Name: Le nématode Caenorhabditis Elegans - un modèle polyvalent In Vivo pour étudier les Interactions hôtes-microorganismes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Découvrez comment étudier les infections fongiques chez Caenorhabditis elegans pour explorer la virulence pathogène et les réponses immunitaires de l'hôte. Cette méthode rapide et économique facilite la découverte de nouveaux antimicrobiens.

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Ce travail a été effectué à et soutenu par Worcester Polytechnic Institute.

1. préparation du nématode à croissance moyenne (NGM) <ol><li>pour 1 L de médias, mélanger 20 g de gélose, source d’azote organique 2,5 g (p. ex., bacto-peptone) et 3 g de chlorure de sodium dans un flacon de 2 L. Ajouter 975 mL d’eau stérile.
	<ol><li>Add dans un bar d’agitation stérile. Si vous utilisez un bec verseur automatique de médias, les tubes de l’autoclave et les médias pendant 15 min ; médias devrait être stérilisés à l’autoclave pour plus si un volume plus élevé est en.</li>
	</ol></li> <li>Set médias sur plaque de remuer et laisser pour refroidir.
	<ol><li>Une fois que le média est chaud au toucher (environ 60 ° C) aseptiquement ajouter 1 mL de 1 M MgSO 4 &#9679; H 2 O, 1 mL de 1 M CaCl 2, 25 mL de KPO 4 et 1 mL de cholestérol de 0,5 % dans l’éthanol.</li>
		<li>Verser médias (à la main ou par pompe automatique) sous hotte à flux laminaire dans 35 x 10 mm plats de Pétri stériles. Laisser pour sécher sous capot pendant 1 à 2 jours avant l’utilisation. 
		Remarque : Les plaques doivent être conservés à 4 ° C pour éviter la contamination.</li>
	</ol></li></ol> 2. Faire un ver Pick <ol><li>coupe un morceau de 1,5 cm de fil d’aluminium. Insérez avec précaution environ 0,5 cm de cette longueur dans l’embout de la pipette Pasteur.
	<ol><li>à l’aide d’un bec Bunsen ou la lampe à alcool, faire fondre l’embout de la pipette de verre en tournant lentement dans la flamme jusqu'à ce que le fil est fermement adhéré à la pipette, sans pour autant compromettre la forme originale de l’embout de la pipette.</li>
	</ol></li></ol> 3. Préparation de la Culture d’e. coli <ol><li>à l’aide d’une anse stérile, ensemencer la seule colonie d’e. coli de souche OP50 dans 200 mL de bouillon de Luria. Incuber pendant la nuit, avec agitation à 37 ° C.</li>
	<li>La culture liquide est prêt à être utilisé le jour suivant et peuvent être conservée à 4 ° C quand pas en service. 
	Remarque : La souche e. coli, OP50, est utilisée comme source de nourriture pour elegans de c. Cette culture peut être utilisée pour jusqu'à plusieurs mois s’il est conservé à 4 ° C.</li>
</ol> 4. Essentiel c. elegans entretien <ol><li>graines préparé des boîtes de gélose NGM à e. coli en repérant environ 50-100 µL de prêt OP50 culture liquide vers le centre de la plaque.</li>
	<li>Plaques de recouvrement et laissez-les sécher à température ambiante pendant 24h. Une fois sec, placez les plaques à 37 ° C pendant la nuit pour une croissance rapide ou garder à température ambiante, si vous souhaitez une croissance plus lente.</li>
	<li>Ajouter vers la plaque soit par &#34; chunking, &#34; (voir protocole étape 5 &#34; Chunking et cueillette vers &#34;), cueillette vers individuellement, ou en plaçant des oeufs de ver directement sur la plaque (voir protocole étape 6 &#34; oeuf préparation &#34;).</li>
</ol> 5. Chunking et cueillette vers Remarque : &#34; Chunking, &#34; se réfère à une pratique courante dans l’entretien de c. elegans. Il s’agit de couper une section de la gélose NGM qui contient les vers et transférer ce morceau sur une nouvelle plaque, transférant ainsi également un grand nombre de vers dans le processus. Contamination peut également être découpée dans la plaque de cette manière. Lors de la cueillette de worms, il est important de maintenir l’intégrité de l’agar, car les vers peuvent être perdus dans des trous dans la gélose. En outre, il est important de permettre le prélèvement refroidir avant de toucher la plaque afin d’éviter de faire fondre la gélose ou brûler les vers.
<ol><li>Pour transférer rapidement de grandes quantités de vers sur les nouvelles plaques, couper un morceau d’agar NGM contenant les vers sélectionnés à l’aide d’une spatule. Retirez le morceau coupé et placez-le face vers le bas sur le bord de la pelouse de OP50 sur une nouvelle assiette.</li>
