Une approche Simple pour induire une névrite auto-immune expérimentale chez la souris C57BL/6 pour les évaluations fonctionnelles et neuropathologiques
9 novembre 2017
Ce rapport présente une approche simple pour provoquer avec succès l’expérimental névrite auto-immune (EAN) à l’aide de la protéine de la myéline zéro (P0)180-199 peptide en combinaison avec adjuvant complet de Freund et la toxine coquelucheuse. Nous présentons un modèle sophistiqué capable d’évaluer avec précision l’ampleur des déficits fonctionnels et neuropathologie qui se produisent dans cette EAN.
L’objectif global de cette procédure est d’induire avec succès une névrite auto-immune expérimentale ou EAN dans un modèle murin pour l’analyse fonctionnelle et pathologique du processus de la maladie. Le modèle EAN peut être utilisé pour répondre à des questions clés relatives à la neuropathie périphérique. C’est aussi un merveilleux modèle pour étudier potentiellement l’efficacité de nouveaux agents thérapeutiques.
Le principal avantage de cette approche est qu’elle fournit un paradigme de test fonctionnel simple et objectif qui peut être appliqué lors de l’utilisation du modèle EAN dans la souris. Aujourd’hui, Sang Won Yoo, étudiant de premier cycle au laboratoire de biologie de la neurotrophine et de la myéline de l’Université de Melbourne, fait la démonstration de la procédure. Trois jours avant l’induction de la maladie, allumez l’appareil d’évaluation de la fonction motrice et allumez le bouton d’éclairage.
Prenez la souris et abaissez-la sur un récipient de colorant alimentaire rouge. Placez la souris dans le compartiment de marche et réglez la vitesse du tapis roulant sur 15 centimètres par seconde. Allumez le tapis roulant et cliquez sur enregistrer pour utiliser le système d’imagerie de la fonction de marche afin de capturer le mouvement de course de la souris pendant 36 secondes.
Après 36 secondes, arrêtez l’enregistrement et le tapis roulant et enregistrez le fichier vidéo de la course d’entraînement dans le dossier désigné. Un jour avant la première vaccination, utilisez une seringue de 0,5 millilitre munie d’une aiguille de calibre 30-1/2 pour administrer 1,6 microgramme par millilitre de toxine coqueluche dans 250 microlitres de PBS IP isotonique de souris à des souris mâles C57BL/6 âgées de six à huit semaines et anesthésiées. Ensuite, notez les souris pour les signes cliniques d’EAN sur une échelle de zéro à quatre selon le tableau et effectuez une évaluation de la fonction motrice comme nous venons de le démontrer.
Le lendemain, combinez des volumes égaux de solutions de peptide fraîchement préparées dans une solution saline à 0,9 % et 20 milligrammes par millilitre de Mycobacterium tuberculosis dans un adjuvant de Freund complet dans une perleuse à billes et mélangez les solutions à la vitesse maximale pendant une minute à température ambiante. Chargez une seringue équipée d’une aiguille de calibre 23 avec l’inoculum et retournez et secouez la seringue avant d’évacuer l’air à l’intérieur de la tige de la seringue. Avant d’administrer l’inoculum, retirez les poils juste latéralement à la ligne médiane entre les omoplates et désinfectez la peau exposée avec de l’éthanol à 70 %.
Ensuite, à l’aide d’une paire de pinces Adson, saisissez la peau et délivrez 50 microlitres de la solution à la souris injectée de toxine coqueluche par injection sous-cutanée. Le lendemain matin, administrez 1,2 microgramme par millilitre de toxine coqueluche dans 250 microlitres de PBS IP, comme nous venons de le démontrer, suivi d’une autre injection de 1,2 microgramme par millilitre de toxine coqueluche IP 48 heures plus tard. Trois jours plus tard, après la troisième injection de coqueluche, administrer 50 microlitres supplémentaires d’inoculum fraîchement préparé au même site d’injection qu’auparavant et surveiller le score clinique et la fonction motrice des animaux deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience.
L’EAN induite par le peptide P0 180-199 chez les souris C57BL/6 conduit à une maladie monophasique avec un score clinique débutant six jours après la première immunisation et une gravité maximale du score 25 jours après la première vaccination, suivie d’une certaine amélioration du score clinique 40 jours après la première vaccination. Les souris commencent à échouer à une simple tâche de course dès six jours après la première vaccination, avec une faible capacité à accomplir une simple tâche de course sur tapis roulant 35 jours après la vaccination qui ne s’améliore pas dans la capacité de course 55 jours après la première vaccination. L’examen de sections semi-minces des nerfs sciatiques de souris EAN induites par des peptides révèle des zones de démyélinisation par rapport aux nerfs sciatiques de témoins sains du même âge.
