Name: Grippe neutralisante d’anticorps aux virus a (H3N2) dans le sérum humain par micro-neutralisation de mesure des analyses utilisant des cellules de MDCK-SIAT1 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Découvrez la micro-neutralisation pour mesurer les anticorps neutralisants contre le virus H3N2 dans le sérum humain en utilisant des cellules MDCK-SIAT1. Cette méthode évalue efficacement l'immunité vaccinale.

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Nous remercions le Dr Xiuhua Lu, Dr Feng Liu et Mme Ashley Burroughs de la Division grippe des CDC pour leur examen critique et l’assistance dans la préparation de ce manuscrit. Nous remercions le Dr Adrian Reber de Division de la grippe des CDC pour son aide dans la préparation du graphique de la Figure 3. Enfin, nous remercions le Dr M. Matrosovich, Marburg, Allemagne pour fournir les cellules MDCK-SIAT1.

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</ol>

Les auteurs ne rapportent aucun conflit d’intérêts. Les constatations et conclusions dans la présente publication sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les vues des Centers for Disease Control and Prevention et l’organisme de financement.

Le dosage de MN est l’un des dosages du principales utilisés pour une sérologie de la grippe pour détecter les réponses en anticorps après infection de la grippe ou la vaccination. Titres générés à partir des essais de MN sont souvent utilisés comme le principal résultat de nombreuses études séroépidémiologie de grippe. Tests de MN sont aussi couramment pour séro-diagnostic et l’évaluation de l’immunogénicité du vaccin. International inter-lab a été étudié afin de comparer les analyses de MN exécutées dans plusieurs labo...

