Name: Grippe neutralisante d’anticorps aux virus a (H3N2) dans le sérum humain par micro-neutralisation de mesure des analyses utilisant des cellules de MDCK-SIAT1 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Découvrez la micro-neutralisation pour mesurer les anticorps neutralisants contre le virus H3N2 dans le sérum humain en utilisant des cellules MDCK-SIAT1. Cette méthode évalue efficacement l'immunité vaccinale.

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Nous remercions le Dr Xiuhua Lu, Dr Feng Liu et Mme Ashley Burroughs de la Division grippe des CDC pour leur examen critique et l’assistance dans la préparation de ce manuscrit. Nous remercions le Dr Adrian Reber de Division de la grippe des CDC pour son aide dans la préparation du graphique de la Figure 3. Enfin, nous remercions le Dr M. Matrosovich, Marburg, Allemagne pour fournir les cellules MDCK-SIAT1.

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</ol>

Les auteurs ne rapportent aucun conflit d’intérêts. Les constatations et conclusions dans la présente publication sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les vues des Centers for Disease Control and Prevention et l’organisme de financement.

Le dosage de MN est l’un des dosages du principales utilisés pour une sérologie de la grippe pour détecter les réponses en anticorps après infection de la grippe ou la vaccination. Titres générés à partir des essais de MN sont souvent utilisés comme le principal résultat de nombreuses études séroépidémiologie de grippe. Tests de MN sont aussi couramment pour séro-diagnostic et l’évaluation de l’immunogénicité du vaccin. International inter-lab a été étudié afin de comparer les analyses de MN exécutées dans plusieurs labo...

