Name: Entier-Montez de compensation et la coloration des Siliques et organes fleur Arabidopsis (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Apprenez la dissection et le montage entier des fleurs et siliques d'Arabidopsis pour l'étude du développement floral. Cette méthode permet un criblage rapide des stades de développement reproducteur.

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Ce travail a été soutenu par l’Université de Zurich, l’IEF Marie Curie Grant (subvention no. TransEpigen-254797 à A.H.), un Advanced Grant de l’European Research Council (subvention no. MEDEA-250358 à UG) et un projet de recherche et développement technologique (subvention MecanX à U.G.) de SystemsX.ch, l’Initiative de la Suisse en biologie des systèmes.

1. fleur et la Fixation de la Silique
<ol><li>Récolte de fleurs et siliques de plantes synchronisés lors de l’ouverture de la première fleur. Remarque : Dans les conditions expérimentales utilisées ici, les plantes commencent à fleurir environ 21 jours après la transplantation de Murashige et Skoog (MS) des dalles au sol. Graines sont stratifiées pour 3 à 4 jours à 4 ° C et germent/cultivés sur MS plaques à 22 ° C/16 h de lumière et 18 ° C/8 h sombre pendant 8 à 10 jours, avant de transplanter les plants sur un sol riche en éléments nutritifs dans des pots maintenus dans les mêmes conditions (Figure 1). Le nombre de répétitions dépend de l’objectif spécifique de recherche, mais un minimum de 5 inflorescences (à partir de 5 plantes individuelles) pour chaque traitement est recommandé. Si les fleurs sont l’unité expérimentale, un minimum de 10 fleurs par réplicat est recommandé.</li>
	<li>Couper les inflorescences ou fleurs (Figure 1E-H) à l’aide de petits ciseaux (p. ex., ciseaux à ongles) et les placer immédiatement dans un tube de microcentrifuge (pour la fixation de l’inflorescence/fleur simple) ou un tube conique (pour fixations collectives) fraîchement faite de Carnoy, méthanol/acétique ou FPA50 fixateurs (selon l’application, voir ci-dessous) sur la glace. NOTE : Les échantillons devraient être totalement immergés dans le fixateur.</li>
	<li>Laisser le tissu dans le fixateur pendant 4 h passer la nuit à 4 ° C. Remarque : L’infiltration sous vide peut être utilisée pour accélérer la pénétration du fixateur dans le tissu, mais cela risque de nuire à la préservation de la structure du tissu. Les auteurs n’implémentent pas d’infiltration sous vide.</li>
	<li>Retirer le fixateur, ajouter assez d’éthanol 70 % pour couvrir les échantillons et renvoyez-les à 4 ° C pendant au moins 24 h. les échantillons peuvent rester indéfiniment dans cette solution. Après avoir retiré l’éthanol, procéder immédiatement à l’étape suivante ; dissection ou compensation de SDS.</li>
</ol>2. dissection sous le stéréomicroscope
<ol><li>Mettez fraîchement 70 % éthanol en verre d’un horloger placé sur une petite boîte de Pétri pour soutien.</li>
	<li>
Lieu l’inflorescence/fleur/silique là-dessus a fraîchement fait fixateur et disséquer sous le stéréomicroscope à l’aide de forceps et une seringue avec une aiguille.
	<ol>
<li>Utiliser d’un horloger verre ou un appareil similaire qui permet aux échantillons d’être totalement couverte avec de l’éthanol (recommandé) pour la dissection des inflorescences et déchirer les organes floraux, des fleurs matures (sépales, pétales et étamines peuvent être disséqués à ce stade ) pour éviter le risque de dessèchement des échantillons.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Disséquer les siliques et petits boutons de fleurs sur une lame comme indiqué ci-dessous.
