Induction et Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations dans le modèle murin
September 4th, 2017
Ce protocole montre l’induction de la maladie dans un modèle murin de malformation caverneuse cérébrale et utilisations contraste amélioré micro tomographie par ordinateur pour mesurer le fardeau de la lésion. Cette méthode améliore la valeur établie de modèles de souris pour étudier les bases moléculaires et des thérapies potentielles pour malformation caverneuse cérébrale et autres maladies cérébro-vasculaires.
L’objectif global de cette procédure est d’induire des malformations caverneuses cérébrales chez les souris néonatales et de mesurer le fardeau de la maladie à l’aide de la micro-tomodensitométrie. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies vasculaires cérébrales, telles que les malformations caverneuses cérébrales. Le principal avantage de cette technique est que le fardeau de la maladie des malformations caverneuses cérébrales dans les modèles murins néonatals peut être déterminé avec précision et efficacité par rapport aux méthodes existantes.
La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car l’induction de la malformation caverneuse cérébrale et les étapes d’analyse de la micro-tomodensitométrie sont difficiles à apprendre, car elles nécessitent de l’expérience et l’utilisation de logiciels sophistiqués. Commencez par dissoudre le 4-HT dans de l’éthanol à 100 % jusqu’à une concentration de 10 milligrammes par millilitre. Préparez des alaquads de 30 microlitres, puis conservez-les à moins 80 degrés Celsius.
Le jour de l’utilisation, diluez l’alaquad à 4-HT dans de l’huile de maïs à 0,5 milligramme par millilitre. Ensuite, à l’aide d’une seringue à insuline, injectez par introgastrique 50 microlitres de 4-HT dans des petits nouveau-nés P1 afin d’induire des lésions expérimentales de CCM. Commencez la préparation de l’échantillon en remplissant une seringue de 10 millilitres équipée d’une aiguille de calibre 29 avec trois millilitres de paraformaldéhyde à 2 % et de PBS.
Ensuite, effectuez une profusion intracardiaque sur un chiot P8 euthénisé en insérant l’aiguille dans le ventricule du cœur de la souris et en injectant lentement tout le volume de paraformaldéhyde. Après avoir utilisé des ciseaux pour détacher la tête, retirez la peau de la tête et décollez le crâne à l’aide d’une pince pour disséquer tout le cerveau en 4 % de paraformaldéhyde et de PBS. Après avoir fixé les cerveaux pendant la nuit à 4-HT degrés Celsius.
Le lendemain, détachez les cerveaux postérieurs à l’aide d’une pince et rincez avec une solution PBS. Ensuite, incubez les cerveaux postérieurs dans la solution iodée de Lugol, pendant 48 heures. Après l’incubation, faites sécher brièvement la cervelle postérieure à l’air libre pour éliminer l’excès de solution iodée de Lugol.
Ensuite, emballez les cerveaux postérieurs colorés à l’iode de Lugol dans des tubes de microcentrifugation de 0,65 microlitre et fermez-les complètement avec un film de paraffine plastique pour éviter le rétrécissement des tissus. Placez les tubes de microcentrifugation dans des tubes en plastique de cinq millilitres avec des éponges pour les empêcher de bouger pendant le balayage. Montez verticalement le tube contenant une mécervelle postérieure sur un support en aluminium dans le système micro-CT.
Définissez les paramètres de numérisation. Utilisez des projections de 540 et un temps d’exposition de deux secondes avec des conditions de source de 50 kilovolts et 10 watts pour acquérir les ensembles de données tomographiques. Les radiographies du balayage sont reconstruites automatiquement par un logiciel de reconstruction de projection basé sur le matériel, fourni par le système de micro-tomodensitométrie, produisant une série d’images de coupes axiales de 16 bits.
La micro-tomodensitométrie à contraste iodé de Lugol a suffisamment détecté les lésions de CCM. Des images radiographiques numérisées ont été reconstruites pour produire des images 3D du cerveau de la souris, ce qui a permis de visualiser des lésions entières dans le parenchyme cérébral, à différentes profondeurs et orientations, et d’évaluer la structure en 3D des lésions dans le cerveau. Ce tableau montre un exemple de production quantitative des lésions individuelles marquées.
Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des maladies vasculaires pour explorer le mécanisme et les options thérapeutiques des malformations caverneuses cérébrales dans des modèles murins. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’induire une lésion CCM dans des modèles murins, et comment acquérir et analyser la charge lésionnelle CCM avec la technique micro-CT.
