Une approche Simple pour induire une névrite auto-immune expérimentale chez la souris C57BL/6 pour les évaluations fonctionnelles et neuropathologiques

Ce rapport présente une approche simple pour provoquer avec succès l’expérimental névrite auto-immune (EAN) à l’aide de la protéine de la myéline zéro (P0)_180-199 peptide en combinaison avec adjuvant complet de Freund et la toxine coquelucheuse. Nous présentons un modèle sophistiqué capable d’évaluer avec précision l’ampleur des déficits fonctionnels et neuropathologie qui se produisent dans cette EAN.

L’objectif global de cette procédure est d’induire avec succès une névrite auto-immune expérimentale ou EAN dans un modèle murin pour l’analyse fonctionnelle et pathologique du processus de la maladie. Le modèle EAN peut être utilisé pour répondre à des questions clés relatives à la neuropathie périphérique. C’est aussi un merveilleux modèle pour étudier potentiellement l’efficacité de nouveaux agents thérapeutiques.

Le principal avantage de cette approche est qu’elle fournit un paradigme de test fonctionnel simple et objectif qui peut être appliqué lors de l’utilisation du modèle EAN dans la souris. Aujourd’hui, Sang Won Yoo, étudiant de premier cycle au laboratoire de biologie de la neurotrophine et de la myéline de l’Université de Melbourne, fait la démonstration de la procédure. Trois jours avant l’induction de la maladie, allumez l’appareil d’évaluation de la fonction motrice et allumez le bouton d’éclairage.

Prenez la souris et abaissez-la sur un récipient de colorant alimentaire rouge. Placez la souris dans le compartiment de marche et réglez la vitesse du tapis roulant sur 15 centimètres par seconde. Allumez le tapis roulant et cliquez sur enregistrer pour utiliser le système d’imagerie de la fonction de marche afin de capturer le mouvement de course de la souris pendant 36 secondes.

Après 36 secondes, arrêtez l’enregistrement et le tapis roulant et enregistrez le fichier vidéo de la course d’entraînement dans le dossier désigné. Un jour avant la première vaccination, utilisez une seringue de 0,5 millilitre munie d’une aiguille de calibre 30-1/2 pour administrer 1,6 microgramme par millilitre de toxine coqueluche dans 250 microlitres de PBS IP isotonique de souris à des souris mâles C57BL/6 âgées de six à huit semaines et anesthésiées. Ensuite, notez les souris pour les signes cliniques d’EAN sur une échelle de zéro à quatre selon le tableau et effectuez une évaluation de la fonction motrice comme nous venons de le démontrer.

Le lendemain, combinez des volumes égaux de solutions de peptide fraîchement préparées dans une solution saline à 0,9 % et 20 milligrammes par millilitre de Mycobacterium tuberculosis dans un adjuvant de Freund complet dans une perleuse à billes et mélangez les solutions à la vitesse maximale pendant une minute à température ambiante. Chargez une seringue équipée d’une aiguille de calibre 23 avec l’inoculum et retournez et secouez la seringue avant d’évacuer l’air à l’intérieur de la tige de la seringue. Avant d’administrer l’inoculum, retirez les poils juste latéralement à la ligne médiane entre les omoplates et désinfectez la peau exposée avec de l’éthanol à 70 %.

Ensuite, à l’aide d’une paire de pinces Adson, saisissez la peau et délivrez 50 microlitres de la solution à la souris injectée de toxine coqueluche par injection sous-cutanée. Le lendemain matin, administrez 1,2 microgramme par millilitre de toxine coqueluche dans 250 microlitres de PBS IP, comme nous venons de le démontrer, suivi d’une autre injection de 1,2 microgramme par millilitre de toxine coqueluche IP 48 heures plus tard. Trois jours plus tard, après la troisième injection de coqueluche, administrer 50 microlitres supplémentaires d’inoculum fraîchement préparé au même site d’injection qu’auparavant et surveiller le score clinique et la fonction motrice des animaux deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience.

L’EAN induite par le peptide P0 180-199 chez les souris C57BL/6 conduit à une maladie monophasique avec un score clinique débutant six jours après la première immunisation et une gravité maximale du score 25 jours après la première vaccination, suivie d’une certaine amélioration du score clinique 40 jours après la première vaccination. Les souris commencent à échouer à une simple tâche de course dès six jours après la première vaccination, avec une faible capacité à accomplir une simple tâche de course sur tapis roulant 35 jours après la vaccination qui ne s’améliore pas dans la capacité de course 55 jours après la première vaccination. L’examen de sections semi-minces des nerfs sciatiques de souris EAN induites par des peptides révèle des zones de démyélinisation par rapport aux nerfs sciatiques de témoins sains du même âge.

Les images de microscopie électronique à transmission de puissance élevée permettent d’identifier des caractéristiques neuropathologiques spécifiques telles que la démyélinisation, les dommages à la lamelle de la myéline et les signes de stress axonal tels que le gonflement mitochondrial. Ces animaux présentent également des lésions axonales aiguës, comme en témoigne l’expression traumatique de la protéine précurseur de la bêta-amyloïde dans les nerfs sciatiques qui n’est pas observée dans les tissus témoins sains du même âge. Un élargissement des nœuds et une perturbation des paranœuds sont également observés.

Une fois maîtrisées, les injections sous-cutanées peuvent être effectuées en cinq à 10 minutes environ par souris avec un risque minimal d’erreur d’injection. Lors de cette procédure, il est très important que vous observiez le site d’injection pour vous assurer que tout l’inoculum reste à l’intérieur du site d’injection et qu’aucune partie ne s’échappe. La capture vidéo de la démarche sur tapis roulant est excellente car elle permet de calculer d’autres paramètres tels que la phase d’oscillation ou la longueur de la foulée, et ces mesures peuvent devenir importantes lors de l’évaluation de l’efficacité de nouvelles thérapies.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une très bonne compréhension de la façon d’induire l’EAN chez les souris mâles C57BL/6. De plus, vous devez avoir une très bonne compréhension de la façon de placer des injections sous-cutanées en toute sécurité et avec une grande précision, en vous assurant qu’il n’y a pas d’erreur d’injection. N’oubliez pas qu’en travaillant avec des aiguilles et de l’inoculum, il y a un risque de blessure, surtout lors de l’utilisation d’objets tranchants.

Donc, pour éviter tout risque de blessure, c’est une très bonne idée de toujours utiliser les forceps et de ne jamais saisir la peau ou les tissus à la main, ainsi que d’utiliser des seringues à usage unique, sans jamais reboucher dans le processus.