Méthodes alternatives In Vitro pour la détermination de l’intégrité structurale de la capside virale

L'objectif général de ces méthodes est d'approfondir la compréhension des effets du traitement sur l'infectiosité ou l'intégrité de la capside du norovirus humain. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'inactivation des virus non enveloppés, par exemple ce qui advient de la capacité de la capside virale à infecter une cellule après un traitement donné.

Le principal avantage de ces méthodes est qu'elles peuvent fournir des informations mécanistiques supplémentaires sur l'action de tout traitement donné sur le virus. Bien que cette méthode puisse éclairer les stratégies d'inactivation du norovirus humain, elle pourrait également être appliquée à d'autres virus non enveloppés, comme le rhinovirus ou l'hépatite A.

Pour commencer, diluez la protéine majeure de la capside du norovirus humain purifiée, assemblée en capsides, à 50 microgrammes par millilitre dans du tampon salin phosphate 1X. Utilisez un volume maximal de 15 microlitres dans des tubes PCR individuels fermés par un bouchon.

Veillez à ce que le tube contienne au moins 600 nanogrammes de capsides et qu'il y ait 600 nanogrammes de capsides par combinaison de ligand de traitement. Ensuite, préchauffez le thermocycleur à la température souhaitée pour le traitement thermique. Puis, préchauffez un thermocycleur supplémentaire à quatre degrés Celsius pour un refroidissement immédiat.

Ajouter les tubes contenant la solution de capsides au thermocycleur pendant la durée souhaitée. Après chauffage, transférer immédiatement les tubes vers le thermocycleur prérefroidi à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Faire une courte centrifugation des tubes afin de ramener toutes les gouttelettes au fond du tube.

Diluez les solutions d'encapsidés traitées et le PBS à trois microgrammes par millilitre. Assurez-vous qu'il y ait au moins 200 microlitres de solution d'encapsidé traité diluée. Ensuite, appliquez 100 microlitres de solution d'encapsidé dans chaque puits, en veillant à ce qu'il y ait au moins deux puits par traitement. En outre, incluez deux puits témoins contenant chacun 100 microlitres de PBS pour chaque ligand. Ceci permet d'obtenir l'absorbance de fond du dosage. Couvrez la plaque avec un couvercle et scellez les bords avec du film de paraffine afin de réduire l'évaporation. Laissez la plaque toute la nuit dans un incubateur agité à quatre degrés Celsius ou pendant deux heures à température ambiante.

Après l'incubation, retirez les solutions de capsides traitées de la plaque. Ensuite, ajoutez 200 microlitres par puits de tampon de blocage. Incubez pendant deux heures à température ambiante ou scellez et incubez à quatre degrés Celsius toute la nuit.

Entre-temps, diluez l'aptamère biotinylé à une concentration d'un micromolaire dans de l'eau sans nucléase. Veillez à disposer d'une quantité suffisante de solution pour un volume total de 200 microlitres par traitement.

En outre, diluez l'HPGA biotinylée choisie à 30 microlitres par millilitre dans le tampon de blocage. Veillez à nouveau à disposer d'une quantité suffisante de solution pour un volume total de 200 microlitres par traitement.

Après l'incubation, retirez le tampon de blocage et lavez la plaque trois fois avec 200 microlitres par puits de PBST. Tamponnez la plaque retournée sur des essuie-tout stériles pour sécher l'humidité résiduelle. Ensuite, ajoutez 100 microlitres par puits des solutions de liaison du ligand, en veillant à ce qu'il y ait deux puits par combinaison ligand-traitement thermique, puis incubez la plaque couverte sur un agitateur orbital à environ 60 tr/min pendant une heure à température ambiante.

Après avoir lavé les puits comme décrit dans le protocole en texte, ajouter 100 microlitres par puits de streptavidine peroxydase de raifort à 0,2 microgramme par millilitre dans le tampon PBS.

Incuber pendant 15 minutes à température ambiante avec agitation douce sur un agitateur orbital avant de laver à nouveau les puits. Ensuite, après un autre lavage, ajouter 100 microlitres par puits de substrat TMB et laisser développer la couleur pendant cinq à 15 minutes. Observer les puits pour détecter la présence de couleur.