Les images de microscopie électronique à transmission de puissance élevée permettent d’identifier des caractéristiques neuropathologiques spécifiques telles que la démyélinisation, les dommages à la lamelle de la myéline et les signes de stress axonal tels que le gonflement mitochondrial. Ces animaux présentent également des lésions axonales aiguës, comme en témoigne l’expression traumatique de la protéine précurseur de la bêta-amyloïde dans les nerfs sciatiques qui n’est pas observée dans les tissus témoins sains du même âge. Un élargissement des nœuds et une perturbation des paranœuds sont également observés.
Une fois maîtrisées, les injections sous-cutanées peuvent être effectuées en cinq à 10 minutes environ par souris avec un risque minimal d’erreur d’injection. Lors de cette procédure, il est très important que vous observiez le site d’injection pour vous assurer que tout l’inoculum reste à l’intérieur du site d’injection et qu’aucune partie ne s’échappe. La capture vidéo de la démarche sur tapis roulant est excellente car elle permet de calculer d’autres paramètres tels que la phase d’oscillation ou la longueur de la foulée, et ces mesures peuvent devenir importantes lors de l’évaluation de l’efficacité de nouvelles thérapies.
Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une très bonne compréhension de la façon d’induire l’EAN chez les souris mâles C57BL/6. De plus, vous devez avoir une très bonne compréhension de la façon de placer des injections sous-cutanées en toute sécurité et avec une grande précision, en vous assurant qu’il n’y a pas d’erreur d’injection. N’oubliez pas qu’en travaillant avec des aiguilles et de l’inoculum, il y a un risque de blessure, surtout lors de l’utilisation d’objets tranchants.
Donc, pour éviter tout risque de blessure, c’est une très bonne idée de toujours utiliser les forceps et de ne jamais saisir la peau ou les tissus à la main, ainsi que d’utiliser des seringues à usage unique, sans jamais reboucher dans le processus.
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Aperçu
Cette étude présente une méthodologie permettant d'induire une névrite auto-immune expérimentale (EAN) chez la souris à l'aide du peptide de la protéine de myéline zéro (P0) 180-199, associé à l'adjuvant de Freund complet et à la toxine de la coqueluche. L'objectif est de faciliter une analyse fonctionnelle et pathologique de la neuropathie périphérique, afin d'obtenir des informations sur le processus de la maladie et sur des traitements potentiels.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Troubles auto-immuns
- Neuropathie périphérique
Contexte général
- La névrite auto-immune expérimentale (EAN) est un modèle pour l'étude des neuropathies périphériques.
- Le modèle est pratique pour évaluer de nouveaux agents thérapeutiques.
- Les tests fonctionnels pendant l'étude contribuent à une évaluation objective.
- Les évaluations comportementales clés incluent la fonction motrice et la notation clinique.
Objectif de l'étude
- Induire efficacement l'ENC chez les souris C57BL/6 à des fins de recherche.
- Analyser l'ampleur des déficits fonctionnels et de la neuropathologie.
- Mettre en place un protocole reproductible pour des études futures sur les neuropathies périphériques.
Méthodes utilisées
- La plateforme implique l'utilisation d'un tapis roulant et d'un système d'imagerie de la fonction de la démarche pour les évaluations fonctionnelles.
- Le modèle se concentre sur des souris mâles C57BL/6 pour le processus d'induction de la NEA.
- Aucun workflow multiomique n'a été mentionné dans l'étude.
- Le protocole comprend diverses injections sous-cutanées à des intervalles précisés après l'immunisation.
- Les évaluations de la fonction motrice sont réalisées plusieurs fois au cours de l'étude afin de surveiller l'évolution de la maladie.
Résultats principaux
- L'étude confirme un déroulement monophasique de la maladie, les symptômes cliniques atteignant un maximum 25 jours après l'immunisation.
- Des baisses fonctionnelles significatives dans l'exécution des tâches motrices sont observées du sixième au 35e jour.
- L'analyse neuropathologique révèle une démyélinisation et des lésions axonales chez les souris traitées par rapport aux témoins.
- Une expression accrue de la protéine précurseur du bêta-amyloïde indique une lésion axonale aiguë.
Conclusions
- La présente étude fournit un protocole clair et efficace pour induire l'EAN, facilitant ainsi la compréhension de la neuropathologie.
- Les connaissances acquises sur le processus de la maladie soutiennent les recherches futures sur des traitements potentiels des neuropathies périphériques.
- Ces résultats améliorent la compréhension des mécanismes auto-immuns affectant le système nerveux périphérique.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Ce protocole permet l'induction d'une névrite auto-immune expérimentale chez des souris C57BL/6, une souche pour laquelle de nombreux outils génétiques sont disponibles, facilitant ainsi l'analyse mécanistique et la réduction des risques associés à des candidats thérapeutiques ciblant la démyélinisation périphérique. Le modèle fournit des paramètres fonctionnels et neuropathologiques quantitatifs qui renforcent la fiabilité prédictive de l'évaluation préclinique des stratégies de réparation de la myéline et de neuroprotection. Sa reproductibilité et sa compatibilité avec les approches transgéniques en font un outil translationnel pour la validation de cibles dans la recherche sur les neuropathies périphériques auto-immunes.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation des mécanismes pathogènes dans la neuropathie périphérique auto-immune grâce à une activation immunitaire inductible, dirigée par un peptide, chez un hôte génétiquement modifiable.