	<li>Transfert worms individuellement comme décrit ci-dessous dans protocole étape 8.2, &#34; test de survie, &#34; à l’aide d’un ver pick. Le fil dans le prélèvement de ver la flamme jusqu'à ce qu’il est rouge. Retirer du feu et laisser refroidir pendant quelques secondes.</li>
	<li>En utilisant le fil sur la pique, grattez légèrement la pelouse de la culture OP50 cultivée sur la nouvelle plaque, couvrant le fil sur la pique.</li>
	<li>La culture visqueuse couvrant l’extrémité du fil fait vers s’en tenir à la pointe du médiator, donc doucement ramasser sélectionné vers un mouvement glisser.</li>
	<li>Une fois vers sélectionnés sont réunis, placez-les sur une plaque de nouveau en glissant doucement la culture à travers l’agar. Placez le fil dans la flamme pour éliminer la culture restante sur la pique.</li>
</ol> 6. Préparation des oeufs <ol><li>Placer environ 20 animaux adultes (environ 2-3 jours après l’éclosion, lorsque cultivées à 20 ° C) par cueillette ou segmentation tel que décrit à l’étape de protocole 5, &#34; Chunking et cueillette vers, &#34; sur une plaque de graines avec 50 µL de souche d’e. coli, OP50.</li>
	<li>Pour recueillir les oeufs, recouvrir la plaque avec 10 mL de tampon de M9 après 1-2 jours. À l’aide d’une pipette sérologique de verre, tourbillon et agiter délicatement le contenu sur la gélose pour libérer les oeufs collés sur OP50 ou animaux adultes. Recueillir tout le liquide contenant les oeufs et les adultes.</li>
	<li>Solution de transfert M9 et OP50 dans un 15 mL conique tube. Centrifuger le tube conique de 15 mL à 2 100 x g pendant 2 min.</li>
	<li>Aspirer environ 9 mL du surnageant sans déranger le culot OP50.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans 2 mL d’eau stérile, 1 mL d’eau de Javel et 1 mL de 0,25 M NaOH.</li>
	<li>Mélanger doucement en retournant jusqu'à ce que la majorité (environ 70 %) des animaux adultes apparaître lysée ; en général, œufs restent intacts pendant ce traitement de l’eau de Javel court à cause de leur coquille. Centrifuger le tube conique à 990 x g pendant 2 min.</li>
	<li>Aspiration surnageant sans déranger le culot. Resuspendre le culot dans 10 mL de tampon de M9.</li>
	<li>Centrifuger le tube conique en 990 x g pendant 2 min. aspirer surnageant sans culot inquiétante. Resuspendre le culot avec 200 µL de tampon de M9. 
	Remarque : Préparation de l’oeuf peut-être nécessiter plusieurs essais. Œufs peuvent être détruits si ils sont exposés à l’eau de Javel pendant trop longtemps. Si les oeufs ne pas éclos, soit diminuer la concentration d’eau de Javel en solution ou diminuer la durée d’exposition à l’eau de Javel.</li>
</ol> 7. Infection par plaque de montage <ol><li>distribuer 3-5 mL de la DPJ dans un tube stérile et il inoculer avec une seule colonie Candida albicans à l’aide d’une anse stérile.
	<ol><li>Placer le tube sur un tambour rotatoire pour environ 16-18 h à 30 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Label un 1,5 mL tube à centrifuger contenant c. albicans et un autre pour contenir OP50. Noter le poids de chaque tube vide.
	<ol><li>Place 500 µL de la nuit la culture de c. albicans dans tube marqué c. albicans et 1 500 µL de la culture OP50 durant la nuit (à l’étape 3.1) dans le tube étiqueté OP50.</li>
		<li>Centrifugation pendant 10 min à 16 100 x surnageant aspirat g. sans culot inquiétante.</li>
		<li>Une nouvelle suspension chaque granule avec 500 µL d’eau stérile. Centrifuger pendant 5 min à 16 100 x g.</li>
		<li>Aspiration surnageant sans déranger le culot. Noter le poids final des microtubes.</li>
		<li>Déterminer le poids de chaque granule en soustrayant le poids initial des microtubes du poids final.</li>
	</ol></li> <li>à l’aide de l’eau stérile, resuspendre le culot de c. albicans à 10 mg/mL et le culot OP50 à 200 mg/mL. Faire une infection maître mélanger en combinant les 7 µL d’eau stérile, 0,5 µL de la culture de c. albicans, 10 µL d’une solution de 50 mg/mL de streptomycine et 2,5 µL de culture OP50.
	<ol><li>Pour les plaques de contrôle, créez un mélange maître en remplaçant le volume de la culture de c. albicans avec de l’eau stérile. Graines de 20 µL du mélange d’infection ou la solution de contrôle sur les plaques de centre de NGM à l’aide d’une micropipette OP50. 
