Méthodes alternatives In Vitro pour la détermination de l’intégrité structurale de la capside virale

L’objectif global de ces méthodes est de mieux comprendre les effets d’un traitement sur l’infectiosité ou l’intégrité de la capside du norovirus humain. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’inactivation virale non enveloppée. Comme ce qui arrive à la capacité de la capside virale à infecter une cellule après un traitement donné.

Le principal avantage de ces méthodes est qu’elles peuvent fournir des informations mécanistes supplémentaires sur l’action d’un traitement donné sur le virus. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des stratégies d’inactivation des norovirus humains, elle a également le potentiel d’être appliquée à d’autres virus non enveloppés tels que le rhinovirus ou l’hépatite A.To commencer, diluer la protéine majeure de la capside du norovirus humain purifié, assemblée en capsides à 50 microgrammes par millilitre dans une solution saline tamponnée au phosphate 1X. Utilisez un volume maximum de 15 microlitres dans les tubes PCR individuels bouchés.

Assurez-vous que le tube contient au moins 600 nanogrammes de capside et qu’il y a 600 nanogrammes de capside par combinaison de ligands de traitement. Ensuite, préchauffez le thermocycleur au traitement thermique souhaité. Ensuite, préchauffez un thermocycleur supplémentaire à quatre degrés Celsius pour un refroidissement immédiat.

Ajouter les tubes avec la solution de capside dans le thermocycleur pendant le temps souhaité. Après le chauffage, transférez immédiatement les tubes dans le cycleur prérefroidi à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Faites tourner brièvement les tubes dans la centrifugeuse pour faire passer toutes les gouttelettes au fond du tube.

Diluez les solutions de capside traitées et le PBS à trois microgrammes par millilitre. Assurez-vous qu’il y a au moins 200 microlitres de capside traitée diluée. Ensuite, appliquez 100 microlitres de solution de capside dans chaque puits, assurez-vous qu’il y a au moins deux puits par traitement.

De plus, incluez deux puits de contrôle avec 100 microlitres de PBS pour chaque ligand. Cela fournit l’absorbance de fond du test. Couvrez la plaque avec un couvercle et scellez les bords avec un film de paraffine pour réduire l’évaporation.

Laissez l’assiette toute la nuit sur un incubateur à agitation à quatre degrés Celsius ou pendant deux heures à température ambiante. Après l’incubation, retirer les solutions de capside traitées de la plaque. Ensuite, ajoutez 200 microlitres par puits de tampon de blocage.

Incuber pendant deux heures à température ambiante ou scellé à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Pendant ce temps, diluez l’aptamère biotinylé en une micromolaire dans de l’eau sans nucléases. Assurez-vous qu’il y a suffisamment de solution pour un total de 200 microlitres pour chaque traitement.

De plus, diluez le HPGA biotinylé choisi à 30 microlitres par millilitre dans le tampon de blocage. Encore une fois, assurez-vous qu’il y a suffisamment de solution pour un volume total de 200 microlitres pour chaque traitement. Après l’incubation, retirez le tampon de blocage et lavez la plaque trois fois avec 200 microlitres par puits de PBST.

Tapotez l’assiette à l’envers sur du papier absorbant stérile pour sécher l’humidité résiduelle. Ensuite, à 100 microlitres par puits des solutions de liaison de ligand garantissant qu’il y a deux puits par combinaison de ligands de traitement thermique, incubez la plaque recouverte sur un agitateur orbital à environ 60 tr/min pendant une heure à température ambiante. Après avoir lavé les puits, comme décrit dans le protocole de texte, ajoutez 100 microlitres par puits de 0,2 microgramme par millilitre de streptavidine, de raifort, de peroxydase et de PBS.

Incuber pendant 15 minutes à température ambiante en secouant doucement sur un agitateur orbital avant de laver à nouveau les puits. Ensuite, après un autre lavage, ajoutez 100 microlitres par puits de substrat TMB et laissez la couleur se développer pendant cinq à 15 minutes. Observez les puits pour la couleur.