	<ol>
<li>Mettre de côté en verre de l’horloger avec échantillons prétraitées et utiliser une lame normale pour la dissection finale.</li>
		<li>L’exemple de l’intérêt à la diapositive et ajoutez 10 µL d’éthanol à 70 % frais. Travailler rapidement sur la dissection finale et ajouter 10 µL d’éthanol, si nécessaire, pour garder l’échantillon humide sans excès de liquide.</li>
		<li>Pour libérer les grains de pollen des étamines, reportez-vous à l’étape 5.1. Pour disséquer les carpelles et les ovules, suivez la procédure décrite à la Figure 2. Cette procédure s’applique à tous les stades de développement du carpelle, y compris le stade de développement de siliques vertes. Remarque : N’ajoutez pas l’éthanol s’il y a suffisant au report de l’éthanol ne bougent les échantillons ; dissection de très petits échantillons est beaucoup plus facile à une quantité minimale de liquide. Toujours garder seulement les organes d’intérêt (sépales, pétales, étamines, carpelles, ovules, graines ou grains de pollen) sur la diapositive. Cette procédure assurera une épaisseur uniforme entre la lame et lamelle, correspondant à l’épaisseur de l’organe en cours d’examen, ce qui entraîne une homogénéité supérieure et donc l’efficacité pour des examens au microscope (plus grand nombre de spécimens de la cible dans le même plan focal).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utiliser un petit morceau de papier buvard pour absorber et éliminer autant que possible d’éthanol. Procéder rapidement à l’étape suivante (sections 3, 4 ou 6) avant l’assèchement de l’échantillon des.</li>
</ol>3. Hydrate de Chloral-basé de compensation et de coloration combinée à compensation
NOTE : Les meilleurs résultats pour compensation basée sur l’hydrate de chloral sont obtenus avec FPA50 fixé le matériel.
<ol><li>Place 20 µL de solution de compensation (hydrate de chloral/glycérol, modification moyenne de Hoyer, 4½ de Herr ou solutions de IKI-4½ de Herr) sur la diapositive de spécimen-roulement. À l’aide d’une paire de seringues avec aiguilles hypodermiques, placez les échantillons selon le besoin en réduisant l’espace entre eux et renversant celles où l’organe d’intérêt fait face vers le bas. Supprimer toute bulle d’air restante à l’aide de l’aiguille.</li>
	<li>Abaisser un lamelle couvre-objet sur le côté et doucement le placer, en appuyant très légèrement et attendre que la solution de compensation remplit l’espace entre les deux. Ajouter la solution de compensation minimale, si nécessaire, pour remplir tout l’espace sous la lamelle.</li>
	<li>Placer la lame sur un support Dia et laissez-le sous la hotte. Procéder à l’observation au microscope après au moins 4 h et Pendant les 4 à 5 jours suivants.</li>
</ol>4. combiné Alexander de coloration et Herr 4½ compensation des anthères
NOTE : Le protocole original de Alexander repose sur la libération des grains de pollen sur la diapositive avant la coloration. Un efficace et plus informatif, modifiés Alexander coloration et procédure de compensation sont la coloration des grains de pollen mûrs dans les anthères matures mais non-déhiscent.
<ol><li>Choisissez fraîchement récoltés floraux qui sont sur le point d’ouvrir avec des anthères non-déhiscent. NOTE : Ne prenez pas plus jeunes boutons floraux car Alexander coloration est destiné à des grains de pollen matures et ne tache pas efficacement les grains de pollen immatures. Un minimum de 5 fleurs par récoltées sur des inflorescences et des différentes usines de traitement est recommandé.</li>
	<li>Préparer une plaque à 96 puits avec une solution d’assez Alexandre de submerger un bourgeon de fleur. Exposer les anthères en enlevant les sépales et les pétales et les plonger dans une solution d’Alexandre. Conserver les échantillons sous la hotte pendant 1 à 3 h.</li>
	<li>Remplacer la solution d’Alexandre avec solution 4½ de Herr et placer la plaque multipuite sous la hotte pour une incubation d’une nuit ou plus.</li>
	<li>À l’aide de pinces, déplacez doucement les boutons floraux dégagé sur une nouvelle diapositive. Puisque certains report d’une solution d’Alexandre peut se produire, utiliser un papier buvard pour enlever autant solution de compensation possible.</li>
	<li>Disséquer les étamines et supprimer tous les autres tissus. Suivez les étapes décrites dans l’article 3 à l’aide de la solution 4½ de Herr.</li>
</ol>5. Retirer les Grains de Pollen de l’Exine
Remarque : Nous recommandons d’utiliser le fixateur de Carnoy pour coloration DAPI.
