Méthodes d’étude des changements dans l’agrégation des protéines inhérente avec l’âge chez Caenorhabditis elegans

L’objectif général de cette expérience est de détecter les changements dans l’insolubilité des protéines avec l’âge chez C. elegans et d’évaluer comment l’inactivation génique ciblée influence ce marqueur de vieillissement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du vieillissement et de la protéostasie, telles que pourquoi les organismes ne parviennent pas à maintenir un protéome sain avec l’âge. Le principal avantage de cette technique est la possibilité d’étudier l’agrégation des protéines au cours du vieillissement normal en l’absence de processus pathologiques.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’agrégation des protéines chez C. elegans, elle peut également être adaptée à d’autres organismes modèles, par exemple pour étudier l’insolubilité des protéines liée à l’âge chez la souris. Pour commencer le traitement, ajoutez 207,45 millilitres de milieu basal S avec des réactifs supplémentaires tels que décrits dans le protocole de texte ci-joint à une fiole de culture Fernbach de 2 800 millilitres. Ajouter une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre de carbenicilline et un millimolaire d’IPTG et fermer le ballon à l’aide d’un bouchon à vis à membrane.

Sortez les L1 de l’incubateur à 25 degrés Celsius et transférez-les dans des tubes de 15 millilitres. Centrifugez les L1 à 1 900 fois g pendant trois minutes. Après l’essorage, retirez le surnageant.

Au microscope, comptez les L1 par deux microlitres et faites la moyenne des nombres obtenus à partir d’au moins neuf gouttes. Ensuite, ajoutez 50 000 vers pour la collection de jeunes vers et 100 000 vers pour la collection de vers âgés dans quatre flacons de culture Fernbach préparés à l’étape précédente. Ensuite, ajoutez les bactéries ARNi de contrôle et les bactéries ARNi pour le gène d’intérêt proportionnellement au nombre de vers.

Après avoir ajouté des bactéries, complétez la culture de vers avec S Basal pour porter le volume total à 300 millilitres. Incuber la culture de vers à 25 degrés Celsius dans un incubateur à secouer à 150 tr/min jusqu’à la collecte. Prélever de jeunes vers au deuxième ou au troisième jour pour mesurer les niveaux basaux de solubilité des protéines.

Versez les vers d’un flacon dans un entonnoir de séparation et laissez les vers sédimenter pendant 10 minutes à température ambiante. Une fois que les vers se sont sédimentés, ouvrez le robinet d’arrêt et versez les vers dans un tube de 50 millilitres. Ensuite, divisez la pastille de ver en deux tubes de 15 millilitres.

Remplissez les tubes à 15 millilitres avec M9 et centrifugez les vers. Pour laver les vers, retirez le surnageant et remplissez le tube jusqu’à 15 millilitres avec du M9. Répétez la centrifugation. Une fois le lavage terminé, transférez les vers dans deux tubes de 50 millilitres et utilisez du M9 glacé pour remplir le volume total à 20 millilitres.

Pour éliminer les bactéries et les vers morts, ajoutez les deux granulés de vers dilués de 20 millilitres à deux tubes de 50 millilitres remplis de 20 millilitres de saccharose glacé à 60 %. Centrifugez rapidement les tubes. À l’aide d’une pipette de 25 millilitres, retirez soigneusement jusqu’à 15 millilitres de la couche supérieure de vis sans fin.

Placez la couche supérieure de vers directement dans 37 millilitres de M9 plus octoxynol-9 préparés sur de la glace. Ensuite, centrifugez les tubes à 2 700 fois g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius, accélération neuf et décélération sept. Après avoir jeté le surnageant, transférez la pastille dans quatre tubes de 15 millilitres et lavez-les deux fois avec de la glace M9 plus octoxynol-9.

Ensuite, centrifugez les tubes. Retirez le surnageant et remplissez les tubes jusqu’à 15 millilitres avec du M9 glacé plus de l’octoxynol-9. Lavez les vers avec du M9 glacé et combinez les quatre tubes en deux tubes.

Remplissez les tubes à 15 millilitres et centrifugez. Retirez le surnageant, remplissez les deux tubes de M9 à température ambiante jusqu’à un volume total de quatre millilitres et faites-les pivoter sur un mélangeur à 25 degrés Celsius pendant 40 minutes. Après la nutation, lavez les vers deux fois avec du M9 glacé plus de l’octoxynol-9.

Ensuite, lavez-les deux fois avec du M9 et transférez les vers dans un tube. Lavez les vers dans le tampon de réassemblage ou le tampon d’extraction à haute teneur en sel RAB sans inhibiteurs avant la collecte. Retirez le surnageant jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de liquide sur la pastille de ver.

