Analyse quantitative Immunofluorescence entier-montent des Populations de progéniteurs cardiaques chez des embryons de souris

L’objectif global de cette méthode est d’évaluer quantitativement la localisation et la distribution des cellules progénitrices cardiaques au cours de l’organogenèse cardiaque. Cette méthode peut aider à répondre à des réponses clés dans le domaine du développement cardiaque en nous permettant d’observer la localisation des populations de progéniteurs cardiaques au cours du développement embryonnaire normal. Les principaux avantages de cette technique sont que l’imagerie volumétrique peut fournir des informations quantitatives sur la dynamique au niveau des tissus et que le pipeline d’analyse peut être automatisé pour une meilleure reproductibilité.

Bien que cette méthode fournisse des informations sur l’organogenèse cardiaque précoce, elle peut également être appliquée à l’étude générale de l’embryogenèse précoce ou à la morphogenèse d’autres organes d’intérêt. Le matin du huitième jour embryonnaire, désinfectez l’abdomen de la souris enceinte avec de l’éthanol à 70 % et faites une incision abdominale à travers la peau et la paroi du corps. En commençant au-dessus d’un oviducte, disséquez soigneusement la graisse le long du côté de l’utérus jusqu’au col de l’utérus.

Faites une incision à travers le col de l’utérus et continuez jusqu’à l’extrémité supérieure de l’autre coupe de l’oviducte pour libérer tout l’utérus. Lavez l’excès de sang de l’utérus dans une boîte de 10 centimètres contenant du PBS frais et coupez le mésomètre entre chaque déciduome. Transférez les embryons dans une boîte de six centimètres contenant du PBS frais sous un microscope de dissection et utilisez des pinces fines numéro cinq pour retirer le tissu utérin du tissu décidual.

Ensuite, coupez soigneusement l’extrémité de la moitié embryonnaire du déciduom pour révéler les embryons, en pinçant le déciduom pour pousser et retirer soigneusement le premier embryon. Disséquez autant de tissu embryonnaire supplémentaire que possible sans endommager la morphologie de l’animal et utilisez une pipette de transfert pour placer l’embryon dans un tube de 1,5 millilitre contenant du PBS frais sur de la glace. Lorsque tous les embryons ont été récoltés, aspirez le PBS de chaque tube et rincez les embryons avec du PBS frais.

Après avoir soigneusement aspiré le PBS de chaque tube, fixez les embryons dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant une heure à température ambiante, suivie de trois lavages avec du PBS frais, puis conservez les embryons à quatre degrés Celsius. Commencez par remplacer le PBS par un millilitre de tampon de blocage pour une incubation de quatre heures à température ambiante. À la fin de l’incubation, remplacer le tampon de blocage par le mélange d’anticorps primaires approprié et le tampon de blocage dilué pour une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius.

Le lendemain matin, aspirez l’excès d’anticorps et lavez les embryons trois fois pendant une heure par lavage dans 0,1 % Triton dans PBS. Après le troisième lavage, ajoutez le mélange d’anticorps secondaires approprié aux embryons pour une incubation de trois heures à température ambiante, suivie de trois lavages comme cela vient d’être démontré. Ensuite, contre-colorez les embryons avec du DAPI dans du PBS pendant 10 minutes, suivi de deux lavages de cinq minutes, puis suspendez lentement les embryons dans un milieu de montage anti-décoloration permettant aux embryons de s’équilibrer pendant au moins une heure avec des effleurements doux périodiques pour aider les échantillons à tomber dans la solution.

Avant de monter les embryons, faites deux piles parallèles de cinq à six couches de ruban adhésif double à 15 à 20 millimètres de distance sur une lame de microscope par embryon et placez une goutte de 15 microlitres de milieu anti-décoloration sur chaque lame entre les piles de ruban. Transférez soigneusement un embryon dans chaque goutte et utilisez un microscope de dissection et une pince fine pour positionner les embryons avec leurs côtés antérieurs tournés vers l’opposé de la lame et avec l’axe de leur corps aligné avec l’axe long des lames. Pour placer les lamelles, posez d’abord un côté du verre sur une pile de ruban adhésif double et utilisez une pince pour abaisser doucement la lamelle jusqu’à ce qu’elle entre en contact avec l’autre pile de bande.