Virus de la grippe continuent à cause de morbidité et mortalité chez l’homme chaque année. HA est la glycoprotéine de surface importante des virus grippaux. Les anticorps neutralisants ciblant HA constituent le principal mécanisme immunitaire qui est en corrélation avec la protection de l’influenza infection1,2. Tests d’hemagglutination inhibition (HI) et MN essais sont deux méthodes largement utilisés pour mesurer la production d’anticorps dans le sérum humain après grippe infection ou la vaccination3. Le test HI mesure inhibition des anticorps d’hémagglutination virus des globules rouges et est considéré comme un test de substitution. Contrairement à HI, le dosage de MN peut mesurer directement le taux d’anticorps dans le sérum humain qui neutralisent l’infection grippale dans des cultures cellulaires. Des cellules de MDCK sont souvent utilisés dans l’isolement du virus grippal et MN essais4.
Virus de l’influenza subissent constamment la dérive antigénique et Maj, acquérir des mutations sur les protéines HA pouvant modifier la spécificité de liaison du récepteur du virus. Depuis 2014, nouveaux groupes de virus a (H3N2) ont émergé et ont continué à circuler jusqu'à la saison en cours. La majorité de ces virus appartiennent au groupe génétique 3C.2a et 3C.3a, basée sur l’analyse phylogénétique des protéines HA. Beaucoup de virus circulants 3C.2a avaient réduit la capacité de résultats des globules rouges et donc ne peuvent être qualifiées de HI essais sur5. Tests de neutralisation doivent être utilisés pour mesurer la production d’anticorps à ces virus que résultats pas6. En outre, des études ont montré que ces virus a (H3N2) contemporains ont modifié les propriétés de liaison du récepteur par rapport aux précédents virus a (H3N2) et ont tendance à accumuler les mutations de la culture adaptée et polymorphisme lorsque repiquées dans in vitro de cellules cultures7,8,9. Par rapport aux traditionnelles cellules MDCK, MDCK-SIAT1 est une lignée cellulaire développée par Matrosovich et al. par le biais de transfection stable des cellules MDCK avec l’ADNc de α2 humaine, 6-sialtransferase (SIAT1). Cette lignée cellulaire exprime des quantités accrues de α2, fractions 6-sialique galactose et une diminution de α2, les moitiés acides sialique-3 que le parent de cellules MDCK10. Des cellules de MDCK-SIAT1 ont montré pour améliorer les taux de l’isolement des virus a (H3N2) par rapport à des cellules MDCK11. Récemment, Lin et al. a signalé que pour nouvellement écloses 3C.2a et 3C.3a humaine a (H3N2) virus de l’influenza, les réplications de virus plus fidèles et meilleure infectiosité du virus ont été atteints lorsque les virus ont été cultivées dans des lignées de cellules de MDCK-SIAT1 comparées à celle des cellules MDCK7. Ainsi, les cellules de MDCK-SIAT1 conviennent mieux dans MN essais pour caractériser les réponses anticorps aux clusters récentes du virus a (H3N2).
Nous décrivons ici un essai de MN en utilisant des cellules de MDCK-SIAT1 pour mesurer les réponses immunitaires à 3C.2a contemporaines et le virus a (H3N2) 3C.3a dans le sérum humain. Virus cultivés dans des oeufs ou des cellules peuvent être utilisés dans cet essai. Sérum de chaleur inactivé contenant les anticorps neutralisants est tout d’abord dilués en série, puis incubées avec 100 TCID50/bien des virus de la grippe a (H3N2) pour permettre des anticorps à lier le virus vaccinal. Des cellules de MDCK-SIAT1 sont ensuite ajoutées au mélange des anticorps du virus et incubés pendant 18 à 20 h à 37 ° C, 5 % de CO2 à permettent au virus a (H3N2) infecter des cellules de MDCK-SIAT1 et reproduire. Après une nuit d’incubation, les plaques sont fixées et la quantité de virus dans chaque puits est quantifiée par une technique ELISA utilisant des anticorps monoclonaux contre la grippe A NP. La détection du NP indique la présence d’infection par le virus et l’absence d’anticorps neutralisants. Titre d’anticorps de neutralisation est définie comme l’inverse de la plus forte dilution de sérum qui fournit ≥ 50 % d’inhibition de l’infectiosité du virus.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Milieu Eagle modifié (DMEM) avec une teneur élevée en glucose</td><td>Life Science</td><td>11965</td><td>Un composant essentiel de la culture cellulaire stérile, de la propagation du virus et du milieu diluant</td></tr> viral <tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA) Fraction V, Protase Free</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3117332001</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Science</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Life Science</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin G-418 disulfate sel&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1720-5G&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Science</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Life Science</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>VWR</td><td>67-64-1</td><td>Utilisé à une concentration de 80</td></tr> % <tr><td>Tampon phosphate-citrate avec perborate de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBF2806V</td><td></td></tr><tr><td>O-Phénylènediamine Dichlorhydrate</td><td>comprimé Sigma-Aldrich</td><td>SLBQ1086V</td><td>1 comprimé pour 100 ml d’eau de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Acide sulfurique</td><td>Fisher Scientific</td><td>A510-P500</td><td>Utilisé 0,5 M de concentration finale</td></tr><tr><td>Éthanol, dénaturé, 4L</td><td>VWR</td><td>EM-AX0422-3</td><td>Utilisé à une concentration de 70 %</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Sciences de la vie</td><td></td><td></td>1748048</tr><tr><td>RDE II « Seiken"</td><td>Denka Seiken</td><td>370013</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NP souris monoclonale Ab</td><td>Millipore pool</td><td>MAB 8257 MAB 8258</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris IgG HRP&nbsp ;</td><td>KPL</td><td>074-1802</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à fond plat 96 puits</td><td>Thermo Scientific</td><td>3455</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de plaques</td><td>Dispositif moléculaire</td><td>Spectromax 384 plus</td><td></td></tr><tr><td>Flacon de culture cellulaire 162 cm2/Capuchon d’aération</td><td>Corning/VWR</td><td>3151</td><td></td></tr></tbody></table>

grippe neutralisante d’anticorps aux virus a (h3n2) dans le sérum humain par micro-neutralisation de mesure des analyses utilisant des cellules de mdck-siat1