		NOTE : Environ 100 vers sont nécessaires pour déterminer la signification statistique au cours de l’analyse. Ce dosage est généralement exécuté en trois exemplaires. Ainsi, un 3.2 x mélange d’infection ainsi qu’un 3.2 x solution de contrôle est effectuée. Ces mélanges sont faites pour être un peu plus de 3 x l’original pour s’assurer qu’un complet 20 µL est ensemencé sur chaque plaque, ce qui permet de place à l’erreur. Ce mélange maître est créé car le pharynx du ver est trop petit durant les premiers stades larvaires (L1-L3) à consommer c. albicans. Pour l’exposition à des agents pharmacologiques tels que le fluconazole ( Figure 3 b), l’agent est introduit dans le mélange de l’infection. La concentration de l’agent est déterminée empiriquement. Par exemple, dans la Figure 3 b, 50 µM Fluconazole est représenté, mais 0, 12,5, 25, 50 et 100 µM et Fluconazole furent également testés en utilisant le même protocole.</li>
	</ol></li></ol> 8. Analyse du phénotype de la région anale déformé (Dar) et test de survie <ol><li>visualiser le phénotype de Dar Remarque : Dar est mieux visualisé au stade L3 et au-delà. Dar se présente comme une petite saillie dans la région anale post du ver ( Figure 2 a), qui devient plus importante au fil du temps.
	<ol><li>Confirmer si un animal a Dar en appuyant rapidement sur la plaque sur la scène du microscope à dissection ; animaux sans volonté de Dar se déplacent en arrière immédiatement, tandis que les animaux avec Dar sera soit besoin répété tours de tapping pour inverser leur direction, ou ils ne sera pas du tout.</li>
	</ol></li> <li>Test de survie <ol><li>préparation oeuf complet comme décrite dans l’étape de protocole 6, &#34; oeuf préparation &#34;. Compter les oeufs dans le cadre de la dissection et diluer la solution oeuf avec M9 jusqu'à l’obtention d’une concentration d’environ 5-6 de œufs sains par µL. En utilisant une pipette, ajouter 20 µL d’échantillon contenant environ 30 œufs sur la plaque NGM préparé, dans la zone située entre la culture et du côté de la plaque (oeufs et ver alimentaire, OP50, sont à deux endroits distincts).</li>
		<li>Incuber les plaques à 20 ° C pendant 48 h. Sous le microscope à dissection, compter le nombre de vers vivants et morts adultes dans chaque assiette, ainsi que le nombre de vers avec Dar. Enregistrer les % avec Dar.</li>
		<li>Examiner un animal mort, si elle ne répond pas à l’écoute sur la tête par un fil d’aluminium ou tapant sur la plaque.</li>
		<li>Tous les jours, transférer vers adultes restantes de cueillette comme décrit à l’étape de protocole 5, &#34; Chunking et cueillette vers, &#34; sur une nouvelle plaque de contrôle ou d’infection. À ce stade, si nécessaire, effectuer un test de survie en vérifiant le nombre de vers vivants, morts et disparus chaque jour. 
		Remarque : Ce test peut fonctionner pendant deux semaines, commençant par la préparation de l’oeuf. En outre, la solution de l’oeuf ne devrait pas être dispensée sur la culture bactérienne, comme la solution peut contenir des traces d’eau de Javel qui peut tuer la OP50. La solution devrait également être distribué environ 0,5 cm du bord de la plaque, car les œufs peuvent se coincer entre les côtés de la plaque et l’agar. En outre, en raison de la prolifération rapide de worms, transférant les adultes sur les nouvelles plaques est critique pour les séparer de leur progéniture.</li>
	</ol></li> <li>Analyser la survie <ol><li>analyser les résultats à l’aide du logiciel d’analyse courbe de survie (voir liste des matériaux).</li>
		<li>Comparer la survie de courbes à l’aide de la méthode Grehan-Breslow-Wilcoxon (en supposant que les données des périodes tôt de survie sont plus précises qu’ULTERIEUREMENT, pondérer les données en conséquence) ainsi que d’outils statistiques Logrank 45. 
		NOTE : Par exemple, dans la Figure 4 b -C, la survie vers traités avec mutant c. albicans est comparée à ceux traités par les contrôles de type sauvage isogéniques ou complementarystrains.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les méthodes pour doser l’infection à c. elegans et la survie au cours de la durée d’exposition à c. albicans que nous avons décrite peuvent être modifiés pour tester un autre pathogène. Cultures en milieu liquide d’une autre bactérie ou champignon peuvent être faites et nourris de c. elegans de manière similaire. En outre, les infections séries peuvent être dosées en premier exposant la larve à un agent pathogène comme décrit et ensuite transférer les animaux sur une nouvelle assiette contenan...

