Un modèle trophoblastiques humaines primaires pour étudier l’effet de l’Inflammation associées à l’obésité maternelle sur la réglementation de l’autophagie dans le Placenta

L’objectif global de ce modèle de culture cellulaire de trophoblaste est de mesurer l’effet de l’inflammation liée à l’obésité sur la régulation des voies critiques dans les trophoblastes. Le principal avantage de ce système de contrôle est qu’il établit une relation entre l’inflammation médiée par le TNF alpha et la régulation des gènes dans le placenta dans le contexte de l’obésité maternelle. Le principal avantage de ce système expérimental est qu’il établit des relations entre l’inflammation médiée par le TNF-alpha et la régulation des gènes dans le placenta dans le contexte de l’obésité maternelle.

Bailey Simon et Matt Bucher, des techniciens de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Le tissu villeux doit être prélevé dans le placenta dès que possible après l’accouchement, de préférence dans les 30 minutes ou moins. Avec la plaque choriale vers le haut, utilisez des pinces et des ciseaux pour exciser, au hasard, deux à trois sections de pleine épaisseur, à deux ou trois centimètres de la périphérie du placenta.

Évitez les parties du placenta qui semblent anormales. Coupez les plaques choriales et basales et tous les gros vaisseaux sanguins. Placez le tissu villeux obtenu dans un milieu chaud et complet.

Dans les 30 minutes suivant l’échantillonnage de tissu villositaire, commencer l’isolement du trophoblaste. Placez chaque morceau de tissu villeux dans un tube conique de 50 millilitres rempli de PBS à température ambiante et agitez doucement pour libérer l’excès de sang dans le tissu. Décantez le PBS et remplacez-le par du PBS frais.

Répétez le rinçage PBS jusqu’à ce que la majeure partie de l’excès de sang soit éliminée. Le rinçage PBS sera rouge clair ou rose lorsque le tissu sera soigneusement rincé. Placez le tissu villeux dans une boîte de Pétri stérile et retirez autant de vaisseaux sanguins que possible à l’aide d’une lame de microscope pour gratter doucement le tissu villeux mou des vaisseaux.

À l’aide de ciseaux, émincez finement le tissu villeux obtenu. Transférez le tissu villeux haché dans une bouteille stérile avec une solution de digestion selon les volumes calculés en fonction de l’activité spécifique de la trypsine et de la DNase. Incuber la bouteille de digestion dans un bain-marie à 37 degrés Celsius en secouant à 70 tr/min pendant 35 minutes.

Après 35 minutes, inclinez la bouteille de digestion sur le côté et laissez les morceaux de tissu non digérés se déposer au fond de la bouteille. Prélevez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique, en évitant le tissu stabilisé. Distribuez le surnageant à travers une crépine à cellules de 100 microns à parts égales entre des tubes coniques de 50 millilitres.

Commencez la deuxième digestion en ajoutant la solution de digestion au tissu restant et en incubant la bouteille dans le bain-marie à 37 degrés Celsius. Superposez doucement trois à cinq millilitres de sérum de veau nouveau-né, ou NCS, sous le surnageant filtré dès la première digestion en distribuant lentement à partir d’une pipette sérologique au fond du tube. Un ménisque entre le surnageant tendu contenant les trophoblastes et le NCS doit être visible.

Centrifuger les surnageants sur NCS à 1, 250 fois g à 20 degrés Celsius pendant 15 minutes. La pastille résultante comprendra des globules rouges dans la couche la plus basse, suivie d’une couche blanche contenant des cellules trophoblastiques. De la même manière, filtrez le surnageant à partir de la deuxième et de la troisième digestion.

Appliquez du NCS sous le surnageant filtré et centrifugez à 1 250 fois g à 20 degrés Celsius pendant 15 minutes. Une fois que tous les surnageants ont été centrifugés et que les couches de NCS et de surnageant ont été éliminées, remettre chaque pastille en suspension dans cinq millilitres de milieu chaud et complet, puis regrouper les suspensions. Répartissez la suspension cellulaire à parts égales entre deux tubes coniques de 50 millilitres et centrifugez à 1, 250 fois g à 20 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Retirez délicatement le surnageant et remettez en suspension chacune des pastilles de cellules dans six millilitres de milieu chaud et complet. Pour commencer cette procédure, divisez la suspension cellulaire en quatre gradients de densité à l’aide d’une pipette de transfert pour superposer lentement et soigneusement la suspension cellulaire sur les gradients de densité. Centrifuger les gradients de densité à 1, 250 fois g à 20 degrés Celsius pendant 20 minutes avec une accélération et une décélération minimales.