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Des anticorps neutralisants dirigés contre l’hémagglutinine (HA) des virus grippaux sont considérés comme le principal mécanisme immunitaire qui est en corrélation avec la protection pour les infections grippales. Tests de micro-neutralisation (MN) sont souvent utilisés pour mesurer la production d’anticorps neutralisants dans des sérums humains après vaccination contre la grippe ou une infection. Les cellules de Madine Darby Canine Kidney (MDCK) sont le substrat de la cellule utilisée couramment pour des dosages de MN. Toutefois, 3C.2a et 3C.3a la grippe a (H3N2) ont acquis des virus actuellement en circulation modifiée spécificité de liaison du récepteur. La lignée de cellules de MDCK-SIAT1 avec portions accrue α-2,6 sialique galactose sur la surface s’est avéré d’infectiosité améliorée et réplications plus fidèles que les cellules MDCK conventionnelles prévoient ces virus a (H3N2) contemporains. Nous décrivons ici un essai de MN en utilisant des cellules de MDCK-SIAT1 qui a été optimisé afin de quantifier les titres d’anticorps neutralisants de ces virus a (H3N2) contemporains. Dans ce protocole, sérums de chaleur inactivé contenant les anticorps neutralisants sont tout d’abord dilués en série, puis incubées avec 100 TCID50/bien des virus de la grippe a (H3N2) pour permettre des anticorps dans le sérum pour lier aux virus. Des cellules de MDCK-SIAT1 sont ensuite ajoutées au mélange des anticorps du virus et incubés pendant 18 à 20 h à 37 ° C, 5 % de CO2 pour permettre à des virus a (H3N2) d’infecter des cellules de MDCK-SIAT1. Après une nuit d’incubation, les plaques sont fixées et la quantité de virus dans chaque bien est quantifiée par un dosage immuno-enzymatique (ELISA) à l’aide contre la grippe une nucléoprotéine (NP) des anticorps monoclonaux. Titre d’anticorps de neutralisation est définie comme l’inverse de la plus forte dilution de sérum qui fournit ≥50 % d’inhibition de l’infectiosité du virus.

Détermination de l’infectiosité des stocks de virus est la première étape de l’analyse de MN. La figure 2 illustre le schéma pour déterminer la TCID50 des stocks de virus. Pour les stocks de virus avec l’infectivité inconnue, le virus peut être titré de multiples dilutions avant, par exemple les deux 10-2 et 10-3, afin de capturer la meilleure courbe de titrage pour calculer l’infectiosité du virus. La quantité de virus utilis...

Les anticorps neutralisants de grippe sont en corrélation avec protection des infections grippales. Tests de micro-neutralisation mesurent les anticorps neutralisants dans des sérums humains et sont souvent utilisés pour la sérologie humaine de la grippe. Nous décrivons un essai de micro-neutralisation en utilisant des cellules de MDCK-SIAT1 pour mesurer les titres d’anticorps neutralisants à virus a (H3N2) 3C.2a et 3C.3a contemporains après vaccination contre la grippe ou une infection.

Grippe neutralisante d’anticorps aux virus a (H3N2) dans le sérum humain par micro-neutralisation de mesure des analyses utilisant des cellules de MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