<ol><li>Suivez les procédures de fixation et la dissection décrites aux paragraphes 1 et 2. Maintenant, on devrait avoir un à nombreuses étamines sur la diapositive dans un minimum de 70 % d’éthanol.</li>
	<li>Utiliser un papier absorbant pour enlever l’excès d’éthanol et ajouter 5 à 10 µL de solution DAPI. À l’aide de deux seringues avec aiguilles, libérer les grains de pollen au sein de cette petite quantité de solution (par exemple, utiliser une seringue pour immobiliser l’étamine et l’autre pour libérer les grains de pollen). Ajouter un autre 5 µL de DAPI si la solution se dessèche.</li>
	<li>Enlever tous les débris de l’étamine est une étape critique, telle que seulement les grains de pollen sont laissés entre la lame et la lamelle.</li>
	<li>Placez un lamelle couvre-objet sur la diapositive de spécimen portant en l’abaissant sur le côté et ajouter la quantité minimale de solution DAPI requise pour remplir l’espace. Placez un index sur la lamelle couvre-objet, et sans les écraser trop beaucoup faire un rapide, ferme et court mouvement de glissement. Remarque : Pour mesurer la force nécessaire et l’amplitude du mouvement coulissant, cette étape doit être pratiquée plusieurs fois, vérifiant les résultats chaque fois sous le microscope.</li>
	<li>Verser la solution DAPI si nécessaire et améliorer la diapositive dans une zone humide dans l’obscurité à 4 ° C pendant 15 min à 1 h. continuer d’observer des échantillons sous fluorescence grand-angulaire ou microscopie confocale dans les 24 h. essayer de combiner cette procédure avec SDS compensation pour vérifier si il y a plus de place ments peuvent être obtenues.</li>
</ol>6. dodécylsulfate de sodium (SDS) de compensation
Remarque : Selon l’organe floral à analyser et sur les compétences du chercheur à disséquer très douces et les plus petits spécimens, le traitement SDS peut être effectué avant (pour des chercheurs expérimentés) ou après la dissection étape (pour les moins expérimentés les chercheurs) sur méthanol-acide acétique fixé matériel.
<ol><li>Utiliser le verre d’un horloger, une lame concave ou un tube de microcentrifuge à incuber les échantillons disséqués ou non disséqué dans 1 % SDS et 0,2 solution de NaOH N du jour au lendemain à la température ambiante.</li>
	<li>Manipulez-les avec précaution parce que l’échantillon est très doux et a un aspect transparent. Rincer plusieurs fois avec de l’eau. NOTE : Restes de la solution SDS pourraient conduire à la précipitation lors de l’ajout de la solution colorante, par exemple, bleu d’aniline.</li>
	<li>Pour les échantillons non disséqué, suivez la procédure de dissection décrite à l’article 2, à l’aide de l’eau au lieu de l’éthanol à 70 %. Après dissection du tissu souhaité, enlever des restes et débris et tout surplus d’eau avec un papier absorbant, puis ajouter 20 – 40 µL de solution colorante et passez à l’étape 6.5.</li>
	<li>Pour les échantillons disséqués, soigneusement passer l’échantillon de la solution de lavage et le placer sur une lame propre et ajouter 20 – 40 µL de solution colorante.</li>
	<li>Placez délicatement un lamelle couvre-objet sur la diapositive en l’abaissant sur le côté. Prendre soin de ne pas pour écraser la préparation. Si le tissu est trop mou, lieu toute mince séparateur entre la lame et la lamelle à ses angles(par exemple, ruban adhésif ou une lamelle cassée), laissant un espace chambre entre lame et lamelle, telle que la lamelle n’est pas écraser l’échantillon.</li>
	<li>Placez toutes les diapositives d’une zone humide, couvrez-la de papier d’aluminium et placez-le à 4 ° C pendant au moins 1 h. continuer à observer l’échantillon à l’aide de widefield fluorescence ou microscopie confocale sous 24h.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’existence de nombreux boutons floraux au sein d’une inflorescence unique de l' Arabidopsis, couvrant toutes les étapes du développement de fleur, offre une occasion unique pour les études visant à caractériser l’effet d’un traitement ou d’une caractéristique du développement en même temps à travers les différentes étapes du développement floral. Un bon point de référence entre les différentes plantes individuelles est l’ouverture de la première fleur de l’inflorescence principale. Les plants sont traités de te...

Fleurs sont parmi les plus importantes définissant des organes des angiospermes. Plantes dicotylédones est apparu il y a 90 millions ans1et diversifié si vite que leur apparition rapide a été décrit comme un « mystère abominable » par Charles Darwin,2. Les intérêts des chercheurs de l’usine de développement floral sont diverses. Certaines recherches ont porté sur la compréhension de l’origine évolutive de la fleur dans son ensemble, ni l’évolution des propriétés spécifiques d’anatomiques, structurales et fonctionnelles des fleurs3,4,5,6 . La forte variation dans la forme florale et structure, ainsi que les modes de reproduction sexuée et asexuée, en s’appuyant sur eux, faire la fleur, une structure très complexe. Cela a conduit à divers efforts pour caractériser les éléments d’anatomie et de la structure des organes floraux, en utilisant des techniques microscopiques photonique et électronique qui pourraient être associées à des études génétiques et moléculaires7. En outre, comme la source de graines, de fruits et de fleurs sont d’une importance primordiale pour la nutrition humaine et animale. Donc, la caractérisation du développement de fleurs et de fruits a de nombreuses implications pour la recherche appliquée, y compris la sécurité alimentaire d’une population croissante et des stratégies de conservation écologique portant une mutation de l’environnement8 , 9 , 10.
