines et facteurs sécrétés réseaux en santé et la maladie se développe. Le format de test décrit dans ce manuscrit peut être un outil précieux pour les chercheurs qui cherchent à comprendre ces phénomènes complexes et multiformes. Programmes de recherche biomédicale active commencent à explorer le rôle des réseaux de cytokines de l’inflammation tels que généralisés des zones non seulement6, mais aussi en contexte des États de maladie spécifiques telles que l’athérosclérose, le cancer et neuro-inflammation 15,16,17. Sans aucun doute, enquête va continuer à croître dans ces domaines comme la recherche de nouvelles thérapies traiter ces affections chroniques se développe. La nécessité d’une quantification précise et fiable des médiateurs solubles associés à ces maladies demeurera une priorité de recherche critique.

En tant que molécules de signalisation solubles, cytokines médier les processus hautement coordonnées et multifactorielles qui régissent les réactions immunologiques de l’hôte. Ils sont exprimés durant toutes les étapes du processus inflammatoire, de l’initiation à la résolution et régulent un réseau d’interactions complexes qui comporte leur propre synthèse et celle de leurs récepteurs cellulaires1. Ce réseau de communication est posé avec une complexité qui dépasse les relations synergiques ou antagonistes qui peuvent exister entre les différents composants. En effet, nombreuses cytokines sont connus pour partager les fonctions redondantes ou au moins partiellement superposés2,3.
Approches de la biologie des systèmes intégrés qui quantifient simultanément plusieurs analytes de cytokine fournissent actuellement une compréhension plus complète de le cytokinomes unique qui orchestrent les réponses immunitaires sous-jacente aux maladies multiples dispose de4,5. Ces États de maladie s’étendent d’une inflammation généralisée au cancer, neuro-dégénératives et les maladies cardiovasculaires6,7,8,9.
Ces réseaux de cytokines peut être interrogées efficacement à l’aide de LEGENDplex perle immunologiques. Ces tests sont basés sur le même principe que le sandwich enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) et utilisent des microsphères de fluorescence encodé avec des anticorps de capture de façon covalente à leur surface. Ces anticorps sont immobilisées sur des surfaces beaucoup plus petites que celles requises par les formats traditionnels de ELISA. Cela permet à ces tests d’être interprétée avec beaucoup moins volume de l’échantillon, alors qu’en même temps réduisant non-spécifiques contraignant et fournissant multiplexés analyse plusieurs analytes.
Le test décrit dans ce protocole utilise cette technologie pour doser jusqu'à 13 cibles simultanément. Données de cet essai peuvent être obtenues en utilisant une grande variété de cytomètres couramment disponibles et contrairement à d’autres tests disponibles ne nécessitent pas l’utilisation de l’instrumentation de test spécifique dédiée. Avec un catalogue en pleine expansion des panneaux de l’analyte validés, ces tests ont été utilisés dans plusieurs travaux de recherche biomédicale projets10,11,12,13.
Pour démontrer la facilité et l’utilité du format dosage, dans cette expérience que nous permet de quantifier un panel de cytokine souris T helper 13 distincts des concentrations de cytokine de surnageants de culture de tissus obtenus à partir des splénocytes de souris cultivées sous multiple conditions de stimulation. Outre les surnageants de culture de tissus, ce test peut également être effectué en utilisant des échantillons de sérum ou de plasma.