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Aperçu
Ce protocole démontre l'induction de la maladie des malformations caverneuses cérébrales chez des souris néonatales et utilise la micro-CT pour mesurer la charge lésionnelle. Cette méthode améliore la compréhension de la base moléculaire et des thérapies potentielles pour la malformation caverneuse cérébrale et d'autres maladies cérébrovasculaires.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie vasculaire
- Modèles murins
Contexte
- Les malformations caverneuses cérébrales (MCC) sont des lésions vasculaires qui peuvent entraîner des problèmes neurologiques importants.
- Les méthodes existantes pour mesurer la charge de la maladie dans les modèles murins sont souvent inefficaces.
- La micro-CT offre un moyen non invasif de visualiser et de quantifier les lésions.
- La compréhension des MCC peut fournir des informations sur d'autres maladies cérébrovasculaires.
Objectif de l'étude
- Induire des malformations caverneuses cérébrales chez des souris néonatales.
- Mesurer avec précision la charge de la maladie à l'aide de la micro-CT.
- Améliorer les méthodologies pour étudier les maladies cérébrovasculaires.
Méthodes utilisées
- Dissociation du 4-HT dans l'éthanol pour créer une solution pour induire les MCC.
- Préparation d'aliquots pour stockage à -80 degrés Celsius.
- Utilisation de la micro-CT avec contraste pour l'imagerie.
- Démonstration visuelle du processus d'induction et d'analyse.
Résultats principaux
- La méthode permet une détermination précise et efficace de la charge de la maladie MCC.
- La micro-CT fournit une visualisation claire des lésions dans les modèles murins.
- L'induction des MCC a été réalisée avec succès chez les souris néonatales.
- Cette approche peut faciliter d'autres recherches sur les thérapies potentielles.
Conclusions
- Ce protocole améliore la valeur des modèles murins pour étudier les MCC.
- La micro-CT est un outil puissant pour évaluer la charge des maladies cérébrovasculaires.
- Des études futures peuvent s'appuyer sur cette méthodologie pour explorer les options thérapeutiques.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Quantitative micro-CT imaging of cerebral cavernous malformations (CCMs) in genetically engineered mouse models enables precise assessment of lesion burden, supporting mechanistic de-risking and target validation in cerebrovascular disease research. This approach enhances predictive confidence for early-stage therapeutic hypothesis testing and informs portfolio triage by providing robust, reproducible lesion quantification. Integration of high-resolution imaging with genetic disease models positions this workflow as a critical inflection point for translational continuity in vascular biology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous interrogation of CCM gene function and pathway involvement in disease models.
- Supports biological de-risking by quantifying lesion formation following targeted gene deletion.
- Provides functional target validation through direct measurement of disease-relevant phenotypes.
- Facilitates predictive confidence in selecting or deprioritizing molecular targets for further study.
Screening & Assay Development
- Establishes validated mouse models and imaging protocols for downstream compound screening.
- Delivers standardized, quantitative lesion metrics suitable for assay development and reproducibility assessment.
- Enables scalable, high-throughput evaluation of therapeutic interventions in preclinical settings.
- Supports reliable comparison of experimental conditions through consistent imaging outputs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with human disease genetics for translational biomarker development.
- Ensures continuity from genetic discovery to preclinical validation of therapeutic hypotheses.
- Reduces translational risk by providing quantitative endpoints for disease progression and intervention efficacy.
- Strengthens mechanistic understanding of cerebrovascular pathology relevant to clinical translation.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis-driven genetic manipulation and quantitative phenotyping in mouse models, supporting lead identification and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Facilitates null hypothesis testing and pathway clarification through genetic lesion induction and quantification.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Delivers volumetric and numerical lesion data to support statistical comparison across experimental groups.
- Translational Research: Connects genetic models to disease-relevant endpoints for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform for diverse cerebrovascular research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes lesion quantification and imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by providing robust preclinical data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of vascular disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genetic mouse model handling and micro-CT imaging protocols.
- Demands access to high-resolution micro-CT instrumentation and specialized analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and data interpretation.
- May require adaptation of protocols for different genetic backgrounds or lesion types.
- Dependent on precise sample preparation and imaging conditions to ensure data quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Induction of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Models
1:38
Sample Preparation for Micro-CT Scans
3:15
Micro-CT Scan of CCM in the Neonatal Mouse Brain
3:57
Results: Rendered 3-D Images Showing CCM Lesions in the Neonatal Mouse
4:34
Conclusion