Développement floral chez Arabidopsis commence avec l’induction florale et la transformation du méristème végétatif d’un méristème de l’inflorescence (groupe de fleurs). Fleur primordiums latéralement sur le flanc de l’inflorescence méristème11. Les primordia des organes floraux forment progressivement en verticilles concentriques de l’extérieur vers le centre de la fleur et éventuellement se développent en des sépales, pétales, étamines et des carpelles7. Ces organes floraux remplissent distincte nutritive, protectrice et fonctionnelle (par exemple, l’attraction des pollinisateurs) rôles dans différentes espèces de plantes, avec les organes sexuels, soutenir le développement des gamétophytes mâles et femelles, respectivement12 , 13. les gamétophytes, à son tour, chacun différencient une paire de mâles (spermatozoïdes) et des gamètes femelles (oeuf et cellule centrale), qui s’unissent à la double fécondation pour former la prochaine génération, le zygote et l’endosperme primaire, un terminal tissus soutenant le développement de l’embryon14,15. Développement des fruits et semences de soutenir la croissance, la maturation et la conservation de l’embryon et, éventuellement, sa dispersion. Une recherche approfondie a été effectuée pour caractériser la fleur et l’embryon développement dans diverses espèces végétales, en particulier en l’espèce modèle Arabidopsis7,16,17.
Des analyses microscopiques au début du développement floral reposaient sur le traitement des échantillons fastidieux et observation techniques, comme la paraffine ou résine enrobage et sectionnant, combiné avec la lumière ou la microscopie électronique. Ces techniques microscopiques traditionnelles étaient souvent utilisés en combinaison avec des enquêtes génétiques moléculaires, comme les analyses microscopiques de mutants, de la localisation de l’ARN par hybridation in situ ou immuno-détection des protéines. Les progrès récents en microscopie à fluorescence à champ large et confocale, dans les analyses de l’état-of-the-art image assistée par ordinateur en 3D et l’amélioration continue des méthodes moléculaires qui peuvent être utilisés sur des spécimens entiers minimalement transformés, a conduit à un besoin de techniques de traitement efficace et un minimum l’échantillon qui sont préférentiellement se prêtent à des analyses quantitatives. Ces dernières années, des progrès significatifs accomplis dans le développement de techniques de compensation sur les animaux spécimen entier-montent. Ils rendent l’échantillon transparent soit en utilisant des réactifs aqueux ou sucre-base d’urée (p. ex., échelle, SeeDB, cubique)18,19,20, soit en supprimant sélectivement les lipides (en utilisant le détergent SDS) après incorporant des échantillons dans les hydrogels stables ; l’élimination des lipides peut être atteint soit par diffusion passive (p. ex., modification clarté protocole21, Pacte-PARS-jantes22) ou activement par électrophorèse (original clarté protocole23 et24de la loi-PRESTO). Encouragée par ces progrès rapides, certaines techniques dérivées apparaissent également pour utilisation dans les usines.
Dans cet article de méthodes axé sur le modèle Arabidopsis, nous décrivons la procédure pour la dissection correcte des boutons floraux, les fleurs et les siliques jeunes et l’enlèvement des échantillons entiers pour colorer diverses et les procédures d’observation à l’aide classique ou d’une méthode axée sur le SDS clairière récente. Exemples d’amidon, callose et coloration de la chromatine sont donnés. Bien que ces procédures peuvent besoin de plus d’améliorations et adaptations lorsqu’il est utilisé avec d’autres espèces, nous espérons qu’ils préparera le terrain pour des recherches ultérieures sur ces méthodes simples mais essentielles qui constituent le point de départ de nombreux projets de recherche.