<table><tbody><tr><td>Centrifugeuse Allegra 6R avec adaptateur de support MICROPLUS</td><td>Beckman Coulter</td><td>366816</td><td>Pour les dosages LEGENDplex est exécuté dans des microtubes, une plaque à 96 puits à fond en V ou en U (en option)</td></tr><tr><td>LEGENDplex Mouse T Helper Cytokine Panel</td><td>BioLegend</td><td>740005</td><td>Multiplex Immunoassay (13-plex)</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD3&epsilon de souris</td><td>BioLegend</td><td>100314</td><td>Clone 145-2C11, à faible teneur en endotoxines, format sans azoture</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD28</td><td>de souris BioLegend</td><td>102112</td><td>Clone 37.51, faible teneur en endotoxines, format sans azoture</td></tr><tr><td>Pompe à vide</td><td>EMD Millipore</td><td>WP6111560</td><td>Pour les dosages LEGENDplex à l’aide de plaques filtrantes (recommandé)</td></tr><tr><td>Collecteur à vide</td><td>EMD Millipore</td><td>MSVMHTS00</td><td>Pour les dosages LEGENDplex à l’aide de plaques filtrantes (recommandé)</td></tr><tr><td>Réservoirs de réactifs stériles jetables</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-130</td><td>Ou équivalent</td></tr><tr><td>Tubes MicroFACS en polypropylène</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-842-90</td><td>Pour LEGENDplex, les tests sont effectués dans des microtubes, une plaque à 96 puits à fond en V ou en U (en option)</td></tr><tr><td>Kit de pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-388-100</td><td>Quatre tailles de pipettes (0,2-2 et micro ; L, 2-20&micro ; L, 20-200&micro ; L, 100-1000 et micro ; L)</td></tr><tr><td>Pipette multicanaux</td><td>Fisher Scientific</td><td>FA10011G</td><td>capable de distribuer 5 &mu ; L à 200 &mu ; L</td></tr><tr><td>Agitateur de microplaques</td><td>Fisher Scientific</td><td>88880023</td><td>Ou équivalent</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>Fisher Scientific</td><td>75002410</td><td>Ou tubes</td></tr><tr><td>FACS équivalents</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9885747</td><td>12 x 75 mm à fond rond</td></tr><tr><td>PMA (Phorbol 12-myristate 13-acétate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide (LPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-8274</td><td>Escherichia coli O26 :B6</td></tr><tr><td>Ionomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Branson B200 Nettoyeur à ultrasons</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z305359</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Tubes à microcentrifuger</td> Tubes <td>en polypropylène</td><td>Sigma-Aldrich</td> Z666505 <td>1,5 mL</td></tr><tr><td>Cytomètre en flux</td><td>Divers</td><td>Divers</td><td>Cytomètre équipé d’un seul laser (488 nm bleu) ou de deux lasers (488 nm bleu ou 532 nm vert + 633 nm rouge) capables de lire les longueurs d’onde d’émission à 575 nm et 660 nm</td></tr><tr><td>Plaque de polypropylène à 96 puits</td><td>VWR</td><td>82050-662</td><td>Pour les tests LEGENDplex est effectué dans des microtubes, une plaque à 96 puits à fond en V ou en U (en option)</td></tr></tbody></table>

multiplex cytokine profilage des splénocytes de souris stimulés à l’aide d’une plateforme axée sur la cytométrie de flux perle immunoassay

Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform

Perle immunologiques utilisent le même principe de base que les immuno-essais "sandwich". Capture de billes, qui peuvent être différenciés par la taille et l’intensité de fluorescence allophycocyanin interne (APC), sont conjugués d’anticorps spécifiques d’un analyte spécifique. Ensuite, un groupe sélectionné de capture définies perle ensembles est incubé avec un échantillon biologique contenant des analytes cibles spécifiques à l’anticorps de capture. Un anticorps de détection biotinylé cocktail est ajouté, ce qui conduit à la formation des sandwichs de perle-analyte-détection anticorps de capture.
Enfin, streptavidine-phycoérythrine (SA-PE) est ajoutée, qui se lie à l’anticorps de détection biotinylés, fournissant les intensités du signal fluorescent proportionnellement à la quantité d’analyte lié. Le PE fluorescent signal des régions de l’analyte spécifique perles quantifiée à l’aide de cytométrie en flux et les concentrations d’analytes particulière sont déterminées à l’aide du logiciel d’analyse de données et la courbe d’étalonnage générée lors de l’essai.
Dans cette expérience, nous utilisons un panneau de cytokines de souris T helper pour quantifier simultanément la concentration de 13 cibles de cytokines distinctes dans les surnageants de culture de tissus prélevés de splénocytes de souris cultivées dans différentes conditions de stimulation.

