Préparation des échantillons et l’imagerie des Exosomes par microscopie électronique à Transmission

L’objectif général de cette procédure est d’observer la morphologie des vésicules extracellulaires purifiées et d’effectuer une localisation spécifique des protéines dans les vésicules extracellulaires à l’aide de la microscopie électronique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la période de recherche sur les vésicules extracellulaires, telles que la catégorisation de l’exosome et des protéines spécifiques situées à l’intérieur de celui-ci. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’observer la portion de protéines spécifiques située à l’intérieur et à l’extérieur de l’exosome.

L’implication de cette technique est d’assurer le diagnostic de plusieurs maladies, y compris le cancer et les infections bactériennes. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l’exosome, elle peut également être appliquée à d’autres échantillons biologiques, à l’incubation microcellulaire et à la localisation de protéines spécifiques. En général, les personnes novices dans cette méthode auront du mal à créer une contamination lors de la liaison non spécifique de la particule d’immunogold.

À l’aide de techniques standard, préparer les exosomes en culture. Ensuite, ultracentrifugez le surnageant de culture des cellules HCT116 pour granuler les exosomes du milieu. Une fois granulé, retirez soigneusement le surnageant de culture.

Pour fixer la pastille d’exosome purifiée, ajoutez un millilitre de glutaraldéhyde à 2,5 % dans une solution de cacodylate de soldium à 0,1 molaire à PH 7,0. Incuber les vésicules de la couche secondaire lipidique pendant une heure à quatre degrés Celsius. Ensuite, retirez le fixateur et rincez les granules avec un millilitre d’une solution tampon de cacodylate de sodium 0,1 molaire à température ambiante pendant 10 minutes.

Ensuite, postfixez les échantillons avec un millilitre de tétroxyde d’osmium à 2 % pendant une heure à quatre degrés Celsius. Retirez le fixateur et rincez la pastille d’exosome trois fois avec le tampon de cacodylate de sodium de 0,1 molaire, en changeant le tampon toutes les dix minutes. Ensuite, déshydratez l’échantillon en l’agitant pendant 10 minutes chacune dans une série de concentrations d’acétone graduées.

Ensuite, mélangez une solution composée de trois parties d’acétone et d’une partie de mélange d’enrobage à faible viscosité. Remplacez l’acétone par ce mélange et incubez l’échantillon pendant 30 minutes. Continuez à augmenter le rapport du milieu d’enrobage à faible viscosité, en incubant pendant 30 minutes à chaque étape.

Enfin, incubez la pastille d’exosome dans 100 % du mélange d’enrobage à faible viscosité pendant la nuit à température ambiante. Le lendemain, incorporez l’échantillon dans un mélange d’enrobage pur à faible viscosité à l’aide d’un moule d’enrobage et faites-le cuire pendant 24 heures à 65 degrés Celsius. À l’aide d’un ultramicrotome, préparez des sections d’une épaisseur de 60 nanomètres.

Placez les sections sur une grille en nickel et colorez deux fois certaines d’entre elles avec de l’acétate d’uranyle à 2 % pendant 20 minutes, puis avec du citrate de plomb pendant 10 minutes. Ensuite, placez la section colorée dans un microscope électronique à transmission et visualisez l’échantillon à l’aide de 80 kilovolts et suivez les réglages automatiques pour le temps d’exposition. Avec une image d’exosome en vue, acquérez et enregistrez l’image à l’aide du logiciel du microscope.

Pour commencer, incubez des grilles contenant des sections non colorées de 60 nanomètres d’épaisseur dans des gouttes de 50 microlitres de glycine à 0,02 molaire pendant 10 minutes pour tremper les groupes aldéhydes libres. Ensuite, rincez les sections dans 100 microlitres d’eau distillée trois fois pendant 10 minutes chacune. Après le dernier rinçage, incuber les sections pendant une heure à température ambiante dans du PBS contenant 1 % de BSA.

Ensuite, incubez les grilles en gouttes de 50 à 100 microlitres d’un anticorps anti-KRS pendant une heure. Ensuite, lavez les grilles cinq fois pendant 10 minutes chacune dans une goutte de PBS contenant 0,1 % BSA. Ensuite, transférez les grilles dans une goutte d’un anticorps secondaire approprié et incubez les sections pendant une heure à température ambiante.