<table><tbody><tr><td><Réactifs et matériaux > forts</forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Scharlau</td><td>ET00102500</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Applichem</td><td>A3686,2500</td><td>100 % biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>Biologie moléculaire Méthanol</td></tr><tr><td></td><td>Scharlau</td><td>ME03062500</td><td></td></tr><tr><td>Solution de formaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Acide propionique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81910-250 ml</td><td></td></tr><tr><td>Hydrate de chloral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15307</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Roth</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>Gomme arabique</td><td>Fluka</td><td>51198</td><td></td></tr><tr><td>Acide lactique</td><td>Fluka</td><td>69773</td><td></td></tr><tr><td>Phénol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77607-250ML</td><td>Nous avons utilisé du phénol liquide (utilisez la densité pour trouver le volume requis pour votre solution)</td></tr><tr><td>Huile de clou de girofle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8392-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Xylène</td><td>Roth</td><td>4436.1</td><td></td></tr><tr><td>Iode</td><td>Fluka</td><td>57665</td><td></td></tr><tr><td>Iodure de potassium</td><td>Merck</td><td>5043</td><td></td></tr><tr><td>Malachite Vert</td><td>Fluka</td><td>63160</td><td></td></tr><tr><td>Acide fuchsin</td><td>Fluka</td><td>84600</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Sigma</td><td>7252</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate</td><td>de sodium Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>Biologie moléculaire Hydroxyde</td></tr><tr><td>de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>Di-hydrogénophosphate de sodium</td><td>Applichem</td><td>A1047,1000</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate</td><td>de potassium Sigma-Aldrich</td><td>04347</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A2937,1000</td><td></td></tr><tr><td>Calcofluor</td><td>Sigma</td><td>F6259</td><td>Azurant 28</td></tr><tr><td>Auramine</td><td>Chroma</td><td>10120</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>toxique Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Bleu aniline</td><td>Merck</td><td>1275</td><td></td></tr><tr><td>MS medium</td><td>Carolina</td><td>19-57030</td><td></td></tr><tr><td>Substrat riche en nutriments</td><td>Einheitserde</td><td>ED73</td><td></td></tr><tr><td>Verre</td><td></td><td></td> d’horloger <td>Pas de marque spécifique</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger faucon de 15 ml</td><td>VWR</td><td>62406-200</td><td></td></tr><tr><td>Dumond Forceps</td><td>Actimed</td><td>0208-5SPSF-PS</td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td>DUMONT BIOLOGY</td><td>0108-5</td><td></td></tr><tr><td>Seringue</td><td>BD</td><td>BD Plastipak 300013</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Aiguille de préparation</td><td>BD</td><td>BD Microlance 304000</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143562CE</td><td>Bords coupés</td></tr><tr><td>Lamelles</td><td>Thermo Scientific</td><td>DV40008</td><td></td></tr><tr><td>Boîte</td><td></td><td></td> humide <td>Une boîte en plastique avec une serviette en papier humide et des supports de toboggan à l’intérieur</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fixatives</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Fixateur <td></td><td></td><td>Carnoy (Farmer’s)</td><td>Éthanol absolu : acide acétique glacial, 3:1 (ml :ml)</td></tr><tr><td>Fixateur</td><td></td><td></td> de méthanol/acide acétique <td>50 % (v/v) méthanol, 10 % (v/v) d’acide acétique glacial dans de l’eau déminéralisée</td></tr><tr><td>FPA50 fixateur</td><td></td><td></td><td>de formol, acide propionique, 50 % d’éthanol ; 5:5:90 (ml :ml :ml)</td></tr><tr><td><fort>Solutions éclaircissantes</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrate de chloral/glycérol</td><td></td><td></td><td>Hydrate de chloral : glycérol : eau, 8:1:2 (g :ml :ml). Peut être utilisé pour tous les stades de développement des fleurs et pour le développement de la silique avec la microscopie DIC. Le meilleur fixateur est le FPA50</td></tr><tr><td>Modified Hoyer</td><td></td><td></td><td>Gum arabic 7,5 g, hydrate de chloral 100 g, glycérol 5 ml, eau 30 ml. Peut être utilisé pour tous les stades de développement des fleurs et pour le développement de la silique avec la microscopie DIC. Le meilleur fixateur est le FPA50</td></tr><tr><td>Herr’s 4&frac12 ; fluide</td><td></td><td></td> nettoyant à base de formol <td>Acide lactique, hydrate de chloral, cristaux de phénol, huile de clou de girofle, xylène ; 2:2:2:2:1, en poids. Peut être utilisé pour tous les stades de développement des fleurs (en particulier pour le développement des étamines) et pour le développement de la silique avec la microscopie DIC. Le meilleur fixateur est la</td></tr><tr>solution <td></td><td></td><td>SDS/NaOH</td> FPA50 à base de formol <td>Mélangez-diluez la SDS et la solution mère de NaOH à 1 % SDS / 0,2 N NaOH (dilution 10x). Pour tous les stades de développement de la fleur et de la silique. Le meilleur fixateur est le fixateur à l’acide méthano/acétique ; Les deux autres fixateurs peuvent également être utilisés. Peut être combiné avec du calcofluor, de l’auramine, du DAPI et une solution de coloration au bleu d’aniline.