Virus de la grippe continuent à cause de morbidité et mortalité chez l’homme chaque année. HA est la glycoprotéine de surface importante des virus grippaux. Les anticorps neutralisants ciblant HA constituent le principal mécanisme immunitaire qui est en corrélation avec la protection de l’influenza infection1,2. Tests d’hemagglutination inhibition (HI) et MN essais sont deux méthodes largement utilisés pour mesurer la production d’anticorps dans le sérum humain après grippe infection ou la vaccination3. Le test HI mesure inhibition des anticorps d’hémagglutination virus des globules rouges et est considéré comme un test de substitution. Contrairement à HI, le dosage de MN peut mesurer directement le taux d’anticorps dans le sérum humain qui neutralisent l’infection grippale dans des cultures cellulaires. Des cellules de MDCK sont souvent utilisés dans l’isolement du virus grippal et MN essais4.
Virus de l’influenza subissent constamment la dérive antigénique et Maj, acquérir des mutations sur les protéines HA pouvant modifier la spécificité de liaison du récepteur du virus. Depuis 2014, nouveaux groupes de virus a (H3N2) ont émergé et ont continué à circuler jusqu'à la saison en cours. La majorité de ces virus appartiennent au groupe génétique 3C.2a et 3C.3a, basée sur l’analyse phylogénétique des protéines HA. Beaucoup de virus circulants 3C.2a avaient réduit la capacité de résultats des globules rouges et donc ne peuvent être qualifiées de HI essais sur5. Tests de neutralisation doivent être utilisés pour mesurer la production d’anticorps à ces virus que résultats pas6. En outre, des études ont montré que ces virus a (H3N2) contemporains ont modifié les propriétés de liaison du récepteur par rapport aux précédents virus a (H3N2) et ont tendance à accumuler les mutations de la culture adaptée et polymorphisme lorsque repiquées dans in vitro de cellules cultures7,8,9. Par rapport aux traditionnelles cellules MDCK, MDCK-SIAT1 est une lignée cellulaire développée par Matrosovich et al. par le biais de transfection stable des cellules MDCK avec l’ADNc de α2 humaine, 6-sialtransferase (SIAT1). Cette lignée cellulaire exprime des quantités accrues de α2, fractions 6-sialique galactose et une diminution de α2, les moitiés acides sialique-3 que le parent de cellules MDCK10. Des cellules de MDCK-SIAT1 ont montré pour améliorer les taux de l’isolement des virus a (H3N2) par rapport à des cellules MDCK11. Récemment, Lin et al. a signalé que pour nouvellement écloses 3C.2a et 3C.3a humaine a (H3N2) virus de l’influenza, les réplications de virus plus fidèles et meilleure infectiosité du virus ont été atteints lorsque les virus ont été cultivées dans des lignées de cellules de MDCK-SIAT1 comparées à celle des cellules MDCK7. Ainsi, les cellules de MDCK-SIAT1 conviennent mieux dans MN essais pour caractériser les réponses anticorps aux clusters récentes du virus a (H3N2).
Nous décrivons ici un essai de MN en utilisant des cellules de MDCK-SIAT1 pour mesurer les réponses immunitaires à 3C.2a contemporaines et le virus a (H3N2) 3C.3a dans le sérum humain. Virus cultivés dans des oeufs ou des cellules peuvent être utilisés dans cet essai. Sérum de chaleur inactivé contenant les anticorps neutralisants est tout d’abord dilués en série, puis incubées avec 100 TCID50/bien des virus de la grippe a (H3N2) pour permettre des anticorps à lier le virus vaccinal. Des cellules de MDCK-SIAT1 sont ensuite ajoutées au mélange des anticorps du virus et incubés pendant 18 à 20 h à 37 ° C, 5 % de CO2 à permettent au virus a (H3N2) infecter des cellules de MDCK-SIAT1 et reproduire. Après une nuit d’incubation, les plaques sont fixées et la quantité de virus dans chaque puits est quantifiée par une technique ELISA utilisant des anticorps monoclonaux contre la grippe A NP. La détection du NP indique la présence d’infection par le virus et l’absence d’anticorps neutralisants. Titre d’anticorps de neutralisation est définie comme l’inverse de la plus forte dilution de sérum qui fournit ≥ 50 % d’inhibition de l’infectiosité du virus.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Milieu Eagle modifié (DMEM) avec une teneur élevée en glucose</td><td>Life Science</td><td>11965</td><td>Un composant essentiel de la culture cellulaire stérile, de la propagation du virus et du milieu diluant</td></tr> viral <tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA) Fraction V, Protase Free</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3117332001</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Science</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Life Science</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin G-418 disulfate sel&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1720-5G&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Science</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Life Science</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>VWR</td><td>67-64-1</td><td>Utilisé à une concentration de 80</td></tr> % <tr><td>Tampon phosphate-citrate avec perborate de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBF2806V</td><td></td></tr><tr><td>O-Phénylènediamine Dichlorhydrate</td><td>comprimé Sigma-Aldrich</td><td>SLBQ1086V</td><td>1 comprimé pour 100 ml d’eau de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Acide sulfurique</td><td>Fisher Scientific</td><td>A510-P500</td><td>Utilisé 0,5 M de concentration finale</td></tr><tr><td>Éthanol, dénaturé, 4L</td><td>VWR</td><td>EM-AX0422-3</td><td>Utilisé à une concentration de 70 %</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Sciences de la vie</td><td></td><td></td>1748048</tr><tr><td>RDE II « Seiken"</td><td>Denka Seiken</td><td>370013</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NP souris monoclonale Ab</td><td>Millipore pool</td><td>MAB 8257 MAB 8258</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris IgG HRP&nbsp ;</td><td>KPL</td><td>074-1802</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à fond plat 96 puits</td><td>Thermo Scientific</td><td>3455</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de plaques</td><td>Dispositif moléculaire</td><td>Spectromax 384 plus</td><td></td></tr><tr><td>Flacon de culture cellulaire 162 cm2/Capuchon d’aération</td><td>Corning/VWR</td><td>3151</td><td></td></tr></tbody></table>

grippe neutralisante d’anticorps aux virus a (h3n2) dans le sérum humain par micro-neutralisation de mesure des analyses utilisant des cellules de mdck-siat1

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Des anticorps neutralisants dirigés contre l’hémagglutinine (HA) des virus grippaux sont considérés comme le principal mécanisme immunitaire qui est en corrélation avec la protection pour les infections grippales. Tests de micro-neutralisation (MN) sont souvent utilisés pour mesurer la production d’anticorps neutralisants dans des sérums humains après vaccination contre la grippe ou une infection. Les cellules de Madine Darby Canine Kidney (MDCK) sont le substrat de la cellule utilisée couramment pour des dosages de MN. Toutefois, 3C.2a et 3C.3a la grippe a (H3N2) ont acquis des virus actuellement en circulation modifiée spécificité de liaison du récepteur. La lignée de cellules de MDCK-SIAT1 avec portions accrue α-2,6 sialique galactose sur la surface s’est avéré d’infectiosité améliorée et réplications plus fidèles que les cellules MDCK conventionnelles prévoient ces virus a (H3N2) contemporains. Nous décrivons ici un essai de MN en utilisant des cellules de MDCK-SIAT1 qui a été optimisé afin de quantifier les titres d’anticorps neutralisants de ces virus a (H3N2) contemporains. Dans ce protocole, sérums de chaleur inactivé contenant les anticorps neutralisants sont tout d’abord dilués en série, puis incubées avec 100 TCID50/bien des virus de la grippe a (H3N2) pour permettre des anticorps dans le sérum pour lier aux virus. Des cellules de MDCK-SIAT1 sont ensuite ajoutées au mélange des anticorps du virus et incubés pendant 18 à 20 h à 37 ° C, 5 % de CO2 pour permettre à des virus a (H3N2) d’infecter des cellules de MDCK-SIAT1. Après une nuit d’incubation, les plaques sont fixées et la quantité de virus dans chaque bien est quantifiée par un dosage immuno-enzymatique (ELISA) à l’aide contre la grippe une nucléoprotéine (NP) des anticorps monoclonaux. Titre d’anticorps de neutralisation est définie comme l’inverse de la plus forte dilution de sérum qui fournit ≥50 % d’inhibition de l’infectiosité du virus.