C. elegans a été utilisé comme un organisme modèle puissant depuis plus de 50 ans. Dans les années 1960, biologiste sud-africain Sydney Brenner pionnier de l’utilisation c. elegans afin d’étudier le développement neuronal, ouvrant la voie à une longue lignée de scientifiques pour étudier divers aspects de la biologie cellulaire et animale dans les nématodes. Cette lignée inclut des lauréats du prix Nobel Craig Mello et Andrew Fire pour leur travail de RNAi1, Robert Horvitz et John Sulston pour leurs travaux sur le développement des organes et l’apoptose2,3,4et Martin Chalfie pour ses travaux sur la protéine fluorescente verte5. Bien que cet organisme modèle a été utilisé traditionnellement pour étudier la biologie moléculaire et du développement, au cours des 15 dernières années, les chercheurs ont commencé à utiliser des c. elegans pour étudier la biologie des différents agents pathogènes humains, y compris Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella entericaet Serratia marcescens6,7,8,9,10. Ces études ont révélé que bon nombre des mécanismes impliqués dans l’interaction homme-pathogène sont conservées dans les nématodes, mais aussi qu’il y a des mécanismes immunitaires qui sont propres à ce modèle organisme11,12. Dans la nature, c. elegans rencontre une variété de menaces par des agents pathogènes ingérés présents dans le sol et cela a fourni une forte pression sélective à évoluer et à maintenir un système sophistiqué d’immunitaire inné dans la lumière intestinale. Plusieurs des gènes et des mécanismes impliqués dans la protection de la lumière intestinale sont orchestrés par des éléments hautement conservée qui existent aussi en plus les mammifères11,13. C. elegans représente donc un excellent modèle pour étudier les agents pathogènes gastro-intestinaux comme Salmonella enterica14, Shigella boydii15ou16de la Vibrio cholerae.
Ici, nous mettons en évidence la polyvalence remarquable de c. elegans comme un hôte de modèle pour l’étude des agents infectieux tels que c. albicans. C. elegans comme un hôte de modèle permet de criblage à haut débit pour la virulence qui est long et moins coûteux qu’un modèle de souris, ce qui est couramment utilisé pour étudier la candidose42.
Dans cette étude, nous montrons que ce modèle et le test de survie assosiated peuvent être utilisés efficacement pour l’étude des effecteurs immunitaires innées hôte importants lutter contre les infections, les déterminants pathogène qui animent la virulence, et pharmacologiques des composés qui peuvent intervenir dans la pathogenèse. Dissemblables aux déterminations décrites précédemment, cette méthode fournit un moyen d’étudier l’exposition à un agent pathogène sur la durée de vie de l’animal, du stade larvaire à l’âge adulte, plutôt que seulement l’âge adulte à mort43,44. En résumé, notre c. elegans - modèle de c. albicans est un outil puissant et polyvalent qui peut être utilisé non seulement pour étudier les bases génétiques qui animent et immunitaires mais aussi d’identifier de nouveaux composés pour l’intervention thérapeutique.