</td></tr><tr><td>SDS solution</td><td></td><td></td> mère <td>10 % (p/v) de dodécylsulfate de sodium. Dissoudre 10 g de dodécylsulfate de sodium dans 80 ml d’eau déminéralisée et compléter à 100 ml avec de l’eau déminéralisée.</td></tr><tr><td>Solution</td><td></td><td></td> mère de NaOH <td>2 N Solution de NaOH : dissoudre 4 g de NaOH dans 40 ml d’eau désionisée et compléter à 100 ml avec de l’eau désionisée</td></tr><tr><td><forte>Solutions combinées d’élimination et de coloration</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Herr’s IKI-4&frac12 ;</td><td></td><td></td><td>Sur un standard 4&frac12 ; (9 g au total) Ajouter : 100 mg d’iode, 500 mg d’iodure de potassium. Cette solution de clarification peut être utilisée pour tous les stades de développement des fleurs et pour le développement de la silique, soit pour augmenter le contraste, soit pour caractériser la dynamique de l’amidon. Utilisez le FPA50 pour l’analyse structurelle et le fixateur de Carnoy pour l’analyse quantitative de l’amidon.</td></tr><tr><td>Coloration</td><td></td><td></td> Alexander <td>Éthanol 95 % 10ml, vert malachite (1 % dans 95 % EtOH) 1 ml, acide fuchsine (1 % dans ddH2O) 5ml, orange G (1 % dans ddH2O) 0.5ml, phénol 5g, hydrate de chloral 5g, acide acétique glacial 2ml, glycérol 25ml. Ce nettoyage/coloration seul ou en combinaison avec Herr’s 4&frac12 ; La solution peut être utilisée pour évaluer l’avortement du pollen dans les fleurs avec des grains de pollen matures et tricellulaires. Il est utilisé sur du matériel non fixé fraîchement préparé.</td></tr><tr><td><solutions de coloration >fortes</fortes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>solution</td><td></td><td></td> de <td>Calcofluor Calcofluor 0,007 % dans l’eau (g :ml). Utilisé à l’origine comme éclaircissant optique. Peut être utilisé pour colorer la cellulose, les polysaccharides carboxylés et le callose dans les parois cellulaires. Fréquemment utilisé pour colorer l’intine du grain de pollen. Les trois fixateurs peuvent être utilisés avec cette solution.</td></tr><tr><td>Solution</td><td></td><td></td><td>d’Auramine Auramine 0,01 % dans l’eau (g :ml). Ce colorant fluorscent lipophile peut être utilisé pour colorer les cuticules, la cutine et l’exine, entre autres. Les trois fixateurs peuvent être utilisés avec cette solution</td></tr><tr>Mélange <td></td><td></td><td>Calcofluor-Auramine</td><td>Solution d’Auramine : Solution de Calcofluor, 3:1. Peut être utilisé pour une coloration combinée par les deux solutions. D’autres proportions peuvent être dosées en maintenant une proportion plus faible de calcofluor par rapport à l’auramine.</td></tr><tr><td>Solution</td><td></td><td></td><td>DAPI DAPI 0,4 μg/ml, tampon de phosphate de sodium 0,1 M (pH 7), Triton-X-100 à 0,1 %, EDTA 1 mM. Cette solution peut être utilisée pour colorer les propagations chromosomiques au cours de la méiose masculine et féminine, et les noyaux cellulaires de n’importe quel tissu. Fréquemment utilisé pour étudier le développement des grains de pollen. Le carnoy et le méthanol/acide acétique sont les meilleurs fixateurs pour cette solution. Les fixateurs à base de formaldéhyde tels que le FPA50 peuvent interférer avec la coloration. Excitation dans l’UV et émission maximale autour de 461 nm.</td></tr><tr><td>Tampon phosphate de sodium (0,1 M)</td><td></td><td></td><td>Récepteur de protons : 0,2 M Na2HPO4, donneur de protons : 0,2 M NaH2PO4, rapport donneur de protons / récepteur de protons : 1,364 (pour un pH de 7)</td></tr><tr>Solution <td></td><td></td> de <td>bleu d’aniline</td><td>0,1 % (p/v) bleu d’aniline, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2 % de glycérol. Cette solution peut être utilisée pour colorer la callose et la cellulose de nombreux stades de développement (par exemple, dépôt de callose dans les térades mâles et femelles, bouchons de callose dans les tubes polliniques). Excitation dans l’UV et émission maximale autour de 455. Il peut également être excité à 514 nm avec émission dans le rouge pour la coloration du contenu cellulaire.</td></tr></tbody></table>

entier-montez de compensation et la coloration des siliques et organes fleur arabidopsis

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

En raison de sa formidables outils pour les études de génétique moléculaire, Arabidopsis thaliana est une des espèces plus en vue de la modèle en biologie végétale et, surtout, en biologie de la reproduction végétale. Cependant, plante morphologique, anatomique et les analyses ultrastructurales comprennent traditionnellement beaucoup de temps l’incorporation et la section procédures de champ lumineux, balayage et au microscope électronique. Les progrès récents dans la microscopie confocal fluorescence, state-of-the-art 3D analyses microscopiques assistée par ordinateur et l’amélioration continue des techniques moléculaires pour être utilisé sur des spécimens entiers minimalement transformés, a conduit à une augmentation de la demande pour développement de techniques de traitement efficace et un minimum l’échantillon. Dans ce protocole, les auteurs décrivent les techniques de dissection correctement Arabidopsis fleurs et siliques, base de techniques, de compensation et certaines méthodes de coloration pour toute monture observations des structures reproductrices.