Ce protocole montre comment une plateforme de test immunologique axée sur la perle peut être utilisée pour quantifier la cytokine profils provenant d’échantillons biologiques à l’aide d’un cytomètre en flux simultanément. Les échantillons biologiques utilisés dans cet exemple sont les surnageants de culture de cellules de splénocytes de souris qui avaient été préalablement incubées dans diverses conditions d’activation, bien que le format d’essai a également été validé pour utilisation avec des échantillons de sérum ou de plasma.
Les données générées par le test sont utilisées pour construire les courbes d’étalonnage pour tous les analytes dans le panneau multiplex. Le logiciel d’analyse de données classifie chaque analyte particulier basé sur une taille de perle unique et l’intensité de l’APC et quantifie les à l’aide d’un journaliste de PE. Les plages dynamiques, ainsi que la sensibilité de l’essai est démontrés lorsque tracées sur une échelle logarithmique en Figure 2 a. Le logiciel utilise les données de test et un algorithme d’ajustement de courbe de 5 paramètres pour calculer avec précision non seulement les concentrations d’analytes dans utilisateur fourni des échantillons biologiques, mais aussi les limites de détection sur deux extrémités haute et basse de toutes les courbes d’étalonnage (tableau 1 ). Le format décrit dans le présent protocole prévoit également la précision de dosage très robuste. Dans la Figure 2 b et 2C données sont présentées illustrant la variabilité intra-essai de chaque analyte. Deux concentrations distinctes de protéines standard (haute et basse) ont été analysées lors d’un essai avec 16 répétitions pour chaque échantillon. Figure 2 et 2D représentent la variabilité inter-essai des analytes cibles de trois tests indépendants. Comme avec les expériences de précision intra-essai, hautes et basses concentrations standards ont été analysées avec 3 réplique dans chacune des expériences indépendantes. Variabilité minime dans la concentration calculée de protéines cibles est clairement visible.
Afin de démontrer l’utilité des tests de cytométrie de flux axées sur le talon en interrogeant les profils d’expression des cytokines, des splénocytes de souris ont été incubées dans diverses conditions d’activation. Outre un contrôle non stimulée, les cellules ont été incubées également avec les vinyles, les anticorps anti-CD3/anti-CD28, ou phorbol 12-myristate 13-acétate et ionomycine. Les surnageants de culture de cellules ont été récoltées 48 h plus tard et analysée à l’aide du panneau de cytokine souris T helper. Les résultats de la quantification de cette expérience sont représentées dans la Figure 3 et l’effet des conditions de stimulation sur les concentrations de cytokines est clairement délimitée.
Les résultats décrits ci-dessus sont typiques, aussi longtemps que l’expérimentateur a bon laboratoire technique et suit le protocole d’essai prévu. Sources d’erreur dans ce format d’essai peuvent survenir de déviations dans les temps d’incubation, les volumes de réactifs, de lavage, ou de certains paramètres de PMT sur le cytomètre en flux utilisé pour analyser les échantillons. Dans la Figure 4 a un scatter plot d’un essai réussi montre 2 populations distinctes de perle qui sont clairement définies. Cela peut être comparée à la Figure 4 b, où adhérence médiocre de lavage et de protocole ont conduit à des agrégats de perle qui brouillent les deux populations. En outre, comme en témoignent les débris dans le quadrant inférieur gauche, cytomètre total événements ont été exportées pour analyse, et non le format préféré des événements dépendants uniquement. Cytomètre adéquat mis en place est essentiel pour produire des données fiables dans ce test. Dans PMT bonne Figure 4 paramètres permettent la résolution de chacun des 6 analytes dans le chenal de classification d’APC. Certains paramètres de PMT seront traduira par des données semblable à celle présentée dans la Figure 4 où le canal de l’APC a des populations de perle avec des intensités de classification qui se chevauchent. Cela annulerait le test puisqu’il sera impossible de calculer les concentrations d’analyte sans les populations de perles de dosage clairement déterminées.