<table><tbody><tr><td>Gélose (granulée, de qualité bactériologique)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>20-248</td><td></td></tr><tr><td>Fil d’aluminium (95 % Pt, calibre 32)</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-1M32P</td><td></td></tr><tr><td>Axiovision Zeiss Microscope inversé</td><td>Axiovision Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Peptone</td><td>Fisher BioReagants</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans souche Bli-3</td><td>Caenorhabditis Centre de génétique</td><td>Bli-3(e767) CB767</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP51-250</td><td></td></tr><tr><td>Cholestérol, grade Sigma, minimum 99 %</td>Tubes de culture jetables <td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td></td></tr><tr><td>(20 x 150 mm)</td><td>FIsherBrand</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection (illuminateur haute intensité NI-150)</td><td>Nikon Instrument Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism (logiciel d’analyse de la courbe de survie)</td><td>Logiciel</td><td></td><td></td>GraphPad</tr><tr><td>LB Broth (Miller’s)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>11-120</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium</td><td>Fisher Scientific</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri moyennes (35 X 10 mm)</td><td>Falcon</td><td></td><td></td>353001</tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Sigma</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Wildtype C. albicans SC5314</td><td>ATCC</td><td>SC5314</td><td></td></tr><tr><td>Wildtype C. elegans</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>N2</td><td></td></tr></tbody></table>