Arabidopsis appartient à la famille des Brassicacées, portant des inflorescences avec des fleurs bisexuées, disposées en corymbe (Figure 1). Chaque fleur comporte quatre sépales, quatre pétales, six étamines (quatre de long et deux courts) et un gynécée syncarpe constitué de deux carpelles congénitalement fusionnés (Figure 1F-H) disposées en verticilles concentriques quatre25...

Dans ce protocole, nous décrivent des techniques pour la dissection appropriée d’Arabidopsis fleurs et siliques, quelques techniques de base de compensation et sélectionné les procédures pour les observations d’entier-montent des structures reproductrices de coloration.

Entier-Montez de compensation et la coloration des Siliques et organes fleur Arabidopsis

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Ce protocole décrit comment disséquer correctement les boutons floraux, les fleurs et les jeunes siliques. Et le nettoyage ultérieur de l’ensemble du montage pour diverses techniques de coloration et d’observation. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la production de plantes sexuées.Comme une analyse de mutance constante ou tout échec induit par l’environnement et expérimentalement dans le développement et la fonction des fleurs. Le principal avantage de cette technique est de permettre un dépistage facile et rapide de plusieurs stades de développement simultanément. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de dissection des organes de la fleur sont difficiles à apprendre car elles nécessitent une connaissance préalable de l’anatomie des fleurs et des compétences en dissection.Pour commencer, utilisez de petits ciseaux pour retirer les fleurs des plantes synchronisées. Et placez-les immédiatement dans des tubes de microcentrifugation individuels, contenant un fixateur approprié. Ensuite, retirez le fixateur et ajoutez suffisamment d’éthanol à 70 % pour couvrir complètement les échantillons.Retournez les échantillons à quatre degrés Celsius pendant au moins 24 heures. Remplissez ensuite un verre d’horloger avec de l’éthanol à 70 % fraîchement préparé et placez-le dans une petite boîte de Pétri pour le soutenir. Placez ensuite l’inflorescence dans le verre de l’horloger et assurez-vous qu’elle est totalement recouverte d’éthanol.À l’aide d’une pince et d’une seringue munie d’une aiguille, disséquez la fleur au stéréomicroscope en déchirant les sépales, les pétales et les étamines. Placez ensuite le verre de l’horloger de côté et utilisez une lame de verre pour la dissection finale. Déplacez l’échantillon sur la diapositive et ajoutez 10 microlitres d’éthanol à 70 % fraîchement préparé.Faites des coupes de chaque côté du carpe, en le tournant au besoin. Retirez ensuite délicatement les valves pour exposer les ovules. Faites une petite entaille nette pour détacher la moitié du tissu transmetteur du réceptacle et utilisez une pince et une aiguille pour déchirer les deux moitiés.Retirez le style stigmate et le pédoncule avec des coupes nettes. À l’aide de la pince et de l’aiguille, retournez doucement et disposez les ovules encore attachés pour obtenir deux rangées parallèles. À l’aide d’un petit morceau de papier buvard, retirez l’éthanol de l’échantillon sur la lame de verre.Ajoutez ensuite 20 microlitres de solution éclaircissante sur la lame. À l’aide d’une paire de seringues avec des aiguilles hypodermiques, positionnez les échantillons et éliminez les bulles d’air restantes. Ensuite, placez délicatement une lamelle sur la lame et attendez que la solution clarifiante remplisse l’espace entre la lamelle et l’échantillon.Placez la diapositive dans un support de diapositive et laissez-la sous la hotte. Passons donc à des boutons floraux fraîchement récoltés qui sont sur le point de s’ouvrir avec des anthères non déhiscentes. Préparez ensuite une assiette à 96 puits avec suffisamment de solution Alexander pour immerger complètement les boutons floraux.Retirez les sépales et les pétales pour exposer les anthères et trempez-les dans la solution Alexander. Laissez la plaque reposer sous la hotte pendant une à trois heures. Remplacez ensuite la solution Alexander par la solution quatre et demie de Herr et incubez la plaque sous la hotte pendant la nuit.Le lendemain, utilisez une pince pour déplacer soigneusement les bourgeons effacés vers une nouvelle lame. Ensuite, disséquez les étamines et retirez tous les autres tissus des échantillons. Procédez