<img alt="Linéarité et variabilité de la quantification des cytokines ; Graphiques; Analyse de la variabilité intra/inter-essais." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2 : gammes courbe Standard et précision essai. (A) une standard courbe générée à l’aide du panneau de cytokine souris T helper. Une courbe d’étalonnage doit être exécutée avec chaque test. (B-C) Précision intra-essai. Deux échantillons avec des concentrations différentes de protéines cibles (haute et basse) ont été analysées lors d’un essai avec 16 répétitions pour chaque échantillon. Données sont représentées sous la moyenne + l’écart-type. (D-E) Précision inter-essai. Deux échantillons avec des concentrations différentes de protéines cibles (haute et basse) ont été analysés dans les trois essais indépendants avec 3 répétitions pour chaque échantillon. Données sont représentées sous la moyenne + l’écart-type. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Diagramme à barres des taux de cytokines (pg/mL) dans les tests d’immunostimulation : CD3/CD28, LPS, PMA+Iono." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3 : Quantification de résultats représentant. Splénocytes de souris (1 x 106 cellules) sont cultivées à 37 ° C + 5 % de CO2 dans diverses conditions : non stimulés, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 µg/mL de plaque-enduit) + αCD28 (1 µg/mL soluble), PMA (20 ng/mL) + ionomycine (500 ng/mL). Les surnageants de culture ont été prélevés après 48 h puis quantifiée à l’aide du panneau de cytokine souris T helper. Profils d’expression des cytokines différentielle en réponse aux conditions de stimulation sont clairement visibles. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Graphiques de cytométrie en flux montrant SSC par rapport à FSC et APC par rapport à PE, illustrant l’analyse de la population cellulaire." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 
Figure 4 : résulte de succès contre les essais infructueux. (A) des essais réussis auront des populations distinctes de perle pour les populations de microsphères. (B) les essais infructueux aura séparation des populations pauvres, les agrégats de perle et trop d’événements collectés. (C) les essais réussis ont clairement défini intensités dans le canal de fluorescence de classification qui sont faciles à la porte et à quantifier. (D) les essais infructueux seront ont mal séparé et classification des intensités qui se chevauchent plusieurs populations de perle, ce qui rend difficile le dosage. Bon nombre de ces erreurs peuvent être évitées en respectant soigneusement le protocole d’essai. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">Courbe d’étalonnage</td>
			<td colspan="2">Sensibilité (pg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyte</td>
			<td>Formule forme</td>
			<td>CV</td>
			<td>R2</td>
			<td>Min.</td>
			<td>Max.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-Γ</td>
			<td>5-P.log(4.43, 14.40, 0.54, 9.11, 0.01)</td>
			<td>1,77 %</td>
			<td>0.99</td>
			<td>2.1</td>
			<td>18105.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-5</td>
			<td>5-P.log(4.36, 12.68, 0.64, 5.73, 0.36)</td>
			<td>1,32 %</td>
			<td>1</td>
			<td>1,9</td>
			<td>14514.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-Α</td>
			<td>5-P.log(4.36, 11.63, 0.79, 5.45, 0.37)</td>
			<td>1.48 %</td>
			<td>0.99</td>
			<td>1,9</td>
			<td>20109.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>5-P.log(4.46, 12.62, 0.78, 5.07, 0.34)</td>
			<td>1,34 %</td>
			<td>1</td>
			<td>1,9</td>
			<td>25109.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6</td>
			<td>5-P.log(4.58, 11.66, 0.64, 5.77, 0.37)</td>
			</tr></tbody></table>TD&gt;1.70%
			<td>0.99</td>
			<td>2.0</td>
			<td>7022.0</td>
		