Assurez-vous de développer de manière cohérente pendant le même temps entre les plaques répliquées et soyez conscient de la plage d’absorbance du lecteur de plaques utilisé. Arrêtez le développement de la réaction avec 100 microlitres par puits d’une molaire d’acide phosphorique. Lire immédiatement la plaque à 450 nanomètres.

Créez une procédure d’utilisation standard de nouvelle taille dans le logiciel de l’instrument DLS, comme indiqué dans le protocole texte. Ensuite, sélectionnez la flèche verte dans le logiciel et nommez l’échantillon. Diluez les particules pseudo-virales traitées thermiquement de un à 10 dans 1X PBS pour une concentration finale de cinq microgrammes par millilitre.

Ensuite, filtrez l’échantillon avec une taille de pores d’un micron pour éliminer les particules de poussière. Le DLS est très sensible à la poussière, car les grosses particules diffusent beaucoup plus de lumière que les petites particules. Transférez 50 microlitres de VLP dilués dans une cuvette jetable de petit volume.

Insérez la cuvette dans la chambre d’échantillonnage de l’instrument. Démarrez l’exécution et utilisez les onglets corrélogramme cumulant ajustement et conseils d’experts pour évaluer la qualité des données. Pendant l’exécution, vérifiez que la dispersion poly de la valeur de l’indice est inférieure à 0,3, ce qui représente une mesure de qualité.

Dans l’onglet multivue, assurez-vous que le coefficient de corrélation est constant et proche de 1 mais pas plus de un à court terme et qu’il diminue brusquement à zéro par la suite, caractéristique de la taille des particules. Utilisez l’onglet conseils d’experts pour obtenir des commentaires sur la qualité des données pendant les mesures. Une fois la mesure terminée, vérifiez à nouveau que la dispersion poly de la valeur de l’indice est inférieure à 0,3.

Assurez-vous que la ligne d’ajustement des cumulants suit de près les points de données dans l’onglet d’ajustement des cumulants. Créez une nouvelle procédure d’utilisation standard de taille dans le logiciel de l’instrument DLS, comme indiqué dans le protocole texte. Sélectionnez la flèche d’exécution dans le logiciel pour ouvrir et nommer un nouvel échantillon et permettre à l’instrument d’atteindre l’équilibre de température.

Transférez la suspension VLP dans une cuvette en quartz de petit volume, évitez les bulles et pipetez lentement contre la paroi de la cuvette. Une fois que l’instrument a atteint l’équilibre de température, insérez la cuvette dans la chambre d’échantillonnage. Après avoir attendu 10 secondes que la température de l’échantillon s’équilibre, démarrez le cycle et démarrez simultanément une minuterie.

Arrêtez le chronomètre à la fin de la première mesure. Prenez ce temps comme premier point temporel. Obtenez des points temporels ultérieurs à partir des temps de mesure enregistrés par le logiciel.

Effectuez le traitement thermique comme auparavant, sauf qu’il remplace les tas de 10 millimolaires par du PBS, pH 7,4 et ne diluez pas davantage les capsides après le traitement. Ensuite, pipetez la totalité de la goutte de 15 microlitres de solution de capside traitée sur un film de paraffine. Saisissez le bord de la grille avec une pince à épiler pour leur permettre de se refermer sur le bord pour maintenir la grille et placez la grille côté carbone vers le bas sur la goutte de solution traitée.

Laissez la grille incuber pendant 10 minutes pour permettre à la capsule de se fixer à la grille. En fonction de la pureté de la préparation de capside, ajoutez des lavages de la solution de tas sous la forme de gouttelettes de 10 à 15 microlitres placées en ligne après la gouttelette de capside traitée. Après 10 minutes, ramassez la grille avec la gouttelette.