Ensuite, estimez le volume de la pastille de ver et ajoutez un volume identique de RAB avec des inhibiteurs. Préparez un tube de 50 millilitres à moitié rempli d’azote liquide sur de la glace sèche et, à l’aide d’une pipette Pasteur, aspirez les vers et vers-les lentement dans le tube. Laissez l’azote liquide s’évaporer et stockez les vers congelés à moins 80 degrés Celsius jusqu’à la suite du traitement.

Refroidissez le mortier avec de l’azote liquide et effectuez le débourrage des animaux sur de la glace sèche. Transférez les vers congelés dans le mortier pré-refroidi et broyez-les pendant 2,5 minutes. Ajoutez 100 millilitres d’azote liquide à la poudre et broyez pendant encore 2,5 minutes.

Utilisez un microscope pour vérifier que les corps des vers sont brisés en petits morceaux. Ensuite, transférez la poudre dans des tubes de deux millilitres et stockez-les à moins 80 degrés Celsius. Sur de la glace sèche, pesez deux fois 350 milligrammes de vers broyés par point temporel et par bactérie ARNi dans des tubes de deux millilitres.

Pour éliminer les protéines solubles à haute teneur en sel, ajoutez deux volumes par poids de RAB déjà préparé avec des inhibiteurs, un PMSF millimolaire, 200 unités par millilitre de DNase I et 100 microgrammes par millilitre de RNase A dans chaque tube et solubilisez la poudre sur de la glace. Aspirez la suspension dans une seringue d’un millilitre 15 fois et incubez-la sur de la glace pendant 10 minutes. Centrifugeuse à 18, 400 fois g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.

Traversez la couche de graisse et collectez le surnageant contenant des protéines solubles à haute teneur en sel dans un tube de deux millilitres par condition. Retirez le gras et jetez-le. Aliquote des protéines solubles à haute teneur en sel pour geler à moins 80 degrés Celsius.

Pour éliminer les lipides, solubilisez la pastille avec 700 microlitres de RAB avec des inhibiteurs contenant une molaire de saccharose sans DNase I et RNase A.Aspirez la suspension dans une seringue 10 fois et incubez-la sur de la glace pendant cinq minutes. Assurez-vous d’éliminer tous les surnageants et lipides et de les jeter. Pour éliminer les protéines solubles dans le SDS, solubilisez le granulé avec 700 microlitres de tampon RIPA.

Prélevez la suspension dans une seringue 10 fois et incubez-la pendant 10 minutes sur de la glace. Centrifugeuse à 18, 400 g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Prélever le surnageant contenant les protéines solubles dans le SDS et l’aliquote pour la congélation à moins 80 degrés Celsius.

Combinez deux échantillons de chaque condition après avoir solubilisé chaque pastille avec 500 microlitres de tampon RIPA et aspirez la suspension dans une seringue 10 fois. Veillez à retirer tout le surnageant et à le jeter. Solubiliser le granulé final contenant des protéines hautement insolubles avec 400 microlitres d’acide formique à 70 % et aspirer la suspension dans une seringue 20 fois.

Incuber la suspension pendant 20 minutes sur de la glace. Centrifuger la suspension dans des tubes à ultracentrifuger pour éliminer les débris de cuticule de ver. Récupérez le surnageant qui contient des protéines hautement insolubles et congelez-le à moins 80 degrés Celsius.

La coloration protéique totale de la teneur en protéines insolubles de vers jeunes et âgés a révélé une forte augmentation liée à l’âge des niveaux de protéines hautement insolubles chez les animaux témoins et non chez les animaux à longue durée de vie. La coloration par anticorps de PAB-1, une protéine de liaison à l’ARN avec un domaine de type prion prédit, a confirmé les données de spectrométrie de masse selon lesquelles les animaux à longue durée de vie maintenaient PAB-1 soluble avec l’âge. Une analyse in vivo a été réalisée sur des animaux transgéniques exprimant tagRFP PAB-1 dans les muscles pharyngés.

Chez les jeunes animaux, le tagRFP PAB-1 était principalement localisé de manière diffuse dans tout le pharynx. Avec l’âge, une accumulation progressive de ponctués brillants commençant dans le bulbe pharyngé postérieur. Au cours du vieillissement, nous avons également observé une agrégation dans le bulbe pharyngé antérieur chez un nombre croissant d’animaux.

La quantification des différents niveaux d’agrégation de TagRFP PAB-1 avec l’âge chez le type sauvage et le fond mutant daf-2 révèle une agrégation fortement retardée de TagRFP PAB-1 avec l’âge chez les animaux à longue durée de vie. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de collecter un grand nombre de vers pour l’extraction de protéines et comment isoler de gros agrégats hautement insolubles pour une analyse plus approfondie par spectrométrie de masse ou page SDS.