Utilisant le test de Dot pour analyser la Migration des cellules feuilles

L’objectif global de l’essai par points est d’évaluer le phénotype migratoire des feuillets cellulaires cohésifs attachés en réponse à des signaux microenvironnementaux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du cancer, telles que la façon dont les cytokines ou les facteurs de croissance modifient la motilité des cellules tumorales. Le principal avantage du test par points est qu’il est facile à réaliser et à utiliser pour obtenir des résultats reproductibles.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la motilité cellulaire, elle se prête également à une gamme de tests ultérieurs, tels que la coloration des cellules pour évaluer la morphologie des colonies de croissance et la diffusion cellulaire, l’immunomarquage, l’analyse des protéines et de l’ADN ou de l’ARN, ou l’injection de cellules dans des animaux. Pour commencer, décongelez quatre collagènes de souris sur de la glace et diluez-le avec 50 micromolaires HCL pour préparer trois millilitres d’une solution de collagène quatre de 10 microgrammes par millilitre. Ajoutez 250 microlitres de solution de collagène dans les puits de plaques à fond de verre à 12 puits et placez-les dans une boîte en plastique de taille appropriée et à fermeture étanche.

Placez une serviette en papier humide sur et autour des assiettes pour fabriquer une chambre humide et fermez la boîte. Ensuite, incubez les plaques pendant la nuit à température ambiante. Le lendemain matin, pour déplacer le collagène non absorbé et le tampon, utilisez de l’eau désionisée pour rincer les plaques deux fois, en dirigeant l’eau vers le bord de la plaque, plutôt que vers le bord formé par le fond du bord et la lamelle.

Faites sécher les plaques à l’air libre dans une hotte à flux laminaire et utilisez-les immédiatement ou stockez-les à quatre degrés Celsius jusqu’à cinq jours. Pour préparer la suspension cellulaire, utilisez des cellules qui ont été cultivées dans une boîte de culture tissulaire de 60 millimètres dans DMEMF12 milieu, complétées par 5 % de sérum de cheval à 80 % de confluence. Utilisez du DPBS sans calcium ni magnésium pour rincer les cellules une fois, puis ajoutez 500 microlitres de trypsine EDTA à température ambiante et incubez les cellules à 37 degrés Celsius dans 5 % de CO2 dans une atmosphère humidifiée pendant trois à cinq minutes.

Mettez en suspension les cellules détachées dans 4,5 millilitres de milieu de culture pour arrêter l’activité de la trypsine et utilisez un hémocytomètre pour compter une aliquote de 20 microlitres de la suspension cellulaire. Retirez les cellules restantes dans un tube conique de 50 millilitres par centrifugation à 200 fois la gravité pendant trois minutes. Ensuite, aspirez le surnageant et mettez à nouveau les cellules en suspension dans le milieu de culture à trois fois 10 à six cellules par millilitre.

Pour plaquer les cellules au centre de chaque lamelle de la plaque à fond de verre à 12 puits enduite de collagène, placez une goutte de 10 microlitres de suspension cellulaire, en prenant soin de ne pas toucher ou rayer le revêtement. Le placage d’une goutte non circulaire ne donnera pas une feuille de cellules circulaire, et si le revêtement est touché ou rayé, il empêchera les cellules de bien adhérer. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée pendant 30 minutes, pour permettre aux cellules de se fixer.

Ensuite, vérifiez la fixation sous un microscope inversé. Avec un millilitre de milieu de culture, lavez doucement les puits deux fois, pour enlever les cellules non attachées, puis ajoutez un millilitre de milieu de culture dans chaque puits. Vérifiez au microscope inversé qu’il ne reste pas de cellules flottantes, sinon lavez à nouveau les puits.

Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans 5 % de CO2 dans une atmosphère humidifiée pour obtenir des feuillets cellulaires bien définis. À l’aide d’un microscope inversé, vérifiez tous les puits pour vous assurer que les colonies cellulaires se sont correctement développées. Si nécessaire, marquez les puits inappropriés et ne les utilisez pas.

