Une Technique de Squash de tube séminifère pour l’analyse cytologique de la spermatogenèse en utilisant le modèle de souris

L’objectif global de cette technique de courge des tubes séminifères est de visualiser les caractéristiques cytologiques des spermatogonies, des spermatocytes et des spermatides de souris tout en préservant leur intégrité cellulaire. Pour cette démonstration, nous nous concentrons sur l’analyse des spermatocytes subissant une méiose. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie de la reproduction masculine, telles que la différenciation des cellules souches spermatogoniales, la ségrégation des chromosomes méiotiques et la différenciation post-méiotique des spermatides rondes.

Le principal avantage de cette technique est que l’intégrité cellulaire des cellules germinales mâles est maintenue, ce qui permet d’examiner des structures cellulaires qui ne sont pas facilement visualisées avec d’autres techniques. Cette méthode peut être utilisée pour améliorer notre compréhension des causes paternelles de l’infertilité chez n’importe quel platy. Et il peut être appliqué à des systèmes de mammifères tels que les testicules dérivés de souris ou de donneurs d’organes.

En général, les personnes qui débutent dans cette méthode auront du mal à faire une bonne courge. L’application d’une force suffisante et la disposition correcte des tubules sont des facteurs importants pour produire une monocouche uniforme de cellules. Pour chaque souris à disséquer, chargez deux boîtes de Pétri de 35 millimètres, l’une avec trois millilitres de PBS et l’autre avec deux millilitres de solution de lyse fixative fraîchement préparée.

Sélectionnez des souris subissant la première vague de spermatogenèse pour observer une population d’intérêt enrichie. Après avoir sacrifié la souris, nettoyez l’abdomen avec de l’alcool à 70 %, puis procédez à l’opération. Faites une ouverture en forme de V dans la cavité pelvienne abdominale et retirez les testicules en tirant sur le coussinet adipeux de l’épididymaire à l’aide d’une pince, mais sans déranger la tunique albuginée.

Transférez les testicules dans la boîte contenant du PBS. Là, retirez la tunique testiculaire albuginée en perforant le tissu avec des pinces tranchantes et collectez les tubules séminifères lâches. Ensuite, transférez les tubules dans la boîte avec la solution de lyse fixatrice et laissez la réaction se poursuivre pendant cinq minutes à température ambiante.

Pendant l’incubation, préparez une lame de verre revêtue de poly-L-lysine en décrivant les bords de la lame avec un stylo bloqueur de liquide, puis en remplissant la lame avec 100 microlitres de solution de lyse fixatrice à l’intérieur des bords. Après l’incubation de cinq minutes, à l’aide d’une pince et de ciseaux stériles, séparez doucement et coupez les tubes séminifères de manière à obtenir des segments individuels de 20 millimètres. Ensuite, transférez cinq segments de tubule de 20 millimètres sur la lame préparée.

Continuez ensuite à briser les segments en longueurs de 1,5 à trois millimètres à l’aide de ciseaux. Maintenant, avec la pince, disposez les segments de manière à ce qu’ils ne se chevauchent pas. Répartissez-les uniformément sur la diapositive.

Idéalement, 20 à 40 courtes longueurs occuperont une lame. Commencez par enlever l’excès de liquide sur la préparation de la lame à l’aide d’un mouchoir absorbant. Maintenant, appliquez une lamelle et écrasez les tubules en exerçant la pression du talon de la paume pendant 10 à 20 secondes.

L’objectif est d’appliquer une force suffisante pour disperser les spermatocytes des tubules séminifères. À l’aide d’un microscope de dissection, vérifiez que les segments ont été perturbés par la courge. Ensuite, versez un peu d’azote liquide dans un petit Dewar et congelez la lame pendant 15 secondes ou jusqu’à ce que le liquide cesse de bouillonner.

Pour procéder au transfert d’amines, retirez immédiatement la lamelle à l’aide d’une pointe ou d’un bord tranchant. Bien que ce ne soit pas idéal, les lames congelées peuvent être immédiatement conservées à moins 80 degrés Celsius et conservées jusqu’à deux semaines. Pour retirer la lamelle plus tard, plongez les lames dans de l’azote liquide pendant 15 secondes et soulevez la lamelle.

Pour procéder à l’étiquetage aminé, lavez les lames trois fois dans du PBS pendant cinq minutes par lavage à l’aide d’un pot Coplin de 50 millilitres. Après les lavages, appliquez un millilitre de tampon de dilution d’anticorps sur chaque lame pour servir de bloc. Laissez la réaction de bloc fonctionner pendant une à deux heures dans une chambre humidifiée.

