Entier-Montez de compensation et la coloration des Siliques et organes fleur Arabidopsis

Dans ce protocole, nous décrivent des techniques pour la dissection appropriée d’Arabidopsis fleurs et siliques, quelques techniques de base de compensation et sélectionné les procédures pour les observations d’entier-montent des structures reproductrices de coloration.

Ce protocole décrit comment disséquer correctement les boutons floraux, les fleurs et les jeunes siliques. Et le nettoyage ultérieur de l’ensemble du montage pour diverses techniques de coloration et d’observation. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la production de plantes sexuées.

Comme une analyse de mutance constante ou tout échec induit par l’environnement et expérimentalement dans le développement et la fonction des fleurs. Le principal avantage de cette technique est de permettre un dépistage facile et rapide de plusieurs stades de développement simultanément. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de dissection des organes de la fleur sont difficiles à apprendre car elles nécessitent une connaissance préalable de l’anatomie des fleurs et des compétences en dissection.

Pour commencer, utilisez de petits ciseaux pour retirer les fleurs des plantes synchronisées. Et placez-les immédiatement dans des tubes de microcentrifugation individuels, contenant un fixateur approprié. Ensuite, retirez le fixateur et ajoutez suffisamment d’éthanol à 70 % pour couvrir complètement les échantillons.

Retournez les échantillons à quatre degrés Celsius pendant au moins 24 heures. Remplissez ensuite un verre d’horloger avec de l’éthanol à 70 % fraîchement préparé et placez-le dans une petite boîte de Pétri pour le soutenir. Placez ensuite l’inflorescence dans le verre de l’horloger et assurez-vous qu’elle est totalement recouverte d’éthanol.

À l’aide d’une pince et d’une seringue munie d’une aiguille, disséquez la fleur au stéréomicroscope en déchirant les sépales, les pétales et les étamines. Placez ensuite le verre de l’horloger de côté et utilisez une lame de verre pour la dissection finale. Déplacez l’échantillon sur la diapositive et ajoutez 10 microlitres d’éthanol à 70 % fraîchement préparé.

Faites des coupes de chaque côté du carpe, en le tournant au besoin. Retirez ensuite délicatement les valves pour exposer les ovules. Faites une petite entaille nette pour détacher la moitié du tissu transmetteur du réceptacle et utilisez une pince et une aiguille pour déchirer les deux moitiés.

Retirez le style stigmate et le pédoncule avec des coupes nettes. À l’aide de la pince et de l’aiguille, retournez doucement et disposez les ovules encore attachés pour obtenir deux rangées parallèles. À l’aide d’un petit morceau de papier buvard, retirez l’éthanol de l’échantillon sur la lame de verre.

Ajoutez ensuite 20 microlitres de solution éclaircissante sur la lame. À l’aide d’une paire de seringues avec des aiguilles hypodermiques, positionnez les échantillons et éliminez les bulles d’air restantes. Ensuite, placez délicatement une lamelle sur la lame et attendez que la solution clarifiante remplisse l’espace entre la lamelle et l’échantillon.

Placez la diapositive dans un support de diapositive et laissez-la sous la hotte. Passons donc à des boutons floraux fraîchement récoltés qui sont sur le point de s’ouvrir avec des anthères non déhiscentes. Préparez ensuite une assiette à 96 puits avec suffisamment de solution Alexander pour immerger complètement les boutons floraux.

Retirez les sépales et les pétales pour exposer les anthères et trempez-les dans la solution Alexander. Laissez la plaque reposer sous la hotte pendant une à trois heures. Remplacez ensuite la solution Alexander par la solution quatre et demie de Herr et incubez la plaque sous la hotte pendant la nuit.

Le lendemain, utilisez une pince pour déplacer soigneusement les bourgeons effacés vers une nouvelle lame. Ensuite, disséquez les étamines et retirez tous les autres tissus des échantillons. Procédez ensuite à un nettoyage à base d’hydrate de chloral et à une coloration de nettoyage combinée à l’aide de la solution quatre et demie de Herr.