le nématode caenorhabditis elegans - un modèle polyvalent in vivo pour étudier les interactions hôtes-microorganismes

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Nous démontrons une méthode utilisant Caenorhabditis elegans comme un hôte de modèle pour étudier les interactions microbiennes. Les microbes sont introduites par le régime alimentaire, rendant l’intestin l’emplacement principal pour la maladie. L’intestin nématode structurellement et fonctionnellement imite les intestins chez les mammifères et est transparent, ce qui en fait se prêtent à l’étude au microscope de la colonisation. Ici, nous montrons que les agents pathogènes peuvent causer la maladie et la mort. Nous sommes en mesure d’identifier des mutants microbiennes qui montrent la virulence altérée. Sa réponse innée conservée aux stress biotiques rend c. elegans , un excellent système pour sonder les facettes des interactions immunitaires innées hôte. Nous montrons que hôtes présentant des mutations dans le gène de l’oxydase double ne peut pas produire des espèces réactives de l’oxygène et sont incapables de résister à une insulte microbienne. Nous démontrons plus loin la polyvalence de l’analyse de survie présenté en montrant qu’il peut être utilisé pour étudier les effets des inhibiteurs de la croissance microbienne. Ce test peut également être utilisé pour découvrir les facteurs de virulence fongique comme cibles pour le développement de nouveaux agents antifongiques, mais aussi de donner l’occasion de découvrir davantage les interactions hôtes-microorganismes. La conception de ce test prête bien à un débit élevé du génome entier écrans, tandis que la capacité à worms en cryo-preserve pour une utilisation future rend un modèle animaux rentable et attractif pour étudier.

Un dosage de pathogenèse (Figure 1) à l’aide de c. albicans et c. elegans a déjà été décrite par notre laboratoire17,18 et autres laboratoires19,20. Nous démontrons la susceptibilité de l’utilisation de c. elegans afin d’étudier la virulence de c. albicans montrant que les cellules de c. albicans so...

Nous présentons ici le nématode Caenorhabditis elegans comme un modèle d’hôte polyvalent pour étudier l’interaction microbienne.

Le nématode Caenorhabditis Elegans - un modèle polyvalent In Vivo pour étudier les Interactions hôtes-microorganismes