Maintenant, lavez les grilles cinq fois pendant 10 minutes, chacune avec une goutte distincte de PBS contenant 0,1 % BSA. Colorez deux fois les sections avec de l’acétate d’uranyle à 2 % pendant 20 minutes dans l’obscurité, puis avec du citrate de plomb Reynolds pendant 10 minutes. Placez la section colorée dans un microscope électronique à transmission et visualisez l’échantillon à l’aide de 80 kilovolts et imagez-les comme indiqué précédemment.

Afin d’effectuer une coloration négative, fixez les exosomes purifiés après isolement avec un millilitre de paraformaldéhyde à 2 % pendant cinq minutes. Traitez des grilles EM en cuivre minces, recouvertes d’un film de formvar/carbone, de 200 mailles, avec décharge luminescente pendant une minute, puis chargez cinq à sept microlitres de la solution de suspension d’exosomes sur une grille et incubez-la pendant une minute. Si la concentration d’exosome est trop élevée, diluez-la à un niveau approprié.

Colorez immédiatement les exosomes avec environ 20 gouttes d’une solution d’acétate d’uranyle filtrée à 1 % à la surface de la grille EM. Retirez l’excès de solution d’acétate d’uranyle de la grille en contactant le bord de la grille avec du papier filtre, puis rincez rapidement la grille avec une goutte d’eau. À l’aide d’une pince à épiler, placez la grille sur la table et recouvrez partiellement la grille avec une boîte de culture.

Laissez la grille sécher pendant 10 minutes à température ambiante, puis imagez-la ou rangez-la dans une boîte de grille de microscope électronique pour une observation future. Commencez par traiter les grilles EM en cuivre de 200 mailles recouvertes d’un mince film de formvar/carbone avec décharge lumineuse pendant 30 secondes. Ensuite, chargez cinq à sept microlitres d’exosomes fixés dans une solution de paraformaldéhyde à 2 % sur la grille et incuberez-les pendant cinq minutes.

Ensuite, rincez les exosomes avec 100 microlitres de PBS, trois fois chacune pendant 10 minutes. Traitez les grilles contenant des exosomes avec 50 microlitres d’une solution de glycine à 0,5 molaire pendant 10 minutes pour éteindre les groupes aldéhydes libres. Ensuite, transférez les grilles sur une goutte de PBS contenant 1 % BSA et bloquez pendant 30 minutes.

Incuber maintenant les grilles avec 50 à 100 microlitres d’anticorps anti--L1 pendant une heure à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Lavez la grille avec cinq gouttes distinctes de PBS contenant 0,1 % de BSA pendant 10 minutes chacune, puis transférez la grille sur une goutte de l’anticorps secondaire pendant une heure. Ensuite, lavez la grille avec cinq gouttes distinctes de PBS contenant 0,1 % de BSA pendant 10 minutes chacune, puis lavez la grille avec deux gouttes distinctes d’eau distillée.

Une fois terminé, effectuez une coloration négative avec de l’acétate d’uranyle à 2 %, comme indiqué précédemment, et imagez les échantillons, ou stockez-les dans une boîte de grille EM pour une observation future. La morphologie des exosomes observée ici est le produit d’une coloration négative. Ces exosomes présentent une morphologie typique en forme de coupe, qui est un artefact qui peut se produire pendant le processus de séchage.

Des informations supplémentaires peuvent être obtenues à l’aide de la coloration immunogold de l’ensemble du mont, comme l’emplacement de protéines spécifiques dans l’exosome. Ici, les flèches blanches indiquent l’emplacement de-L1. Dans les images en coupe, les vésicules ont montré une structure lumineuse connue comme une caractéristique structurelle des exosomes.

Ceux-ci peuvent également être colorés à l’immunogold pour identifier des protéines spécifiques dans les exosomes. Une fois maîtrisée, la technique de coloration à l’immunogold peut être réalisée dans des cellules fibreuses après une simple préparation et sectionnement si elle est réalisée correctement. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la double immunocoloration peuvent être effectuées pour identifier simultanément l’emplacement de deux protéines différentes.

Après chaque développement, cette technique peut être utilisée dans le domaine des vésicules extracellulaires pour explorer les diagnostics de maladies dans les biopsies. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’identifier la localisation spécifique des protéines dans l’exosome. N’oubliez pas qu’ils travaillent avec des solutions fixatrices, telles que le chlorhydrate, le paraformaldéhyde et le tétroxyde d’osmium peuvent être extrêmement dangereux et des précautions telles qu’une hotte ventilée et des gants en latex doivent toujours être prises lors de cette procédure.