Cela devrait produire des bandes distinctes de cellules sédimentées. Retirez lentement et soigneusement la couche supérieure du média à gradient de densité jusqu’à ce que la bande opaque contenant les cellules trophoblastiques soit atteinte. Transférez les bandes trophoblastiques dans deux tubes coniques de 50 millilitres et remplissez-les de milieu chaud et complet.

Retournez doucement les tubes trois à six fois pour mélanger et centrifugez à 1 250 fois g à 20 degrés Celsius pendant 15 minutes. Retirez le surnageant et remettez en suspension chaque pastille cellulaire dans cinq millilitres de milieu chaud et complet. Combinez les suspensions cellulaires et comptez les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre et de trypan blue.

L’étape suivante après le comptage des cellules consiste à plaquer les cellules. Plaquez trois millions de cellules par puits dans chaque plaque de six puits. Balancez doucement la plaque d’avant en arrière et d’un côté à l’autre pour répartir uniformément les cellules.

Laissez les cellules plaquées dans l’évent d’écoulement laminaire pendant environ 30 minutes pour permettre aux cellules de se répartir uniformément, de se déposer et de commencer à adhérer au fond des puits. Après 30 minutes, placez les assiettes dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’humidité. Examinez les trophoblastes au microscope après 24 heures de culture pour confirmer l’attachement et la bonne morphologie du trophoblaste.

Les cellules peuvent être traitées après 24 heures de culture. Aspirez le milieu de culture des cellules et remplacez-le par deux millilitres de milieu supplémenté en TNF alpha par puits. Remettez les plaques dans l’incubateur à 37 degrés Celsius.

Après 24 heures d’exposition au TNF alpha, remplacer le milieu supplémenté en TNF alpha par un milieu complet. Incuber pendant encore 24 heures. 24 heures après l’élimination du TNF alpha, aspirez le milieu et rincez doucement les cellules avec du PBS à température ambiante.

Ajouter directement à chaque puits 80 microlitres de tampon de dosage de radio-immunoprécipitation glacé contenant des inhibiteurs de protéase et de phosphatase fraîchement ajoutés. Retirez les cellules de la plaque à l’aide d’un grattoir à cellules. Transférez les cellules dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre, en regroupant les puits au sein des groupes de traitement.

Glacez les cellules en faisant tourbillonner les tubes à fond pendant au moins trois intervalles de 15 secondes. Incuber les cellules à quatre degrés Celsius en les balançant pendant 15 minutes. Vortex les tubes à nouveau en haut.

Centrifuger à 10 000 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour granuler les débris cellulaires. Transférez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Conservez les échantillons de protéines cellulaires à 80 degrés Celsius jusqu’à ce que la protéine d’intérêt soit analysée par Western blot.

Après 72 heures de culture, l’analyse immunocytochimique de la cytokératine 7, en rouge, dans les trophoblastes primaires confirme que les cellules ont subi une syncytialisation mise en évidence par la présence de masses cellulaires multinucléées. De plus, l’analyse immunocytochimique de la vimentine, également en rouge, a révélé très peu de fibroblastes contaminants. La contre-coloration nucléaire est représentée en bleu dans les deux images.

Traitement avec TNF alpha jusqu’à 250 picogrammes par millilitre d’expression du rubicon régulée à la hausse. À des concentrations de TNF alpha supérieures à 250 picogrammes par millilitre, les niveaux d’expression du rubicon ont diminué vers la ligne de base et même en dessous. De même, le rubicon est significativement régulé à la hausse dans les biopsies de tissus villeux congelés à partir de placentas de grossesses obèses avec des fœtus féminins par rapport aux témoins maigres.

Une fois maîtrisé, l’isolement des trophoblastes du tissu villositaire peut être effectué en six à sept heures s’il est effectué correctement. Lors de cette procédure, il est important de préparer les matériaux et les réactifs à l’avance afin de pouvoir travailler délibérément et efficacement. À la suite de cette procédure, d’autres tests, tels que ceux qui mesurent la bioénergétique cellulaire, peuvent être effectués pour répondre à des questions supplémentaires, comme l’inflammation dans l’environnement intra-utérin obèse affecte-t-elle la capacité métabolique des trophoblastes ?

Après cela, cette méthode de développement a ouvert la voie aux chercheurs placentaires pour établir l’effet de l’environnement maternel sur la fonction trophoblastique. Après avoir regardé cette vidéo, vous aurez une bonne compréhension de la façon d’isoler les trophoblastes du tissu villeux pour votre expérience de culture cellulaire et de déterminer l’effet de l’inflammation médiée par le TNF alpha dans la régulation des voies critiques dans les trophoblastes. N’oubliez pas que travailler avec des tissus humains, des cellules cultivées, du DMSO, de l’acrylamide et des réactifs réducteurs peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port d’un EPI approprié et l’utilisation d’une technique aseptique, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.