L’objectif global de ce test de microneutralisation est de mesurer les réponses des anticorps neutralisants aux virus grippaux H3N2 contemporains dans le sérum humain à l’aide de cellules MDCK-SIAT1. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés afin d’évaluer l’immunité antigrippale. Par exemple, il peut déterminer si la vaccination antigrippale induit des réponses d’anticorps neutralisants suffisantes contre les virus H3N2 en circulation, pour prévenir l’infection.Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise des cellules MDCK-SIAT1 et des tests de microneutralisation pour détecter les réponses anticorps à la réinitialisation des grappes antigéniques des virus de la grippe H3N2. Les stocks de virus doivent être multipliés à des titres infectieux élevés avant d’être utilisés dans des tests de microneutralisation. Commencer cette procédure par la propagation des virus AH3N2 dans les cellules MDCK-SIAT1, comme détaillé dans le protocole texte.Le premier jour, décongelez une fiole de virus à température ambiante et placez immédiatement le virus sur de la glace. Pour tester le virus à deux dilutions de départ différentes, ajoutez d’abord 100 microlitres de virus à 99 millilitres de diluant viral pour la prédilution 10:2. Ajoutez ensuite 1 millilitre de pré-dilution 10:2 à 9 millilitres de diluant viral pour la pré-dilution 10:3.À l’aide de deux plaques de microtitration, ajoutez 100 microlitres de micro-diluant dans tous les puits, à l’exception de la première colonne de la plaque de microtitration de 96 puits. Ensuite, effectuez des dilutions demi-log 10. Ajoutez 146 microlitres du virus à partir de la dilution dans tous les puits de la première colonne, et transférez en série 46 microlitres de la première à la onzième colonne.Changez les pointes de pipette entre les colonnes. Après avoir mélangé la colonne onze, jetez les pointes avec la dilution de 46 microlitres. Utilisez la colonne douze comme cellule de contrôle qui ne contient que du diluant viral.Ensuite, incubez la plaque pendant une heure, à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone. Préparez les cellules MDCK-SIAT1 comme décrit dans le protocole texte. Ajoutez 100 microlitres de cellules diluées dans chaque puits des plaques de microtitration.Et couvrez les assiettes. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius, soit 5 % de dioxyde de carbone, pendant 18 à 20 heures. Le deuxième jour, effectuez l’ELISA, en retirant d’abord le milieu des plaques de microtitration.Après avoir lavé chaque puits avec 200 microlitres de PBS, ajoutez 300 microlitres d’acétone froide à 80 % dans chaque puits. Et incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, retirez le fixateur.Et laissez les plaques sécher à l’air. Ensuite, diluez l’anticorps monoclonal nucléoprotéique anti-grippe A à la concentration cible dans le diluant de l’anticorps. Lavez les plaques trois fois avec 300 microlitres de tampon de lavage.Ajoutez ensuite 100 microlitres d’anticorps primaires dilués dans chaque puits. Incuber les plaques à température ambiante pendant une heure. Pour l’ajout d’anticorps secondaires, diluer les IgG anti-souris de chèvre conjuguées à l’anticorps HRP à la concentration cible dans le diluant d’anticorps.Lavez les plaques trois fois avec 300 microlitres de tampon de lavage. Ajoutez 100 microlitres d’anticorps secondaires dilués dans chaque puits, avant d’incuber la plaque à température ambiante pendant une heure. Ensuite, lavez les plaques cinq fois avec 300 microlitres de tampon de lavage.Et appuyez sur une lingette non pelucheuse. Ajoutez 100 microlitres de substrat fraîchement préparé dans chaque puits. Et incuber à température ambiante jusqu’à ce que le développement de la couleur soit saturé et que la densité optique ou DO des puits de contrôle de la cellule soit inférieure à 0,2.Ajoutez ensuite 100 microlitres de solution d’arrêt à tous les puits. Lire le diamètre extérieur des puits à 490 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre de microplaques. Calculez le TCID50 du virus à l’aide de la méthode de Reed-Muench, comme décrit dans le protocole texte.Le premier jour du test MN, décongelez les sérums dans un bain-marie à 37 degrés Celsius et retirez-les immédiatement après la décongélation. Chauffez et activez le sérum humain pendant 30 minutes dans un bain-marie à 56 degrés Celsius, comme décrit dans le protocole textuel. Ensuite, placez le sérum sur de la glace et ajoutez le diluant viral au sérum pour obtenir une pré-dilution de 1:10.Pour tester avec un virus, ajoutez 50 microlitres de diluant viral aux rangées B à H, à l’exception des colonnes 11 et 12. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de sérum dilué 1:10 dans les colonnes A1 à A10. Effectuez une dilution en série en deux parties des rangées A à H.Et jetez les 50 derniers microlitres de la rangée H.Pour le contrôle du virus, ajoutez 50 microlitres de diluant viral dans les puits A12, B12, C12 et D12.Pour le contrôle cellulaire, ajoutez 100 microlitres de diluant viral dans les puits E12, F12, G12 et H12. Pour le sérum témoin, ajouter 100 microlitres de sérum témoin dilué dans la colonne 11 du puits A. Et ajoutez 50 microlitres de diluant viral dans les puits B11 à H11.Procédez à la dilution en série. Couvrez les assiettes et incubez à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’ajout du virus. Pour l’ajout de virus, diluez le virus à 100 TCID50 dans 50 microlitres avec un diluant viral.Ajouter 50 microlitres de virus dilué dans tous les puits, à l’exception de la colonne 11 sur les plaques de titrage arrière et des puits de contrôle cellulaire, E12, F12, G12 et H12 sur toutes les plaques. Ajouter 50 microlitres de diluant viral à tous les puits de la colonne 11. Ajoutez ensuite 50 microlitres du virus à 100 TCID50 dans 50 microlitres dans le premier puits.Ensuite, mélangez et transférez 50 microlitres dans des puits successifs pour effectuer des dilutions en deux séries. Changez les pointes de pipette entre les puits pour éviter la propagation du virus. Jetez 50 microlitres du puits H11.Ensuite, ajoutez 50 microlitres de diluant viral à la colonne 11 pour porter le volume final à 100 microlitres. Tapotez les plaques pour mélanger. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, pendant une heure, avant d’effectuer l’ajout de cellules MDCK le premier jour et l’ELISA le deuxième jour, comme précédemment.Après avoir ajouté les anticorps primaires et secondaires, comme décrit dans le protocole de texte, effectuez l’ajout de substrat et la lecture de la plaque. Lavez les plaques cinq fois avec 300 microlitres de tampon de lavage et tapotez sur une lingette non pelucheuse. Ajoutez 100 microlitres de substrat OPD fraîchement préparé dans chaque puits.Ensuite, incubez les plaques à température ambiante jusqu’à ce que les puits de contrôle du virus atteignent une densité optique de 490 nanomètres entre 0,8 et 3 avec le contrôle cellulaire à un faible OD de fond inférieur à 0,2. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de la solution d’arrêt à tous les puits. Lire le diamètre extérieur des puits à 490 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre de microplaques.Enfin, déterminez le titre d’anticorps neutralisants de chaque échantillon de sérum, comme décrit dans le protocole textuel. Les résultats représentatifs des tests de microneutralisation sont présentés ici. La DO dans chaque puits représente la quantité d’infection et de réplication virale dans les cellules MDCK-SIAT1, en présence de sérums dilués en série contenant des anticorps neutralisants.Le seuil de neutralisation de 50 % est défini comme la DO médiane des puits de contrôle du virus plus la DO médiane des puits de contrôle cellulaire, divisée par deux, l’inverse de la dilution sérique la plus élevée qui atteint une neutralisation égale ou supérieure à 50 % est considérée comme le titre d’anticorps pour l’échantillon de sérum. Dans cet exemple, des sérums appariés prélevés avant et après la vaccination antigrippale de deux patients ont été testés contre le virus H3N2 utilisé dans le vaccin, au cours de la saison grippale 2016-2017. Avec les sérums de pré-vaccination du patient 1, aucune des dilutions des sérums n’a inhibé l’infection virale et elle est donc considérée comme négative.Après la vaccination, les sérums de ce patient ont montré une neutralisation. La troisième dilution de ce sérum est la dilution la plus élevée en dessous du seuil de 50 %, donc ce patient a un titre post-vaccination de 40. En comparaison, le sérum du deuxième patient avant la vaccination contient des anticorps neutralisants préexistants à un titre de 320.Après la vaccination, le titre est passé à plus de 1280. Dans ce cas, à une pré-dilution de 1:10 du sérum, aucun titre final d’anticorps n’a été atteint. Le sérum peut être testé à nouveau à une pré-dilution plus élevée afin d’atteindre le titre final.Les tests de microneutralisation utilisant des cellules MDCK-SIAT1 sont très sensibles, spécifiques et robustes pour détecter les réponses des anticorps neutralisants contre les grappes antigéniques récentes de virus de la grippe H3N2. En utilisant des cellules MDCK régulières, cette procédure peut également être utilisée pour détecter les réponses anticorps à d’autres souches de virus H3N2 et à d’autres sous-types de virus de la grippe, afin d’évaluer l’immunité protectrice contre la grippe.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