Étiquetez chaque puits de la plaque de manière appropriée pour chaque condition étudiée. Exécutez chaque condition en double ou en triple. Changez de milieu pour affamer les cellules dans DMEMF12 contenant 0,1 % de sérum de cheval, trois heures avant que les cellules ne soient stimulées.

Ensuite, stimulez les cellules en ajoutant de l’EGF ou d’autres médiateurs souhaités. Utilisez une pipette d’un microlitre ou faites tourner doucement la plaque pour mélanger le fluide. Incuber la plaque pendant un à quatre jours pour observer le déplacement et le contour des bords.

Pour effectuer la coloration H et E, lavez deux fois les cellules avec du PBS et fixez-les pendant environ deux minutes. Ajoutez de l’hématoxyline pendant environ deux minutes pour colorer les noyaux. Lavez les cellules à l’eau du robinet pendant cinq à 10 minutes, jusqu’à ce que les noyaux soient bleus.

Ensuite, colorez le cytoplasme avec de l’éosine pendant deux minutes avant de rincer les cellules avec de l’eau désionisée. Faites sécher la plaque à l’air libre, puis retournez-la et utilisez une règle pour mesurer le diamètre du point. Vous pouvez également prendre des photos de la plaque avec un appareil photo et utiliser ImageJ pour analyser le diamètre du point.

Pour effectuer une microscopie à intervalle, allumez le microscope de l’incubateur et réglez la température à 37 degrés Celsius. Remplissez l’humidificateur avec du DH2O, puis ajustez le CO2 à 5 %Assurez-vous que la chambre de l’incubateur est humidifiée et que la platine motorisée peut se déplacer librement. Ensuite, fermez la chambre de l’incubateur et laissez le microscope s’ajuster à 37 degrés Celsius.

Placez la plaque sur la platine du microscope incubateur et établissez la liste des étapes, puis imagez deux bords opposés et le centre de chaque point de cellule. À l’aide d’un objectif 10X, prenez des images toutes les trois minutes pendant 15 à 24 heures. Téléchargez les données et procédez à l’analyse des images dans un programme de votre choix tel que Matlab.

Initialement, l’imagerie en contraste de phase des points cellulaires a révélé que les cellules cancéreuses du sein invasives formant des colonies pulmonaires conservent un phénotype mésenchymateux après stimulation par EGF. Cependant, les cellules uniques quittant la feuille sont observées plus fréquemment dans les points cellulaires stimulés par l’EGF. La réponse des cellules cancéreuses du sein formant des colonies pulmonaires à l’EGF a été évaluée par coloration H et E de cultures stimulées avec de l’EGF pendant quatre jours.

En effet, la stimulation par EGF a entraîné une augmentation du diamètre de la colonie, indiquant que la migration des cellules stimulées par EGF pourrait être modifiée. Dans ce test de points, les cellules situées sur les bords de la feuille ont été imagées pendant neuf heures après la stimulation des cellules cancéreuses du sein formant des colonies avec l’EGF. La PIV a révélé que l’EGF a augmenté la vitesse des cellules à 0,63 micromètre par minute contre 0,45 micromètre par minute dans les cellules de contrôle.

De plus, l’EGF a réduit la variabilité de la directionnalité cellulaire, ou propagation angulaire, de 0,95 dans les cultures témoins à 0,79 dans les cultures stimulées par l’EGF. De plus, comme observé par les colorations H et E après quatre jours, l’EGF a augmenté le déplacement radial du bord épithélial sur neuf heures, passant de 257 micromètres à 356 micromètres. Une fois maîtrisée, le temps pratique de cette technique est de quelques heures.

Après cette procédure, d’autres méthodes telles que l’imagerie en accéléré, l’immunomarquage et l’analyse de l’ADN et de l’ARN peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires. Par exemple, il peut être utilisé pour analyser si les protéines sont exprimées de manière différentielle dans les cellules à migration rapide ou lente, ou lorsque les cellules migrent dans l’environnement environnant. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de configurer le test de points et l’utiliser pour évaluer le phénotype migratoire des feuilles de cellules cohésives attachées en réponse à des indices microenvironnementaux.