Une méthode pratique pour l’Extraction et analyse par chromatographie liquide à haute pression des neurotransmetteurs catécholamines et de leurs métabolites

L’objectif global de cette procédure est de déterminer simultanément trois neurotransmetteurs monoamines et deux de leurs métabolites dans l’urine du nourrisson via une extraction en phase solide pratique couplée à une chromatographie liquide à haute pression avec détection électrochimique. Cette méthode permet de prédire et de déterminer les composés cibles instables dans un échantillon complet avec une utilisation facile en peu de temps. Vos exemples peuvent être facilement pré-nettoyés par un quorum étroit de faces solides remplies de fibres, et les analytes de l’échantillon peuvent être facilement enrichis, dissous et détectés sur un système de détection électrochimique.

Nous avons eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons réalisé que l’extraction et l’analyse des neurotransmetteurs de catécholamines dans les fluides biologiques sont essentielles pour évaluer la fonction de résistance et les maladies associées. Les personnes novices dans cette méthode auront du mal car l’exposition à la lumière doit être évitée et le temps de prétraitement doit être aussi court que possible. Pour faire la démonstration de la procédure, nous avons Lanlan Wei et Qing Han, deux doctorants de notre laboratoire.

Pour commencer, préparez deux milligrammes par millilitre de solution mère de DPBA en dissolvant deux milligrammes du composé dans un millilitre d’eau distillée. Conservez la solution dans l’obscurité à quatre degrés Celsius. Lors de la préparation des extenseurs d’analytes, gardez à l’esprit que la structure chimique et les propriétés des catécholamines sont instables, et comme elles se décomposent facilement, le processus de préparation des diluants doit être très rapide et l’exposition à la lumière du soleil doit être évitée.

Pesez 1,0 milligramme de noradrénaline, d’épinéphrine, de dopamine, de MHPG, de DOPAC et de DHBA standard interne dans des tubes de microcentrifugation séparés de 1,5 millilitre. Ajoutez 1,0 millilitre d’eau distillée pour dissoudre chacun des composés, à l’exception de l’épinéphrine, qui doit être dissoute dans une solution d’acide chlorhydrique à 0,01 moles-par-litre. Faites osciller les étalons préparés dans l’obscurité à grande vitesse jusqu’à ce que les analytes se dissolvent complètement.

Il s’agit des stocks primaires qui peuvent être stockés à moins 20 degrés Celsius pendant plusieurs semaines. Pour préparer les stocks d’analytes secondaires de noradrénaline, d’épinéphrine, de dopamine, de DOPAC et de MHPG, transférez cinq microlitres de chaque stock d’analyte primaire dans 4 975 microlitres d’eau distillée dans des tubes à centrifuger séparés de cinq millilitres. Préparez ces solutions fraîches tous les jours et conservez-les dans l’obscurité à quatre degrés Celsius jusqu’à utilisation.

Pour le DHBA, transférez cinq microlitres de stock primaire dans 4 995 microlitres d’eau distillée dans un tube à centrifuger de cinq millilitres, et stockez-le dans l’obscurité séparément à quatre degrés Celsius. Faites d’autres dilutions avec le stock d’analyte secondaire pour créer une courbe standard. Conservez les solutions dans l’obscurité à quatre degrés Celsius et préparez-les fraîches tous les jours.

Ensuite, testez la tension optimale du détecteur ECD, en utilisant le stock standard avec la concentration appropriée. Variez la tension pour trouver une valeur où les analytes ont la meilleure apparence de pic. Pour préparer 10 millilitres de solvant éluant, utilisez 5,5 millilitres d’eau distillée, puis ajoutez 1,5 millilitre d’acétonitrile et trois millilitres d’acide phosphorique, goutte à goutte, dans l’eau.

Pour préparer la phase mobile, mesurez les composants énumérés dans le protocole textuel dans une bouteille propre d’un litre. Ajoutez 40 millilitres d’acétonitrile et d’eau distillée à 1 000 millilitres. Agitez et vibrez par ultrasons pendant 15 minutes jusqu’à ce que la matière contenue dans la solution soit entièrement dissoute.

À l’aide d’un pH-mètre avec une électrode en verre, ajustez la valeur du pH de la phase mobile à 4,21 avec une solution saturée d’hydroxyde de sodium. Filtrez la phase mobile à l’aide d’une membrane microporeuse en polyfluorure de vinylidène de 0,45 micron et d’un dispositif d’aspiration sous vide pour éliminer les impuretés. Utilisez des vibrations ultrasoniques pendant 15 minutes pour dégazer la phase mobile à chaque fois avant utilisation.

Ensuite, vortex et centrifuger les échantillons urinaires à 1 510 fois G pendant 10 minutes à température ambiante pour éliminer la plupart des interférences particulaires. Rassemblez les surnageants et jetez les sédiments pour d’autres expériences. Pour extraire efficacement les analytes, procédez à l’extraction en phase solide à fibres garnies, ou prétraitement PFSPE, immédiatement après la centrifugation.