- Valeur opérationnelle : Utilise le fond génétique C57BL/6, permettant l'intégration avec des modèles d'invalidation génique, d'insertion génique et de marqueurs rapporteurs pour l'identification causale et la réduction des risques liés aux cibles.
- Valeur prédictive : Facilite les tests d'hypothèses sur les voies de lésion nerveuse médiées par le système immunitaire, aidant ainsi à prendre des décisions précoces de poursuite ou d'abandon pour des candidats immunomodulateurs ou remyélinisants.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère un déclin fonctionnel quantifiable par analyse de la démarche sur tapis roulant, permettant une surveillance longitudinale des déficits moteurs en tant que biomarqueur pharmacodynamique.
- Valeur opérationnelle : La cotation clinique standardisée (échelle 0–4) et les immunisations chronométrées favorisent une induction reproductible de la maladie dans différentes cohortes d'étude.
- Préparation du test : Compatible avec une évaluation neuropathologique en aveugle, incluant le sectionnement semi-mince et la microscopie électronique, afin de valider l'interaction ciblée de composés neuroprotecteurs.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Recrée des caractéristiques neuropathologiques clés de la démyélinisation périphérique humaine, notamment des lésions axonales attestées par une protéine précurseur bêta-amyloïde élevée, soutenant ainsi la pertinence mécanistique.
- Continuité translationnelle : Permet l'évaluation de candidats thérapeutiques à travers les différentes phases de la maladie, depuis le début (jour 6) jusqu'au pic (jour 25) et à la phase de récupération (jour 40), fournissant ainsi des informations pour l'optimisation de la dose et du moment d'administration.
- Avancement ajusté au risque : Facilite l'évaluation de l'efficacité de la réparation de la myéline et de la neuroprotection, réduisant ainsi l'incertitude biologique avant les études préparatoires à une demande d'IND.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de cibles à l'identification de candidats médicaments, jusqu'aux tests d'efficacité préclinique, en particulier pour les produits biologiques ou les petites molécules visant à moduler les réponses auto-immunes ou à favoriser l'intégrité axonale dans la neuropathie périphérique.
- Découverte biologique : Soutient la dé-risqueisation mécanistique en permettant une induction contrôlée d'une auto-immunité spécifique du SNP afin de valider les cibles impliquées dans les interactions immunité-nerf.
- Écrantage : Fournit une plateforme standardisée pour évaluer les effets de composés sur la fonction motrice et la neuropathologie, avec des résultats compatibles avec l'imagerie et le scoring à haut contenu.
- Analytique : Génère des données fonctionnelles longitudinales (paramètres de démarche, longueur de foulée, phase de balancement) et des métriques histopathologiques finales permettant une analyse comparative entre les groupes de traitement.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans la validation préclinique en modélisant des caractéristiques chroniques récurrentes et une pathologie axonale pertinentes aux neuropathies périphériques humaines.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme immunologie-neurobiologie réutilisable pour tester de façon itérative des hypothèses thérapeutiques dans plusieurs projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique dans les modèles de neuropathie périphérique en permettant une induction précise et reproductible de la démyélinisation d'origine immunitaire et du stress axonal.
- Valeur opérationnelle : Un protocole défini d'immunisation et de rappels, combiné à des tests fonctionnels standardisés, améliore la reproductibilité entre laboratoires et réduit la variabilité.
- Valeur stratégique : Renforce la confiance dans les décisions d'aller/arrêt en fournissant dès les premiers stades des preuves quantifiables de la modulation de la cible dans un système pertinent pour la maladie.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation ajustée au risque des candidats démontrant des effets tant sur les paramètres fonctionnels que sur les critères neuropathologiques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des souris, les techniques d'injection sous-cutanée et la fixation par perfusion pour l'analyse neuropathologique.
- Dépend de l'accès à des systèmes d'imagerie de la marche sur tapis roulant et à du matériel pour la sectionnement semi-mince et la microscopie électronique.
- Exige une formation normalisée pour l'évaluation clinique et une évaluation en aveugle afin d'assurer la cohérence des données entre les opérateurs.
- Requiert un ajustement de la concentration du peptide et de la formulation de l'adjuvant lors d'une extrapolation à d'autres souches de souris en raison de la variabilité de la réponse immunitaire.
- Limité à un cours de maladie monophasique ; ne modélise peut-être pas les formes de neuropathie périphérique à rechutes-rémittences ou progressives chroniques sans modification du protocole.