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>5-P.log(4.27, 12.23, 0.62, 5.72, 0.36)</td>
			<td>1,36 %</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>13273.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-10</td>
			<td>5-P.log(4.67, 11.65, 1.20, 6.28, 0.61)</td>
			<td>1,81 %</td>
			<td>0.99</td>
			<td>2.2</td>
			<td>5190.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-9</td>
			<td>5-P.log(4.32, 13.86, 0.86, 5.90, 0.45)</td>
			<td>1,82 %</td>
			<td>1</td>
			<td>1,9</td>
			<td>12602.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-17 A</td>
			<td>5-P.log(4.06, 14.03, 0.47, 6.52, 0.32)</td>
			<td>0,99 %</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>12285.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-17F</td>
			<td>5-P.log(4.52, 12.15, 0.61, 5.52, 0.34)</td>
			<td>0,92 %</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>14841.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-21</td>
			<td>5-P.log(4.90, 8.03, 1.77, 4.74, 1.11)</td>
			<td>0,79 %</td>
			<td>1</td>
			<td>9.0</td>
			<td>12943.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-22</td>
			<td>5-P.log(4.57, 12.56, 0.63, 6.06, 0.39)</td>
			<td>1,16 %</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>6408.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-13</td>
			<td>5-P.log(4.40, 11.44, 0.22, 3.19, 1.45)</td>
			<td>1,11 %</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1</td>
			<td>16728.0</td>
		</tr>
	

