Induction et Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations dans le modèle murin
4 septembre 2017
Ce protocole montre l’induction de la maladie dans un modèle murin de malformation caverneuse cérébrale et utilisations contraste amélioré micro tomographie par ordinateur pour mesurer le fardeau de la lésion. Cette méthode améliore la valeur établie de modèles de souris pour étudier les bases moléculaires et des thérapies potentielles pour malformation caverneuse cérébrale et autres maladies cérébro-vasculaires.
L’objectif global de cette procédure est d’induire des malformations caverneuses cérébrales chez les souris néonatales et de mesurer le fardeau de la maladie à l’aide de la micro-tomodensitométrie. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies vasculaires cérébrales, telles que les malformations caverneuses cérébrales. Le principal avantage de cette technique est que le fardeau de la maladie des malformations caverneuses cérébrales dans les modèles murins néonatals peut être déterminé avec précision et efficacité par rapport aux méthodes existantes.
La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car l’induction de la malformation caverneuse cérébrale et les étapes d’analyse de la micro-tomodensitométrie sont difficiles à apprendre, car elles nécessitent de l’expérience et l’utilisation de logiciels sophistiqués. Commencez par dissoudre le 4-HT dans de l’éthanol à 100 % jusqu’à une concentration de 10 milligrammes par millilitre. Préparez des alaquads de 30 microlitres, puis conservez-les à moins 80 degrés Celsius.
Le jour de l’utilisation, diluez l’alaquad à 4-HT dans de l’huile de maïs à 0,5 milligramme par millilitre. Ensuite, à l’aide d’une seringue à insuline, injectez par introgastrique 50 microlitres de 4-HT dans des petits nouveau-nés P1 afin d’induire des lésions expérimentales de CCM. Commencez la préparation de l’échantillon en remplissant une seringue de 10 millilitres équipée d’une aiguille de calibre 29 avec trois millilitres de paraformaldéhyde à 2 % et de PBS.
Ensuite, effectuez une profusion intracardiaque sur un chiot P8 euthénisé en insérant l’aiguille dans le ventricule du cœur de la souris et en injectant lentement tout le volume de paraformaldéhyde. Après avoir utilisé des ciseaux pour détacher la tête, retirez la peau de la tête et décollez le crâne à l’aide d’une pince pour disséquer tout le cerveau en 4 % de paraformaldéhyde et de PBS. Après avoir fixé les cerveaux pendant la nuit à 4-HT degrés Celsius.
Le lendemain, détachez les cerveaux postérieurs à l’aide d’une pince et rincez avec une solution PBS. Ensuite, incubez les cerveaux postérieurs dans la solution iodée de Lugol, pendant 48 heures. Après l’incubation, faites sécher brièvement la cervelle postérieure à l’air libre pour éliminer l’excès de solution iodée de Lugol.
Ensuite, emballez les cerveaux postérieurs colorés à l’iode de Lugol dans des tubes de microcentrifugation de 0,65 microlitre et fermez-les complètement avec un film de paraffine plastique pour éviter le rétrécissement des tissus. Placez les tubes de microcentrifugation dans des tubes en plastique de cinq millilitres avec des éponges pour les empêcher de bouger pendant le balayage. Montez verticalement le tube contenant une mécervelle postérieure sur un support en aluminium dans le système micro-CT.
Définissez les paramètres de numérisation. Utilisez des projections de 540 et un temps d’exposition de deux secondes avec des conditions de source de 50 kilovolts et 10 watts pour acquérir les ensembles de données tomographiques. Les radiographies du balayage sont reconstruites automatiquement par un logiciel de reconstruction de projection basé sur le matériel, fourni par le système de micro-tomodensitométrie, produisant une série d’images de coupes axiales de 16 bits.
La micro-tomodensitométrie à contraste iodé de Lugol a suffisamment détecté les lésions de CCM. Des images radiographiques numérisées ont été reconstruites pour produire des images 3D du cerveau de la souris, ce qui a permis de visualiser des lésions entières dans le parenchyme cérébral, à différentes profondeurs et orientations, et d’évaluer la structure en 3D des lésions dans le cerveau. Ce tableau montre un exemple de production quantitative des lésions individuelles marquées.
Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des maladies vasculaires pour explorer le mécanisme et les options thérapeutiques des malformations caverneuses cérébrales dans des modèles murins. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’induire une lésion CCM dans des modèles murins, et comment acquérir et analyser la charge lésionnelle CCM avec la technique micro-CT.
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Aperçu
Ce protocole décrit l'induction de la maladie des malformations caverneuses cérébrales chez des souriceaux néonatals et utilise la micro-TDM pour mesurer la charge lésionnelle. Cette méthode améliore la compréhension des bases moléculaires et des thérapies potentielles des malformations caverneuses cérébrales ainsi que d'autres affections cérébrovasculaires.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie vasculaire
- Modèles murins
Contexte
- Les malformations vasculaires caverneuses cérébrales (CCM) sont des lésions vasculaires pouvant entraîner des troubles neurologiques importants.
- Les méthodes existantes pour mesurer la charge de la maladie chez les modèles murins sont souvent inefficaces.
- La micro-TDM offre un moyen non invasif de visualiser et de quantifier les lésions.
- Comprendre les CCM peut fournir des informations sur d'autres maladies cérébrovasculaires.