Pour activer les nanofibres, pressez 100 microlitres de méthanol et 100 microlitres d’eau séquentiellement à travers la colonne PFSPE à l’aide d’une seringue de cinq millilitres de manière lente et goutte à goutte. L’échantillon d’urine doit être mélangé à une solution de DPPA pour améliorer son hydrophobie et aider les catécholamines et les métabolites à être absorbés par les fibres. Une solution DHBA doit également être ajoutée en tant qu’étalon interne.

Mélangez 100 microlitres d’échantillon d’urine avec 100 microlitres de solution DPBA de deux milligrammes par millilitre et 30 microlitres de 100 nanogrammes par millilitre de solution étalon interne de DHBA dans un tube Eppendorf de 0,5 millilitre. Ensuite, pressez la solution d’échantillon mixte à travers la colonne PFSPE avec une seringue en plastique de type gaz de cinq millilitres en utilisant la force de la pression de l’air. Lixiviez la colonne trois fois à l’aide d’une seringue en plastique de type gaz de cinq millilitres pour charger 100 microlitres de la solution DPBA dans la colonne SPE, et poussez lentement la solution à travers la cartouche avec une pression d’air.

Cette étape de rinçage est nécessaire car la solution DPBA peut éliminer les impuretés tandis que les analytes sont conservés, améliorant ainsi la sensibilité et la sélectivité des analytes. Ensuite, chargez 50 microlitres de l’éluant sur la colonne PFSPE et poussez-le à travers la colonne, en recueillant l’éluat avec un tube Eppendorf de 0,5 millilitre. Allumez le dégazeur HPLC pour dégazer l’air dans le système.

Avant l’analyse des échantillons, le système doit fonctionner pendant plus de 0,5 heure avec la phase mobile pour équilibrer et réduire le bruit de base. Prélevez 20 microlitres de l’éluat à l’aide d’un échantillonneur automatique, puis injectez-le dans le système ECD HPLC. Une fois les cycles terminés, éteignez la cellule du détecteur à l’aide de l’interface du détecteur.

N’éteignez pas la pile avec l’interrupteur à l’arrière du détecteur, car cela pourrait endommager l’instrument. Modifiez manuellement la composition de la phase mobile à 10 % de méthanol et 90 % d’eau. Après avoir fonctionné pendant au moins 30 minutes, changez manuellement la phase mobile en méthanol de qualité HPLC.

Faites fonctionner le système pendant environ 15 minutes pour le protéger dans du méthanol. Le fait de ne pas exécuter cette étape après le temps de fonctionnement recommandé peut endommager la colonne et le détecteur. Coupez le débit, puis éteignez le dégazeur.

Procéder à l’analyse des catécholamines comme décrit dans le protocole textuel. Le chromatogramme d’un échantillon d’eau enrichie avec les cibles et l’étalon interne est montré sans extraction. Dans les conditions HPLC du protocole, les cinq pics cibles de la méthode PFSPE sont bien séparés et significativement plus élevés que ceux extraits par une cartouche d’acide phénylboronique commerciale.

De plus, le pic DOPAC n’apparaissait pas dans le résultat d’extraction de la cartouche PBA, ce qui indique que la colonne PBA n’était pas capable d’extraire DOPAC. Lorsque l’échantillon d’urine a été extrait, la méthode PFSPE a non seulement pu extraire les cibles avec une bonne identification des pics, mais a également pu se débarrasser de la plupart des interférences dans l’urine. Des courbes d’étalonnage ont été construites pour chaque composé en traçant le rapport entre l’aire du pic, montrant une bonne linéarité avec une faible concentration.

Pour validation avec des échantillons d’urine réels, les échantillons urinaires de 28 nourrissons à haut risque et de 22 nourrissons en bonne santé ont été analysés. Bien que certaines catécholamines n’aient pas été significativement différentes entre les groupes à haut risque et les groupes sains, les nourrissons à haut risque présentaient des quantités plus élevées du métabolite MHPG que le groupe témoin. Par conséquent, le taux de MHPG urinaire peut être un marqueur potentiel pour l’identification précoce des nourrissons à haut risque.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques minutes. Lors de la tentative de la procédure, il est important de se rappeler de préparer les cendres fraîches, de s’inquiéter rapidement et d’éviter l’exposition à la lumière directe du soleil. L’ajout d’une solution d’acide diphénylborate dans les étapes d’absorption et de rinçage est également essentiel.

À la suite de cette procédure, mesure l’absence de terminaison des catécholamines et des métabolites dans le plasma ou le liquide céphalo-rachidien. Alsliver peut être effectué afin de déterminer l’universalité de ce protocole dans le test des autres fluides biologiques. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour étudier la relation entre les déficits neurodéveloppementaux et le niveau de catécholamines urinaires dans des échantillons d’enfants.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer la méthode d’extraction en phase solide avec des figures nair et un appareil simple, le PCE PS air fibules d’entreprise DPBA peut aider à nettoyer les neurotransmetteurs catécholamines dans les échantillons d’urine. Cette technique s’étend au diagnostic précoce du cassis à risque de lésions cérébrales chez les nourrissons. Parce que l’analyse comparative a révélé des différences anormales dans le MHPG unaire des enfants autistes, indiquant que les métabolites catécholamines pourraient être un marqueur candidat important.