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Un test de microneutralisation pour mesurer les titres d’anticorps neutralisants dans le sérum humain

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Analyse de la relation antigénique entre les virus à l’aide d’un test de microneutralisation basé sur l’image

Cette vidéo présente une technique permettant de générer des variants d’échappement d’anticorps monoclonaux neutralisants du virus de la grippe. Une suspension virale neutralisée par anticorps est injectée dans des œufs de poule embryonnés pour propager les variants d’échappement de manière sélective. Il en résulte une population virale principalement composée de variants d’échappement, confirmée par un test d’hémagglutination.

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Mesure de la grippe neuraminidase Inhibition Titres d&#39;anticorps par-enzymatique lectine Assay

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Les protocoles présentés décrivent comment effectuer un test d’inhibition hémagglutination afin de quantifier les titres d’anticorps spécifiques à la grippe d’échantillons de sérum des destinataires de vaccin contre la grippe. Le premier dosage détermine la concentration optimale d’antigène viral par hémagglutination. Le deuxième essai quantifie les titres d’anticorps spécifiques à la grippe par l’inhibition de l’hémagglutination.

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Grippe neutralisante d’anticorps aux virus a (H3N2) dans le sérum humain par micro-neutralisation de mesure des analyses utilisant des cellules de MDCK-SIAT1 (Vidéo) | JoVE Journal

Grippe neutralisante d’anticorps aux virus a (H3N2) dans le sérum humain par micro-neutralisation de mesure des analyses utilisant des cellules de MDCK-SIAT1

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