Veillez à développer de manière constante pendant la même durée entre les plaques réplicats et soyez attentif à la gamme d'absorbance du lecteur de plaques utilisé. Arrêtez le développement de la réaction avec 100 microlitres par puits d'acide phosphorique un molaire. Lisez immédiatement la plaque à 450 nanomètres.

Créez une nouvelle procédure opérationnelle normalisée pour la taille dans le logiciel de l'instrument DLS, comme décrit dans le protocole textuel. Ensuite, sélectionnez la flèche verte de démarrage dans le logiciel et nommez l'échantillon.

Diluez les particules pseudo-virales ou VLP traitées thermiquement d’un facteur de un à dix dans du PBS 1X pour obtenir une concentration finale de cinq microgrammes par millilitre. Ensuite, filtrez l’échantillon à l’aide d’un filtre de 1 micron de taille de pore afin d’éliminer les particules de poussière. La DLS est très sensible à la poussière, car les grandes particules diffusent beaucoup plus de lumière que les petites particules. Transférez 50 microlitres des VLP diluées dans une cuvette jetable de petit volume. Insérez la cuvette dans la chambre d’échantillonnage de l’appareil. Lancez l’analyse et utilisez les onglets d’ajustement cumulant du corrélogramme et de conseils d’expert pour évaluer la qualité des données. Pendant l’analyse, vérifiez que la valeur de l’indice de polydispersité est inférieure à 0,3, ce qui indique une mesure de qualité.

Dans l'onglet Multivue, vérifiez que le coefficient de corrélation est constant et proche de un, sans dépasser cette valeur, à court terme, puis chute nettement jusqu'à zéro à un moment ultérieur, ce qui est caractéristique de la taille des particules. Utilisez l'onglet Conseils d'expert pour obtenir des retours sur la qualité des données pendant les mesures. Une fois la mesure terminée, vérifiez à nouveau que l'indice de polydispersité a une valeur inférieure à 0,3.

Vérifiez que la ligne d'ajustement des cumulants suit étroitement les points de données dans l'onglet d'ajustement des cumulants. Créez une nouvelle procédure opératoire normalisée de taille dans le logiciel de l'instrument DLS, comme décrit dans le protocole textuel. Sélectionnez la flèche de démarrage dans le logiciel pour ouvrir et nommer un nouvel échantillon, puis laissez l'instrument atteindre l'équilibre thermique.

Transférez la suspension de particules pseudovirales (VLP) dans une cuvette en quartz de petit volume en évitant les bulles et en pipetant lentement contre la paroi de la cuvette. Une fois que l'appareil a atteint l'équilibre thermique, insérez la cuvette dans la chambre d'échantillonnage. Après avoir attendu 10 secondes pour que la température de l'échantillon s'équilibre, démarrez l'analyse et lancez simultanément un chronomètre.

Arrêtez le chronomètre à la fin de la première mesure. Prenez cette durée comme premier point temporel. Obtenez les points temporels suivants à partir des temps de mesure enregistrés par le logiciel.

Réalisez le traitement thermique comme précédemment, sauf que vous remplacerez le PBS par du HEPES 10 millimolaire, pH 7,4, et ne diluez pas davantage les capsides après le traitement. Ensuite, pipetez la totalité de la goutte de 15 microlitres de solution de capsides traitée sur un film de paraffine. Saisissez le bord de la grille avec des pinces en laissant les branches se refermer sur le bord pour maintenir la grille, puis placez la grille côté carbone vers le bas au-dessus de la goutte de solution traitée.

Laisser la grille incuber pendant 10 minutes afin que la capside s'attache à la grille. Selon la pureté de la préparation des capsides, effectuer des lavages avec la solution de HEPES sous forme de gouttelettes de 10 à 15 microlitres placées en ligne après la gouttelette de capsides traitée. Après 10 minutes, prélever la grille avec la gouttelette.