Objectif de l'étude
- Induire des malformations cavernomateuses cérébrales chez des souriceaux néonatals.
- Mesurer avec précision la charge pathologique à l’aide de micro-CT.
- Améliorer les méthodologies d’étude des maladies cérébrovasculaires.
Méthodes utilisées
- Dissoudre le 4-HT dans de l'éthanol pour créer une solution permettant d'induire les CCM.
- Préparation d'aliqotes destinées à être stockées à -80 degrés Celsius.
- Utilisation de la micro-TDM avec contraste pour l'imagerie.
- Démonstration visuelle du processus d'induction et d'analyse.
Résultats principaux
- La méthode permet une détermination précise et efficace de la charge pathologique de la maladie des CCM.
- La micro-TDM offre une visualisation claire des lésions dans les modèles murins.
- L'induction de CCM a été réalisée avec succès chez des souris néonatales.
- Cette approche peut faciliter des recherches supplémentaires sur des thérapies potentielles.
Conclusions
- Ce protocole augmente la valeur des modèles murins pour l'étude des malformations caverneuses cérébrales (CCM).
- La micro-TDM est un outil puissant pour évaluer la charge liée aux maladies cérébrovasculaires.
- Des études futures pourront s'appuyer sur cette méthodologie afin d'explorer des options thérapeutiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'imagerie micro-CT quantitative des malformations caverneuses cérébrales (CCM) chez des modèles murins génétiquement modifiés permet une évaluation précise de la charge lésionnelle, facilitant ainsi l'identification des mécanismes et la validation des cibles dans la recherche sur les maladies cérébrovasculaires. Cette approche renforce la confiance prédictive lors des tests hypothétiques thérapeutiques en phase précoce et oriente le tri des projets en fournissant une quantification robuste et reproductible des lésions. L'intégration d'images haute résolution à des modèles génétiques de maladie positionne ce flux de travail comme un point d'inflexion essentiel pour la continuité translationnelle dans les voies de biologie vasculaire.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet une interrogation rigoureuse de la fonction des gènes CCM et de leur implication dans les voies associées aux modèles de maladie.
- Contribue à la réduction des risques biologiques en quantifiant la formation de lésions après une délétion ciblée de gène.
- Assure une validation fonctionnelle des cibles grâce à la mesure directe de phénotypes pertinents pour la maladie.
- Facilite une prédiction fiable pour la sélection ou la dé-priorisation de cibles moléculaires en vue d'études ultérieures.
Développement de criblages et de tests
- Établit des modèles murins validés et des protocoles d'imagerie destinés au criblage de composés en aval.
- Fournit des métriques quantitatives normalisées des lésions, adaptées au développement de tests et à l'évaluation de la reproductibilité.
- Permet une évaluation évolutive et à haut débit d'interventions thérapeutiques en contexte préclinique.
- Facilite la comparaison fiable des conditions expérimentales grâce à des résultats d'imagerie cohérents.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les modèles précliniques avec la génétique des maladies humaines pour le développement de biomarqueurs translationnels.
- Assure la continuité entre la découverte génétique et la validation préclinique des hypothèses thérapeutiques.
- Réduit le risque de translation en fournissant des critères d'évaluation quantitatifs sur l'évolution de la maladie et l'efficacité des interventions.
- Renforce la compréhension mécanistique des pathologies cérébrovasculaires en lien avec la translation clinique.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode fait le lien entre la découverte précoce et la recherche préclinique en permettant une manipulation génétique guidée par des hypothèses et un phénotypage quantitatif chez les modèles murins, soutenant ainsi l'identification de candidats thérapeutiques et l'alignement de biomarqueurs translationnels.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'une hypothèse nulle et la clarification des voies biologiques par l'induction et la quantification de lésions génétiques.
- Criblage : Fournit des images reproductibles et quantitatives pour évaluer la préparation des tests et l'efficacité des composés.
- Analyse : Fournit des données numériques et volumétriques sur les lésions afin de permettre des comparaisons statistiques entre groupes expérimentaux.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les modèles génétiques et des critères d'évaluation pertinents pour la maladie, assurant une continuité préclinique.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une plateforme d'imagerie et d'analyse réutilisable pour divers programmes de recherche en biologie vasculaire cérébrale.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Augmente la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Standardise la quantification des lésions et les protocoles d'imagerie pour assurer la reproductibilité et l'évolutivité.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'orientation (go/no-go) et améliore l'efficacité du capital en fournissant des données précliniques solides.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation et l'avancement, ajustés au risque, des programmes de maladies vasculaires.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des modèles murins génétiques et les protocoles d'imagerie par micro-TDM.
- Exige un accès à un équipement de micro-TDM haute résolution et à un logiciel d'analyse spécialisé.
- Implique une standardisation interéquipes des paramètres d'imagerie et de l'interprétation des données.
- Peut nécessiter l'adaptation des protocoles à différents fonds génétiques ou types de lésions.
- Dépend d'une préparation précise des échantillons et de conditions d'imagerie rigoureuses pour garantir la qualité des données.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Induction of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Models
1:38
Sample Preparation for Micro-CT Scans
3:15
Micro-CT Scan of CCM in the Neonatal Mouse Brain
3:57
Results: Rendered 3-D Images Showing CCM Lesions in the Neonatal Mouse
4:34
Conclusion