Tableau 1 : ajustement de la courbe d’étalonnage et de sensibilité. Le logiciel d’analyse de données a été utilisé pour générer des courbes standard pour tous les analytes contenus dans l’essai multiplex. Cette analyse entièrement automatique s’applique à une courbe de 5 paramètres robuste montage algorithme selon les normes de série de dilution de l’essai et a également été utilisée pour définir la sensibilité en utilisant les limites théoriques de détection.

Ce protocole décrit la quantification des cibles multiples de cytokines simultanément dans les surnageants de culture de tissus prélevés de splénocytes de souris stimulés à l’aide de perle multiplex immunodosage base plate-forme et un cytomètre en flux.

Multiplex Cytokine profilage des splénocytes de souris stimulés à l’aide d’une plateforme axée sur la cytométrie de flux perle Immunoassay

Bead-based immunoassays employ the same basic principle as sandwich immunoassays. Capture beads, which can be differentiated by size and internal ...

L’objectif global de ce protocole est de quantifier simultanément plusieurs cibles de cytokines dans des surnageants de culture tissulaire collectés à partir de splénocytes de souris stimulés à l’aide d’un immunodosage basé sur des billes multiplex et d’un cytomètre en flux. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie, telles que : quels sont les profils de cytokines uniques qui orchestrent la réponse immunitaire dans le contexte d’états pathologiques spécifiques ? Le principal avantage de cette technique est que la quantification simultanée de plusieurs annélides peut être effectuée en utilisant des volumes d’échantillons beaucoup moins importants que les formats ELISA traditionnels, tout en réduisant les liaisons non spécifiques.Nicholas Johnsen, un associé de recherche de notre équipe de développement de produits, fera la démonstration de la procédure. Commencer cette procédure par la préparation de l’échantillon biologique comme décrit dans le protocole textuel. Pour préparer les billes prémélangées immobilisées par des anticorps, sonicez le flacon de billes prémélangées pendant une minute dans un bain sonicateur à température ambiante.Puis agitez pendant 30 secondes avant de l’utiliser. S’il n’y a pas de bain sonicateur, augmentez le temps du vortex à une minute. Pour la préparation standard, ajoutez 250 microlitres de tampon de dosage pour reconstituer le cocktail lyophilisé Mouse Th Cytokine Standard.Mélangez en remuant brièvement et laissez reposer le flacon à température ambiante pendant 10 minutes. Transférez le cocktail standard dans un tube de microcentrifugation en polypropylène étiqueté C7. Cela sera utilisé comme la norme supérieure. Étiquetez six tubes de microcentrifugation en polypropylène comme étant de C1 à C6. Ajoutez 75 microlitres de tampon de dosage dans chacun de ces tubes.Ensuite, transférez 25 microlitres de la norme supérieure, C7, dans le tube C6, et mélangez bien par vortex. Il s’agira de la norme C6. Continuez à effectuer des dilutions en série d’une à quatre, en utilisant une nouvelle pointe de pipette pour chaque tube afin d’ajouter 25 microlitres de l’étalon précédent aux 75 microlitres de tampon de dosage dans le tube étalon le plus bas suivant.Suivez chaque ajout par vortex. Utilisez le tampon de dosage comme étalon de zéro picogramme par millilitre. Pour effectuer le test, laissez tous les réactifs se réchauffer à température ambiante avant de les utiliser.Des plaques filtrantes en polypropylène sont utilisées dans cette démonstration. Il est absolument essentiel que la plaque soit maintenue verticale pendant toute la procédure de dosage, y compris les étapes de lavage, pour éviter de perdre les billes. Pré-mouillez le papier filtre en ajoutant 100 microlitres de tampon de lavage 1X dans chaque puits et laissez reposer les plaques pendant une minute à température ambiante.Retirez le volume de tampon à l’aide du collecteur à vide. Épongez l’excès de tampon de lavage du bas de l’assiette en appuyant l’assiette sur une pile d’essuie-tout propres. Ensuite, placez la plaque sur le couvercle de la plaque inversée.Pour les échantillons de surnageant de culture cellulaire, ajoutez 25 microlitres de tampon de dosage dans tous les puits. Ajoutez 25 microlitres de chaque étalon dans les puits étalons. Enfin, ajoutez 25 microlitres de chaque échantillon dans les puits d’échantillon.Agitez les billes mélangées pendant 30 secondes. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de billes mélangées dans chaque puits, en secouant la bouteille de perles par intermittence pour éviter que les billes ne se déposent. Scellez la plaque avec une scelleuse de plaques.Une fois scellée, enveloppez toute la plaque, y compris le couvercle de la plaque inversée, avec du papier d’aluminium. Placez la plaque sur un agitateur à assiettes, fixez-la et secouez-la à environ 500 tr/min pendant deux heures à température ambiante. Sans renverser, placez la plaque sur le collecteur d’aspirateur et appliquez le vide comme précédemment.Ensuite, ajoutez 200 microlitres de tampon de lavage 1X dans chaque puits. Retirez le contenu des puits de la plaque de dosage par filtration sous vide. Épongez l’excès de tampon de lavage du bas de l’assiette avec un tampon absorbant ou des serviettes en papier avant de répéter cette étape une fois de