Déplacez d’abord la fleur du verre de l’horloger vers la diapositive et utilisez un papier buvard pour enlever l’excès d’éthanol. Ajouter cinq à 10 microlitres de solution DAPI. À l’aide de deux seringues avec des aiguilles hypodermiques, disséquez les étamines et retirez tous les autres organes de la fleur.

Libérez ensuite les grains de pollen dans la solution DAPI. Retirez tous les débris de l’étamine de la lame en veillant à ce que seuls les grains de pollen restent sur la lame. L’élimination de tous les débris d’étamines de la lame est l’étape la plus critique pour l’élimination de l’exine.

Seuls les grains de pollen doivent être laissés entre la lame et la lamelle. Ensuite, placez une lamelle sur la glissière de roulement de l’échantillon et ajoutez la quantité minimale de solution DAPI nécessaire pour remplir l’espace entre la lame et la lamelle. Placez doucement un index sur la lamelle et effectuez un mouvement de glissement rapide et court.

Placez la diapositive dans une boîte humaine dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant au moins 15 minutes. Observez ensuite la lame sous fluorescence à grand champ ou microscopie confocale dans les 24 heures. Déplacez l’échantillon disséqué du verre de l’horloger vers une plaque de verre avec des cavités remplies de 1 % de SDS et d’une solution d’hydroxyde de sodium 0,2.

Incuber toute la nuit à température ambiante. La solution d’hydroxyde de sodium SDS effacera rapidement les échantillons, les rendant transparents en quelques minutes. Rincez soigneusement l’échantillon à l’eau et placez-le sur une lame propre.

Ajoutez ensuite 20 à 40 microlitres de solution de coloration sur la lame. En fonction de l’organe floral à analyser et des compétences du chercheur, ce traitement de SD peut être réalisé avant, pour les chercheurs expérimentés ou après l’étape de dissection pour les chercheurs moins expérimentés. Placez ensuite une lamelle sur la diapositive en prenant soin de ne pas écraser la préparation.

Placez ensuite toutes les lames préparées dans une boîte humaine recouverte de papier d’aluminium et incubez à quatre degrés Celsius pendant une heure. Enfin, observez l’échantillon sous fluorescence à grand champ ou microscopie confocale. À la suite de la procédure de dissection, décrite dans le protocole, les tissus inutiles qui pourraient entraver les observations sont retirés et des images plus détaillées sont obtenues.

Selon l’objectif, la coloration à l’hydrate de chloral peut être utilisée pour caractériser le développement précoce de la fleur au niveau de l’ensemble du bouton floral, la méiose et la genèse de la micro-gomédale dans l’anthère, le développement précoce de l’ovule et la spécification de la cellule mère de la mégaspore, le développement femelle go-médicamenté, ou même l’invasion du tube pollinique de la grille centrale. La combinaison de la coloration d’Alexander et de la clairière de Herr permet d’évaluer l’avortement du pollen dans un locule donné ou une anthère dans son ensemble. Alors que les grains de pollen viables présentent un cytoplasme rouge, les grains avortés montrent un cytoplasme vide et finissent par être de forme irrégulière et totalement écrasés.

L’élimination de l’exine entraîne une augmentation de l’intensité de coloration des noyaux et des détails plus élevés de l’organisation de la chromatine. L’utilisation et l’élimination de l’hydroxyde de sodium SDS avant la coloration ont rendu l’inflorescence transparente. Et a entraîné une coloration plus élevée de la callose dans les tissus floraux.

Il a révélé des accumulations de callose généralement difficiles à voir. Comme la couche de callose qui sépare la cellule générative de la cellule végétative. Même lorsque les grains de pollen étaient encore contenus dans l’anthère.

Une fois maîtrisées, ces techniques peuvent être réalisées en moins de 48 heures, si elles sont correctement exécutées. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les résultats dépendent en grande partie d’une bonne préparation de l’échantillon, comme l’utilisation du fixateur approprié, la réalisation correcte de la dissection et l’isolation du tissu d’intérêt sur la lame.