Placez la grille presque perpendiculairement à un morceau de papier filtre pour évacuer la gouttelette. Ensuite, utilisez la grille pour ramasser la gouttelette de tampon de 10 à 15 microlitres et maintenez-la pendant 30 secondes. Après 30 secondes de lavage, évacuez l’humidité avec un autre morceau de papier filtre.

Ensuite, placez une gouttelette de 15 microlitres de solution d’acétate d’uranyle à deux pour cent sur le film de paraffine dans une zone vide. Prenez la gouttelette d’acétate d’uranyle avec la grille et maintenez-la pendant 45 secondes. Ensuite, évacuez l’acétate d’uranyle en vous assurant d’éliminer la majeure partie de la solution.

Placez la grille côté carbone vers le haut sur un morceau de papier filtre en faisant attention à ce que la grille ne colle pas à l’humidité sur la pince à épiler. Ensuite, placez le papier filtre avec la grille dessus dans une boîte de Pétri en verre ouverte. Après avoir répété ce processus pour tous les traitements, placez les moitiés de boîte de Pétri avec les grilles dans un dessiccateur pendant la nuit pour qu’elles sèchent avant d’observer avec TEM.

Le graphique suivant montre la réduction de la capacité de liaison des capsides de norovirus humains au fil du temps lorsqu’elles sont traitées à 68 degrés Celsius. Comme on peut le constater, la liaison HPGA est le premier signal à disparaître complètement. À ce stade, on suppose que la grande majorité des capsides de la solution ont perdu la capacité de se lier aux HPGA de la cellule hôte et ne peuvent donc pas être internalisées dans la cellule.

La liaison en aptamère reflète celle du HBGA, bien qu’un traitement thermique légèrement plus important soit nécessaire pour supprimer le signal. Voici une courbe de coefficient de corrélation DLS représentative de données de bonne qualité. À un temps proche de zéro, le corrélogramme est constant à une valeur proche de un, mais inférieure à un.

Il chute ensuite brusquement à zéro à un moment caractéristique de la taille des particules. Les résultats de taille de cette expérience sont probablement fiables. À l’inverse, cette courbe de coefficient de corrélation est représentative de données de mauvaise qualité.

Le corrélogramme commence à une valeur supérieure à un et tombe progressivement à zéro. Les résultats de cette expérience ne doivent pas être utilisés. Ici, les données sur la taille des particules montrent un profil d’agrégation clair pour les capsides traitées à 68 degrés Celsius, avec des super-agrégats se formant après environ 20 minutes.

Le moment où la super-agrégation se produit est caractéristique de la sensibilité des VLP à ce traitement. Cette figure illustre les résultats de la MET pour le traitement thermique des capsides des norovirus humains. Ici, les capsides étaient traitées à 60 à 80 degrés Celsius de gauche à droite.

Comme on peut le voir, la morphologie des capsides change clairement avec le traitement, car les capsides s’agrègent et se dénaturent. Un phénomène similaire est noté pour les capsides traitées à 68 degrés Celsius pendant zéro à 25 minutes. Une fois maîtrisées, ces techniques peuvent être réalisées en une à 24 heures si elles sont exécutées correctement.

Après son développement, cette technique a fourni une voie supplémentaire aux chercheurs dans le domaine de la virologie alimentaire pour explorer les mécanismes et les effets de l’inactivation sur la capside des norovirus humains. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles qu’une RT-PCR en temps réel avec et sans prétraitement de la RNase, une page STS des capsides virales et des tests de plaque avec des virus de substitution cultivables peuvent être effectuées pour obtenir une vue globale plus complète de la réduction virale après un traitement donné. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la liaison de ligand, la diffusion dynamique de la lumière et la microscopie électronique à transmission pour obtenir des informations mécanistes supplémentaires sur les effets du traitement d’inactivation sur la capside du norovirus humain.

N’oubliez pas que travailler avec certains des réactifs utilisés peut être dangereux et que des précautions telles que le port d’un équipement de protection individuelle et le respect des meilleures pratiques de sécurité en laboratoire doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.