plus.Ensuite, ajoutez 25 microlitres d’anticorps de détection dans chaque puits. Après avoir scellé la plaque avec une scelleuse de plaque neuve, enveloppez toute la plaque, y compris le couvercle de la plaque inversée, avec du papier d’aluminium. Placez la plaque sur un agitateur à assiette et secouez à environ 500 tr/min pendant une heure à température ambiante.Sans aspirer, ajoutez 25 microlitres de réactif de phycoérythrine streptavidine directement dans chaque puits. Fermez et enveloppez l’assiette comme précédemment. Ensuite, placez la plaque sur un agitateur à assiette et secouez à environ 500 tr/min pendant 30 minutes à température ambiante.Après avoir répété deux fois l’étape de filtration sous vide, ajoutez 200 microlitres de tampon de lavage 1X dans chaque puits. Suspendez à nouveau les perles sur un agitateur à assiette pendant une minute. À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez les échantillons de la plaque filtrante dans des tubes FACS afin de lire les échantillons sur un cytomètre en flux.Démarrez le cytomètre en flux et le logiciel d’acquisition conformément aux instructions du fabricant fournies avec l’instrument. Créez un diagramme à points avec une dispersion vers l’avant sur l’axe X et une dispersion latérale pour l’axe Y. Réglez la diffusion vers l’avant et la diffusion latérale en mode linéaire.Vortex la fiole de perles brutes incluse dans le kit pendant 30 secondes pour remettre les perles en suspension. Transférez 400 microlitres de billes brutes dans un nouveau tube FACS. Réglez le débit du cytomètre en flux sur faible.Faites fonctionner les billes brutes en ajustant soigneusement le gain et la tension pour la diffusion vers l’avant et la diffusion latérale afin que les deux tailles de ces billes soient visiblement séparées et faciles à contrôler. Ajustez le seuil de diffusion vers l’avant pour exclure les événements indésirables. Dans le graphique de dispersion vers l’avant et vers le côté, dessinez une porte qui inclut toutes les populations de billes.Affichez les populations de billes fermées à partir du nuage de points avant par rapport au nuage latéral sur le deuxième graphique à points avec PE sur l’axe X et APC pour l’axe Y. Ajustez la tension PMT pour le canal de fluorescence APC de sorte que le signal APC pour toutes les populations de billes ait une intensité de fluorescence médiane, ou MFI, comprise entre 10 et 5 000. Ensuite, faites tourbillonner le flacon de perles de configuration PE pendant 30 secondes pour remettre les billes en suspension.Transférez 400 microlitres de billes de PE remises en suspension dans un nouveau tube FACS. Remplacez le tube à billes brutes dans le cytomètre en flux par le tube à billes PE. Ajustez la tension du tube photomultiplicateur pour le réglage du canal de fluorescence PE afin que la MFI des billes de PE se situe dans la plage spécifique au lot indiquée sur le flacon de billes de PE.Pour effectuer l’acquisition de données, définissez le nombre d’événements de billes à acquérir à environ 300 par anolyte. Vortex chaque échantillon pendant cinq secondes avant l’analyse. Ensuite, lisez les échantillons.Lors de la lecture des échantillons, réglez d’abord le cytomètre en flux en mode de configuration et attendez que la population de billes soit stabilisée avant de passer en mode d’acquisition. Exportez uniquement les événements contrôlés plutôt que le nombre total d’événements avant d’effectuer l’analyse des données comme décrit dans le protocole texte. Des courbes standard représentatives pour les anolytes cibles ont été générées à l’aide du panel de cytokines T auxiliaires de souris.Des tests correctement exécutés montreront des courbes avec de larges plages dynamiques, comme illustré ici. Des courbes standard doivent être exécutées à chaque fois que le test est effectué. Des splénocytes de souris ont été cultivés dans diverses conditions pendant 48 heures.Des surnageants de culture ont été collectés, puis les concentrations de 13 cibles ont été quantifiées à l’aide du panel de cytokines T auxiliaires de souris. Les profils différentiels d’expression des cytokines, en réponse aux conditions de stimulation, sont clairement visibles. Une fois maîtrisée, la paillasse de laboratoire de cette technique peut être réalisée en moins de cinq heures et demie si elle est effectuée correctement.Les temps d’acquisition des données et d’analyse en aval varieront en fonction du nombre d’échantillons. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser ce protocole, quantifier les concentrations d’anolytes dans les échantillons biologiques à l’aide d’un immunodosage cytométrique basé sur des billes. Cela comprend la préparation du réactif, les étapes d’incubation et la configuration du cytomètre en flux pour l’acquisition des données.

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Un immunodosage multiplex basé sur des billes pour quantifier plusieurs cibles de cytokines

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Multiplex Cytokine profilage des splénocytes de souris stimulés à l’aide d’une plateforme axée sur la cytométrie de flux perle Immunoassay (Vidéo) | JoVE Journal

Multiplex Cytokine profilage des splénocytes de souris stimulés à l’aide d’une plateforme axée sur la cytométrie de flux perle Immunoassay

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