ensuite à un nettoyage à base d’hydrate de chloral et à une coloration de nettoyage combinée à l’aide de la solution quatre et demie de Herr.Déplacez d’abord la fleur du verre de l’horloger vers la diapositive et utilisez un papier buvard pour enlever l’excès d’éthanol. Ajouter cinq à 10 microlitres de solution DAPI. À l’aide de deux seringues avec des aiguilles hypodermiques, disséquez les étamines et retirez tous les autres organes de la fleur.Libérez ensuite les grains de pollen dans la solution DAPI. Retirez tous les débris de l’étamine de la lame en veillant à ce que seuls les grains de pollen restent sur la lame. L’élimination de tous les débris d’étamines de la lame est l’étape la plus critique pour l’élimination de l’exine.Seuls les grains de pollen doivent être laissés entre la lame et la lamelle. Ensuite, placez une lamelle sur la glissière de roulement de l’échantillon et ajoutez la quantité minimale de solution DAPI nécessaire pour remplir l’espace entre la lame et la lamelle. Placez doucement un index sur la lamelle et effectuez un mouvement de glissement rapide et court.Placez la diapositive dans une boîte humaine dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant au moins 15 minutes. Observez ensuite la lame sous fluorescence à grand champ ou microscopie confocale dans les 24 heures. Déplacez l’échantillon disséqué du verre de l’horloger vers une plaque de verre avec des cavités remplies de 1 % de SDS et d’une solution d’hydroxyde de sodium 0,2.Incuber toute la nuit à température ambiante. La solution d’hydroxyde de sodium SDS effacera rapidement les échantillons, les rendant transparents en quelques minutes. Rincez soigneusement l’échantillon à l’eau et placez-le sur une lame propre.Ajoutez ensuite 20 à 40 microlitres de solution de coloration sur la lame. En fonction de l’organe floral à analyser et des compétences du chercheur, ce traitement de SD peut être réalisé avant, pour les chercheurs expérimentés ou après l’étape de dissection pour les chercheurs moins expérimentés. Placez ensuite une lamelle sur la diapositive en prenant soin de ne pas écraser la préparation.Placez ensuite toutes les lames préparées dans une boîte humaine recouverte de papier d’aluminium et incubez à quatre degrés Celsius pendant une heure. Enfin, observez l’échantillon sous fluorescence à grand champ ou microscopie confocale. À la suite de la procédure de dissection, décrite dans le protocole, les tissus inutiles qui pourraient entraver les observations sont retirés et des images plus détaillées sont obtenues.Selon l’objectif, la coloration à l’hydrate de chloral peut être utilisée pour caractériser le développement précoce de la fleur au niveau de l’ensemble du bouton floral, la méiose et la genèse de la micro-gomédale dans l’anthère, le développement précoce de l’ovule et la spécification de la cellule mère de la mégaspore, le développement femelle go-médicamenté, ou même l’invasion du tube pollinique de la grille centrale. La combinaison de la coloration d’Alexander et de la clairière de Herr permet d’évaluer l’avortement du pollen dans un locule donné ou une anthère dans son ensemble. Alors que les grains de pollen viables présentent un cytoplasme rouge, les grains avortés montrent un cytoplasme vide et finissent par être de forme irrégulière et totalement écrasés.L’élimination de l’exine entraîne une augmentation de l’intensité de coloration des noyaux et des détails plus élevés de l’organisation de la chromatine. L’utilisation et l’élimination de l’hydroxyde de sodium SDS avant la coloration ont rendu l’inflorescence transparente. Et a entraîné une coloration plus élevée de la callose dans les tissus floraux.Il a révélé des accumulations de callose généralement difficiles à voir. Comme la couche de callose qui sépare la cellule générative de la cellule végétative. Même lorsque les grains de pollen étaient encore contenus dans l’anthère.Une fois maîtrisées, ces techniques peuvent être réalisées en moins de 48 heures, si elles sont correctement exécutées. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les résultats dépendent en grande partie d’une bonne préparation de l’échantillon, comme l’utilisation du fixateur approprié, la réalisation correcte de la dissection et l’isolation du tissu d’intérêt sur la lame.

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Biologie du développement

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