Placer la grille presque perpendiculairement à un morceau de papier filtre afin d'absorber la goutte. Ensuite, utiliser la grille pour prélever une goutte de 10 à 15 microlitres de tampon HEPES et la maintenir pendant 30 secondes. Après 30 secondes de temps de lavage, absorber la goutte avec un autre morceau de papier filtre.

Ensuite, déposez une goutte de 15 microlitres de solution d'acétate d'uranyle à deux pour cent sur le film de paraffine dans une zone vide. Prélevez la goutte d'acétate d'uranyle à l'aide de la grille et laissez agir pendant 45 secondes. Puis, absorbez l'acétate d'uranyle en veillant à éliminer la majeure partie de la solution.

Placer la grille avec le côté carbone vers le haut sur un morceau de papier filtre en prenant soin que la grille n'adhère pas à l'humidité des pinces. Ensuite, placer le papier filtre avec la grille dessus dans une boîte de Pétri en verre ouverte. Après avoir répété ce processus pour tous les traitements, placer les demi-boîtes de Pétri contenant les grilles dans un dessiccateur pendant la nuit pour les sécher avant l'observation au MET.

Le graphique suivant illustre la réduction de la capacité de liaison des capsides du norovirus humain au fil du temps lorsqu'elles sont traitées à 68 degrés Celsius. Comme on peut le voir, la liaison à l'HPGA est le premier signal à disparaître complètement. À ce stade, on suppose que la grande majorité des capsides en solution ont perdu leur capacité à se lier aux HPGA des cellules hôtes et ne peuvent donc pas être internalisées dans la cellule.

La liaison de l'aptamère est similaire à celle des HBGA, bien qu'une légère augmentation du traitement thermique soit nécessaire pour éliminer le signal. On voit ici une courbe de coefficient de corrélation DLS représentative de données de bonne qualité. À un instant proche de zéro, le correlogramme est constant à une valeur proche de un, mais inférieure à un.

Ensuite, elle chute brusquement à zéro à un moment caractéristique de la taille des particules. Les résultats de taille issus de cette expérience peuvent probablement être considérés comme fiables. En revanche, cette courbe du coefficient de corrélation est représentative de données de mauvaise qualité.

Le corrélogramme démarre à une valeur supérieure à un et diminue progressivement jusqu'à zéro. Les résultats de cette expérience ne doivent pas être utilisés. Ici, les données de taille des particules montrent un profil d'agrégation net pour les capsides traitées à 68 degrés Celsius, avec la formation d'agrégats supérieurs après environ 20 minutes.

Le moment auquel se produit la super agrégation est caractéristique de la sensibilité des particules pseudovirales (VLPs) à ce traitement. Cette figure illustre les résultats de microscopie électronique en transmission (TEM) concernant le traitement thermique des capsides du norovirus humain. Ici, les capsides ont été traitées à des températures allant de 60 à 80 degrés Celsius, de gauche à droite.

On peut observer que la morphologie de la capside change nettement après traitement, les capsides s'agrégeant et se dénaturant. Un phénomène similaire est observé pour les capsides traitées à 68 degrés Celsius pendant une durée de zéro à 25 minutes.

Une fois maîtrisées, ces techniques peuvent être réalisées en une à 24 heures si elles sont effectuées correctement.

Depuis son développement, cette technique a offert une nouvelle piste aux chercheurs du domaine de la virologie alimentaire pour explorer les mécanismes et les effets d'inactivation sur la capside des norovirus humains. Après cette procédure, d'autres méthodes telles qu'une RT-PCR en temps réel avec ou sans prétraitement à la RNase, une électrophorèse SDS-PAGE des capsides virales et des essais de plaques avec des virus indicateurs cultivables peuvent être réalisées afin d'obtenir une vue d'ensemble plus complète de la réduction virale après un traitement donné. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser la liaison de ligands, la diffusion dynamique de la lumière et la microscopie électronique en transmission pour approfondir les connaissances mécanistiques sur les effets d'un traitement d'inactivation sur la capside du norovirus humain.

N'oubliez pas que l'utilisation de certains réactifs peut présenter des dangers, et que des précautions telles que le port d'équipements de protection individuelle et le respect des meilleures pratiques de sécurité en laboratoire doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.