Ne laissez jamais les lames sécher pendant cette procédure. Ensuite, tapotez les lames sur une serviette en papier pour retirer délicatement le tampon et remettez-les dans la chambre humidifiée. Ensuite, appliquez 100 microlitres d’anticorps primaires dilués sur chaque lame et transférez-les à 40 degrés Celsius où la réaction de liaison peut se dérouler pendant la nuit.

Si la solution d’anticorps est rare, la moitié du volume peut être utilisée si elle est recouverte d’une lamelle ou d’un parafilm. Le lendemain, utilisez trois lavages dans du PBS pour éliminer l’anticorps primaire. Ensuite, appliquez 100 microlitres d’anticorps secondaires dilués et laissez cette réaction se dérouler pendant une heure à une heure et demie à température ambiante.

Pour éviter le photoblanchiment, conservez les lames dans une chambre sombre et humidifiée pendant cette incubation. Ensuite, lavez les lames deux fois avec du PBS. Maintenant, pointez les diapositives à l’aide d’un support de montage contenant du DAPI.

Scellez ensuite les lamelles à l’aide de vernis à ongles et procédez à l’imagerie. Pour prendre des images, utilisez un microscope à épifluorescence doté d’une platine automatisée qui permet un mouvement précis de l’axe z. Utilisez également un appareil photo haute résolution pour capturer des images.

Maintenant, évaluez les diapositives à l’aide d’un objectif 20x. Déterminez la qualité de la préparation de la courge. Une courge de bonne qualité aura une monocouche de noyaux uniformément répartis.

Certaines régions de la courge peuvent être meilleures que d’autres. Notez les coordonnées des meilleures régions pour les retrouver facilement sous un grossissement plus élevé. Maintenant, augmentez le grossissement jusqu’à 100x.

Ensuite, capturez des images à partir de régions notées qui ont une monocouche cohérente de noyaux. Réglez les piles z supérieure et inférieure pour vous assurer que toute la lumière nette est capturée. Le nombre optimal de piles z est généralement désigné par le logiciel d’acquisition d’images et est différent pour chaque objectif.

À partir des images, compilez une image à profondeur étendue à l’aide d’un logiciel de traitement. Le logiciel combinera la lumière nette de chaque pile z, ce qui est essentiel pour une imagerie optimale des préparations de courges tubulaires. À l’aide de la méthode décrite de la courge tubule, des populations cellulaires transitoires subissant la transition de la prophase à la métaphase un ont été visualisées.

Des populations enrichies de spermatocytes en métaphase un ont été visualisées à l’aide des anticorps contre l’alpha-tubuline. Pour visualiser les cellules en prophase un, des préparations de courge tubule ont été immunomarquées avec un anticorps contre la protéine du complexe synaptonémique 3. Des spermatocytes à stades de leptotène, de zygotène et de pachytène diplotène ont tous deux été identifiés.

Des anticorps dirigés contre la kinase du cycle cellulaire Aurora B ont été utilisés pour visualiser les événements ultérieurs de la méiose un. Cette kinase se localise dans le centromère interne pendant la métaphase, puis se relocalise dans la zone médiane du fuseau pendant l’anaphase, et enfin dans le sillon de clivage pendant la cytokinèse. En maintenant l’intégrité cellulaire, la technique de la courge tubule permet de visualiser l’organisation subcellulaire dans les structures associées à la prophase un.

La dynamique du bouquet de chromosomes peut être suivie par la prophase un. La duplication du centriole dans la disjonction du centrosome peut également être visualisée. Au stade précoce du diplotène, les spermatocytes subissant une disjonction des centrosomes après duplication des centrioles ont été visualisés avec des anticorps contre la péricentrine, un composant protéique de la matrice péricentriolaire et des anticorps contre la Centrine-3 pour marquer les centrioles.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer rapidement les caractéristiques cytologiques des spermatocytes de souris en développement tout en préservant l’intégrité cellulaire. Une fois maîtrisée, la dissection par écrasement peut être réalisée en moins d’une heure par souris. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’appliquer une force suffisante pour disperser les spermatocytes des tubules séminifères.

De plus, la concentration du fixateur et le temps d’incubation peuvent être optimisés en fonction de la structure cellulaire à étudier. Des stratégies de visualisation alternatives, telles que les approches de l’ADN et de l’ARN des poissons, peuvent être facilement mises en œuvre avec cette technique. En complétant les courges tubules par des analyses biochimiques en aval, il est possible d’évaluer les déterminants mécanistes de la progression méiotique réussie.