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

L’objectif global de ce test est d’observer l’effet de l’infection fongique dans l’organisme modèle C. Elegans. Cette méthode peut aider à répondre à des questions mécanistes clés dans le domaine des maladies infectieuses, telles que les facteurs de virulence des agents pathogènes, les effecteurs immunitaires de l’hôte, ainsi que la découverte de médicaments. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’un système expérimental permettant d’étudier les interactions hôte-pathogène des deux points de vue.Il s’agit d’un système rapide, facile et rentable. Bien que cette méthode particulière puisse donner un aperçu des agents pathogènes fongiques, elle peut également être appliquée à d’autres agents infectieux, tels que des bactéries ou même plusieurs organismes pour étudier les interactions microbiennes chez un hôte vivant. Pour fabriquer un pic à vers, coupez un morceau de fil d’aluminium de 1,5 centimètre, puis insérez soigneusement environ 0,5 centimètre de fil dans la pointe d’une pipette pasteur.À l’aide d’un bec Bunsen ou d’une lampe à alcool, faites fondre la pointe de la pipette en verre en la faisant pivoter lentement dans la flamme jusqu’à ce que le fil adhère solidement à la pipette sans compromettre la forme originale de la pointe de la pipette. Enfin, à l’aide d’une pince, pliez soigneusement l’extrémité du fil pour créer une petite boucle. Pour transférer rapidement de grandes quantités de vers sur de nouvelles plaques, utilisez une spatule pour couper un morceau de gélose NGM contenant les vers sélectionnés.Retirez ensuite le morceau coupé et placez-le face cachée sur le bord du patch de l’OP50 sur une nouvelle plaque. Pour transférer les vers individuellement, flambez le fil dans le cure-vis jusqu’à ce qu’il soit rouge, puis retirez-le de la flamme et laissez-le refroidir pendant quelques secondes. À l’aide du fil sur le pic, grattez doucement la parcelle de la culture OP50 cultivée sur la nouvelle plaque, en recouvrant le fil sur le pic.La culture visqueuse recouvrant l’extrémité du fil fait adhérer les vers à l’extrémité du noyau. Utilisez donc un mouvement de balayage pour ramasser doucement les vers sélectionnés. Une fois les vers sélectionnés rassemblés, placez-les sur une nouvelle assiette en glissant doucement la culture sur la gélose.Placez ensuite le fil dans la flamme pour éliminer la culture restante sur le pic. Placez environ 20 animaux adultes en les cueillant ou en les découpant sur une assiette contenant 50 microlitres de la souche OP50 d’E. coli. Pour recueillir les œufs après un à deux jours, inondez la plaque avec 10 millilitres de tampon M9.Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique en verre, agitez doucement le contenu sur la plaque de gélose pour libérer les animaux adultes ou les œufs collés à OP50. Récupérez tout le liquide contenant les œufs et les adultes. Transférez la solution M9 et OP50 dans un tube conique de 15 millilitres.Centrifugez le tube à 2, 100 x g pendant deux minutes. Aspirez ensuite environ neuf millilitres de surnageant sans déranger la pastille. Ensuite, utilisez deux millilitres d’eau stérile, un millilitre d’eau de Javel et un millilitre d’hydroxyde de sodium de 0,25 molaire pour remettre la pastille en suspension.Mélanger doucement par inversion jusqu’à ce qu’environ 70 % des animaux adultes apparaissent lysés. En général, les œufs restent intacts pendant ce court traitement à l’eau de Javel en raison de leur coquille. Il est essentiel que la quantité d’exposition à l’eau de Javel soit limitée à cette étape.Une exposition prolongée à l’eau de Javel détruira les œufs. En cas d’échec de la préparation des œufs, limitez la durée d’exposition à l’eau de Javel ou diluez la solution. Centrifugez le tube conique à 990 x g pendant deux minutes.Aspirer le surnageant sans déranger la pastille. Remettez ensuite la pastille en suspension dans 10 millilitres de tampon M9. Après avoir essoré à nouveau et retiré le surnageant sans déranger le granulé, utilisez 200 microlitres de tampon M9 pour remettre le granulé en suspension.Versez trois à cinq millilitres de YPD dans un tube à essai stérile et utilisez une boucle stérile pour l’inoculer avec une seule colonie de Candida albicans. Placez le tube sur un tambour rotatif à 30 degrés Celsius pendant environ 16 à 18 heures. Étiquetez un tube de microfuge de 1,5 millilitre pour contenir C. albicans et un autre pour contenir OP50, puis notez le poids de chaque tube vide.Transférez 500 microlitres de la culture de nuit de C.albicans dans le tube étiqueté C.Albicans. Et 1500 microlitres de la culture OP50 de nuit dans le tube étiqueté OP50. Centrifuger les tubes pendant 10 minutes à 16, 100 x g, puis aspirer le surnageant sans déranger les granulés.Utilisez 500 microlitres d’eau stérile pour remettre en suspension chaque pastille. Ensuite, centrifugez les tubes à 16, 100 x g pendant cinq minutes. Aspirer le surnageant sans déranger les granulés.Enregistrez ensuite le poids final des tubes de microfuge. Déterminez le poids de chaque pastille en soustrayant le poids initial des tubes de microfuge du poids final. À l’aide d’eau stérile, remettre en suspension la pastille de C. albicans à 10 milligrammes par millilitre et la pastille OP50 à 20 milligrammes par millilitre.Ensuite, préparez un mélange d’infection maître en combinant 10 microlitres d’une solution de 50 milligrammes par millilitre de streptomycine, 2,5 microlitres de culture OP50, 0,5 microlitres de culture de C. Albicans et 7 microlitres d’eau stérile.Pour les plaques témoins, créer un mélange maître en remplaçant le volume de la culture de C. albicans par de l’eau stérile. Ensuite, à l’aide d’une micropipette, ensemencez 20 microlitres de mélange d’infection ou de solution de contrôle OP50 au centre des plaques NGM. Après avoir préparé les œufs comme démontré précédemment dans cette vidéo, comptez les œufs sous la portée de dissection.Et utilisez M9 pour diluer la solution d’œuf jusqu’à ce qu’une concentration d’environ cinq à six œufs sains par microlitre soit atteinte. À l’aide d’une pipette, versez un échantillon de 20 microlitres contenant environ 30 œufs sur une plaque NGM préparée dans la zone située entre la culture bactérienne et le côté de la plaque. Incuber les plaques à 20 degrés Celsius pendant 48 heures.Ensuite, sous un microscope de dissection, comptez le nombre de vers adultes vivants et morts sur chaque plaque. Considérer l’animal mort s’il ne répond pas à un coup sur la tête d’un fil d’aluminium ou à un tapotement sur la plaque. Comptez également le nombre de vers avec Dar et confirmez si un animal a Dar en tapotant rapidement la plaque sur la platine du microscope de dissection.Les animaux sans Dar reculeront immédiatement, tandis que les animaux avec Dar auront besoin de tapotements répétés pour inverser leur direction ou ils ne le feront pas du tout. Tous les deux jours, transférez tous les vers adultes restants en les ramassant sur une nouvelle plaque d’infection ou de contrôle. À ce stade, si nécessaire, effectuez un test de survie en suivant le nombre de vers vivants, morts et manquants chaque jour.Il est important de transférer les vers tous les deux jours au minimum. Cela garantit que les vers adultes qui sont marqués dans cet essai ne sont pas confondus avec leur progéniture. Les C. elegans ont été exposés à C. albicans pendant une période de six jours et ont été observés pour détecter des signes d’infection, de progression de la maladie et de décès.Le phénotype Dar est plus visible au quatrième jour de l’essai de survie, comme le montre une région anale saillante qui n’est pas visible chez l’animal non infecté. Les vers infectés par C. albicans sont également connus pour présenter un gonflement dans la région de la vulve. Dans les deux cas, le ver est incapable d’éliminer l’infection après avoir atteint ce stade.Afin de visualiser la colonisation de C. Albicans dans la lumière intestinale, les vers ont été nourris avec des C. albicans de type sauvage marqués avec RFP qui provoquent des zones de colonisation en rouge fluorescent. Les C. albicans colonisent la lumière intestinale dès le troisième jour du dosage. Comme on le voit ici, les vers infectés présentaient une distension intestinale plus sévère que celle observée chez le témoin non infecté.Dans cette expérience, la capacité des vers à survivre à l’infection causée par le double mutant virulent C.Albicans efg1/efg1 cph1/cph1 a été testée. Les vers infectés par le double mutant vivent statistiquement beaucoup plus longtemps que les témoins. Suggérant que ces deux gènes sont nécessaires à la virulence de C. albicans contre C. Elegans.Une fois maîtrisée, chaque partie de cette technique peut être réalisée en une à deux heures chaque jour de la durée de vie du ver. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que l’on peut utiliser des agents infectieux. Des précautions appropriées en matière de biosécurité doivent donc être prises.Des modifications mineures peuvent être apportées à cette procédure de base, comme l’introduction d’agents microbiens supplémentaires afin d’étudier les interactions microbiennes dans le contexte d’un hôte vivant. Après sa mise au point, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des maladies infectieuses pour explorer la virulence microbienne, les mécanismes des réponses immunitaires innées de l’hôte, ainsi que la découverte de nouveaux agents antimicrobiens. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de maintenir et de manipuler C. Elegans et d’utiliser l’organisme pour étudier les interactions hôte-microbe au niveau moléculaire.N’oubliez pas que travailler avec des agents pathogènes microbiens et des réactifs chimiques, comme l’azoture de sodium, peut être dangereux et que des précautions de sécurité appropriées telles que les EPI et les méthodes d’élimination des déchets doivent être utilisées.