Il est particulièrement important de positionner et de monter soigneusement les embryons. Les embryons qui ne sont pas positionnés correctement seront beaucoup plus difficiles à imager et peuvent nécessiter un traitement supplémentaire pour obtenir de bonnes données quantifiables. À l’aide d’une pipette, ajoutez un produit anti-décoloration supplémentaire entre la lame et la lamelle afin d’empêcher l’échantillon de se dessécher pendant l’imagerie, et sélectionnez l’objectif de grossissement le plus élevé disponible qui permet de capturer toute la région du croissant cardiaque dans un seul champ de vision.

Ensuite, configurez les paramètres d’imagerie à l’aide des meilleures pratiques d’imagerie standard et utilisez les taux d’échantillonnage de Nyquist pour déterminer les dimensions du voxel XYZ de chaque embryon. Pour analyser les images d’embryons, chargez les ensembles de données d’images brutes dans le logiciel d’analyse d’images approprié et ouvrez le premier fichier dans la vue surpass. Les données seront chargées dans une vue 3D en mode de projection d’intensité maximale.

Ouvrez la fenêtre de réglage de l’affichage et sélectionnez uniquement le canal de référence. Ajustez le seuil de l’image si nécessaire. Si le rapport signal/bruit est trop faible pour la segmentation, ajustez le gamma.

Le respect des meilleures pratiques lors de l’acquisition d’images est essentiel pour obtenir des données appropriées et dépendra de la configuration de microscopie spécifique utilisée. Si des ajustements du gamma sont nécessaires, ces images ne doivent pas être utilisées pour comparer les intensités de fluorescence. Utilisez la boîte de dialogue de l’algorithme de surface pour créer une nouvelle surface pour le canal de référence et cochez la case Origine du segment uniquement qui vous intéresse.

Ajustez la région du cadre de sélection de sorte qu’elle contienne la région d’intérêt délimitée par la tache de référence et sélectionnez le canal de référence dans le menu déroulant du canal source. Réglez le lissage sur la moitié de la taille du voxel Z et utilisez les curseurs de seuil pour ajuster la limite inférieure à son intensité absolue afin de vous assurer que la surface ne s’étend pas au-delà du signal du canal. Filtrez les objets par numéro de voxel ou par volume, en rejetant tous les objets d’arrière-plan que l’algorithme aurait pu générer, puis terminez l’algorithme.

Ensuite, sélectionnez la surface nouvellement créée et choisissez la fonction de jeu de masques dans la fenêtre d’édition. Sélectionnez le canal expérimental qui vous intéresse en veillant à ce que la case Dupliquer le canal avant l’application du masque soit cochée et sélectionnez le canal de masque uniquement dans la fenêtre de réglage de l’affichage. Créez ensuite une nouvelle surface comme nous venons de le démontrer.

Pour obtenir les données volumétriques avec chaque surface sélectionnée, ouvrez le sous-onglet de détail dans l’onglet statistiques et sélectionnez les valeurs moyennes dans le menu déroulant. Le volume total de la surface se trouve dans la colonne somme de la table générée. Ici, un embryon embryonnaire de souris du jour 8,25 avec des cellules progénitrices cardiovasculaires ventriculaires positives à la GFP marquées avec un anticorps anti-croissant cardiaque, comme cela vient d’être démontré, est présenté.

Après avoir sélectionné le canal de référence pour le tissu coloré, l’intensité et le gamma sont ajustés avant de lancer l’algorithme de création de surfaces. La région d’intérêt est sélectionnée et le niveau de détail de la surface est choisi. La surface initiale est seuillée pour inclure tous les signaux réels de la surface.

Un filtrage est ensuite effectué pour supprimer les petits fragments d’arrière-plan afin d’obtenir une surface de référence finale. En sélectionnant la surface de référence, le canal de comparaison peut être dupliqué et masqué. L’intensité et le gamma de ce canal sont ajustés avant de générer une seconde surface par la même séquence d’étapes.

Le volume total de chaque surface est ensuite calculé automatiquement et peut être comparé à la fois quantitativement et visuellement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que la qualité des embryons disséqués, l’efficacité des anticorps, l’orientation du montage et la configuration de l’imagerie affectent toutes la qualité des données finales. En plus de ce pipeline d’analyse quantitative, d’autres méthodes telles que la déconvolution peuvent être effectuées pour produire des données qualitatives supplémentaires.

Après son développement, cette technologie a ouvert la voie aux chercheurs en développement cardiaque pour explorer la dynamique de nouvelles populations de progéniteurs cardiaques au cours de l’embryogenèse précoce.