Détermination de l’infectiosité des stocks de virus est la première étape de l’analyse de MN. La figure 2 illustre le schéma pour déterminer la TCID50 des stocks de virus. Pour les stocks de virus avec l’infectivité inconnue, le virus peut être titré de multiples dilutions avant, par exemple les deux 10-2 et 10-3, afin de capturer la meilleure courbe de titrage pour calculer l’infectiosité du virus. La quantité de virus utilis...

Les anticorps neutralisants de grippe sont en corrélation avec protection des infections grippales. Tests de micro-neutralisation mesurent les anticorps neutralisants dans des sérums humains et sont souvent utilisés pour la sérologie humaine de la grippe. Nous décrivons un essai de micro-neutralisation en utilisant des cellules de MDCK-SIAT1 pour mesurer les titres d’anticorps neutralisants à virus a (H3N2) 3C.2a et 3C.3a contemporains après vaccination contre la grippe ou une infection.

Grippe neutralisante d’anticorps aux virus a (H3N2) dans le sérum humain par micro-neutralisation de mesure des analyses utilisant des cellules de MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

L’objectif global de ce test de microneutralisation est de mesurer les réponses des anticorps neutralisants aux virus grippaux H3N2 contemporains dans le sérum humain à l’aide de cellules MDCK-SIAT1. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés afin d’évaluer l’immunité antigrippale. Par exemple, il peut déterminer si la vaccination antigrippale induit des réponses d’anticorps neutralisants suffisantes contre les virus H3N2 en circulation, pour prévenir l’infection.Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise des cellules MDCK-SIAT1 et des tests de microneutralisation pour détecter les réponses anticorps à la réinitialisation des grappes antigéniques des virus de la grippe H3N2. Les stocks de virus doivent être multipliés à des titres infectieux élevés avant d’être utilisés dans des tests de microneutralisation. Commencer cette procédure par la propagation des virus AH3N2 dans les cellules MDCK-SIAT1, comme détaillé dans le protocole texte.Le premier jour, décongelez une fiole de virus à température ambiante et placez immédiatement le virus sur de la glace. Pour tester le virus à deux dilutions de départ différentes, ajoutez d’abord 100 microl

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Immunologie et infection

Cette vidéo montre des tests de microneutralisation pour mesurer les anticorps neutralisants à l’aide de cellules rénales canines de Madin-Darby surexprimant l’acide sialique lié à l’α2,6 dans le sérum humain. Ce test est souvent utilisé pour la sérologie humaine de la...

Un test de microneutralisation pour mesurer les titres d’anticorps neutralisants dans le sérum humain

Cette vidéo montre le test de micro-neutralisation basé sur l’imagerie pour analyser les relations antigéniques entre les virus de la grippe A et B. Il fournit un moyen quantitatif et visuel d’évaluer l’efficacité des anticorps ou d’autres traitements dans la prévention des infections virales.

Analyse de la relation antigénique entre les virus à l’aide d’un test de microneutralisation basé sur l’image

Cette vidéo présente une technique permettant de générer des variants d’échappement d’anticorps monoclonaux neutralisants du virus de la grippe. Une suspension virale neutralisée par anticorps est injectée dans des œufs de poule embryonnés pour propager les variants d’échappement de manière sélective. Il en résulte une population virale principalement composée de variants d’échappement, confirmée par un test d’hémagglutination.

Génération de variants d’échappement du virus de la grippe contre les anticorps neutralisants

Cette vidéo présente un test mesurant les titres d’anticorps inhibiteurs de la neuraminidase grippale (NA) dans un échantillon de sérum. Un échantillon de sérum contenant des anticorps contre NA est ajouté à une plaque de micropuits recouverte de fétuine. Lors de l’ajout du virus, les anticorps empêchent le NA viral de fendre le fœtuin et d’exposer sa fraction galactose. Une lectine conjuguée à la peroxydase est ensuite ajoutée, qui se lie au galactose exposé. Le titre d’anticorps inhibiteurs...

Un test pour mesurer les titres d’anticorps d’inhibition de la neuraminidase de la grippe

Cette vidéo présente un test d’immunofluorescence conçu pour mesurer la neutralisation du cytomégalovirus humain (HCMV). Les anticorps spécifiques du virus sont mélangés au virus et incubés avec des cellules de fibroblastes humains. Les anticorps neutralisent le virus, ce qui le rend incapable d’infecter les cellules hôtes, tandis que les virus non neutralisés infectent les cellules. Après l’incubation, l’étendue de la neutralisation est déterminée en quantifiant les cellules infectées par le...

Méthode d’immunofluorescence pour mesurer la neutralisation d’un cytomégalovirus humain

Nous décrivons le dosage des lectines enzymatiques (ELLA) pour mesurer les titres d’anticorps inhibiteurs de la neuraminidase de la grippe (NA) dans les sérums. Le test utilise l’agglutinine d’arachide pour quantifier les résidus de galactose qui deviennent accessibles lorsque NA élimine l’acide sialique des plaques à 96 puits enrobées de fétuine.

Mesure de la grippe neuraminidase Inhibition Titres d&#39;anticorps par-enzymatique lectine Assay

Cette étude décrit un   à base d'imagerie-dosage micro-neutralisation pour analyser les relations antigéniques entre les virus. Le protocole utilise un scanner à plat et comporte quatre étapes, dont le titrage, titrage quantification, la neutralisation et la neutralisation quantification. Le test fonctionne bien avec un courant circulant de la grippe A (H1N1) pdm09, A (H3N2), et les virus B.

L&#39;optimisation d&#39;un micro-neutralisation quantitative de dosage

Les protocoles présentés décrivent comment effectuer un test d’inhibition hémagglutination afin de quantifier les titres d’anticorps spécifiques à la grippe d’échantillons de sérum des destinataires de vaccin contre la grippe. Le premier dosage détermine la concentration optimale d’antigène viral par hémagglutination. Le deuxième essai quantifie les titres d’anticorps spécifiques à la grippe par l’inhibition de l’hémagglutination.

Un test d’Inhibition (HI) hémagglutination optimisé pour quantifier les titres d’anticorps spécifiques à la grippe

Virus de l’influenza (IAVs) sont des agents pathogènes respiratoires humains importants. Pour comprendre le pouvoir pathogène de IAVs et d’effectuer des essais précliniques de nouveau vaccin approches, modèles animaux imitant la physiologie humaine sont nécessaires. Nous décrivons ici les techniques pour évaluer l’IAV pathogenèse, humorale et l’efficacité du vaccin en utilisant un modèle de souris de l’infection.

Études de Virus influenza de type A dans un modèle murin d’Infection

Les auteurs décrivent une méthode par laquelle nous identifions des résidus importants requis pour la liaison des anticorps monoclonaux humains ou murins qui ciblent l’hémagglutinine virale du virus de l’influenza. Le protocole peut être adapté à d’autres glycoprotéines de surface de virus et de leurs anticorps neutralisants correspondants.

Génération des variantes d’évasion de neutraliser les anticorps monoclonaux Influenza Virus

Nous décrivons ici un protocole pour l’emballage des pseudovirus et la mesure de l’activité neutralisante des anticorps.

Préparation de virus pseudo-typés H5 de la grippe aviaire avec procédé de transfection de phosphate de calcium et mesure de l’activité neutralisante des anticorps

Découvrez la micro-neutralisation pour mesurer les anticorps neutralisants contre le virus H3N2 dans le sérum humain en utilisant des cellules MDCK-SIAT1. Cette méthode évalue efficacement l'immunité vaccinale.

Grippe neutralisante d’anticorps aux virus a (H3N2) dans le sérum humain par micro-neutralisation de mesure des analyses utilisant des cellules de MDCK-SIAT1 (Vidéo) | JoVE Journal

Grippe neutralisante d’anticorps aux virus a (H3N2) dans le sérum humain par micro-neutralisation de mesure des analyses utilisant des cellules de MDCK-SIAT1

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