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La facilité de maintenir et de propager le...

De base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Méthodes: Synchronisation et d&#39;observation

Les nématodes sauvages de Caenorhabditis sont associés à de nombreux microbes, souvent dans la lumière intestinale ou infectant l’intestin. Ce protocole détaille une méthode pour enrichir les microbes inculturables colonisant l’intestin, en tirant parti de la résistance de la cuticule de dauer.

Nettoyage sélectif des nématodes sauvages de Caenorhabditis pour enrichir les bactéries du microbiome intestinal

L’infection de Caenorhabditis elegans par le parasite microsporidien Nematocida parisii permet aux vers de produire une progéniture très résistante au même agent pathogène. C’est un exemple d’immunité héréditaire, un phénomène épigénétique mal compris. Le présent protocole décrit l’étude de l’immunité héréditaire dans un modèle de ver génétiquement traitable.

Étude de l’immunité héréditaire dans un modèle d’infection à Microsporidia à Caenorhabditis elegans

Les microbes intestinaux, y compris les bactéries extracellulaires et les agents pathogènes intracellulaires comme le virus d’Orsay et les microsporidies (champignons), sont souvent associés aux nématodes sauvages Caenorhabditis . Cet article présente un protocole pour détecter et quantifier les microbes qui colonisent et/ou infectent les nématodes C. elegans , et pour mesurer la charge pathogène après des infections contrôlées en laboratoire.

Hybridation in situ par fluorescence d’ARN (FISH) pour visualiser la colonisation microbienne et l’infection dans les intestins de Caenorhabditis elegans

Ce protocole décrit une perturbation de 96 puits de Caenorhabditis elegans colonisés par des bactéries individuelles à la suite d’une paralysie par le froid et d’un blanchiment de surface pour éliminer les bactéries externes. La suspension résultante est plaquée sur des plaques de gélose pour permettre une quantification précise et à débit moyen de la charge bactérienne dans un grand nombre de vers individuels.

Utilisation de données à un seul ver pour quantifier l’hétérogénéité dans les interactions caenorhabditis elegans-bactériennes

Caenorhabditis elegans est l’une des principales espèces modèles en biologie, mais presque toutes les recherches sont effectuées en l’absence de ses microbes naturellement associés. Les méthodes décrites ici aideront à améliorer notre compréhension de la diversité des microbes associés comme base pour les futures recherches fonctionnelles sur C. elegans.

Isolement et caractérisation du microbiote naturel du nématode modèle Caenorhabditis elegans

Les microcosmes de compost apportent la diversité microbienne trouvée dans la nature en laboratoire pour faciliter la recherche sur le microbiome chez Caenorhabditis elegans. Voici des protocoles pour la mise en place d’expériences de microcosme, les expériences démontrant la capacité de moduler la diversité microbienne environnementale pour explorer les relations entre la diversité microbienne environnementale et la composition du microbiome intestinal du ver.

Microcosmes de compost en tant qu’environnements naturels diversifiés sur le plan microbien pour la recherche sur le microbiome chez Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans est un modèle puissant pour examiner les déterminants moléculaires à l’origine des interactions hôte-microbiome. Nous présentons un pipeline à haut débit profilant les niveaux de colonisation du microbiome intestinal chez un seul animal ainsi que des aspects clés de la physiologie de C. elegans.

Application de la vermimétrie de flux pour la quantification et l’analyse du microbiome intestinal de Caenorhabditis elegans

Nous fournissons ici des instructions sur l’utilisation efficace de SegElegans, un système d’apprentissage profond que nous avons développé pour la segmentation automatisée de vers individuels dans des images de microscopie à grand champ, pour une utilisation ultérieure dans des logiciels d’analyse d’images tels qu’ImageJ. Nous fournissons des moyens d’utiliser le système à la fois en ligne et hors ligne.

Analyse automatisée d’images de fluorescence de C. elegans à l’aide de SegElegans

Nous décrivons une stratégie de remplacement de gène robuste pour manipuler génétiquement le champignon Ustilago maydis. Ce protocole explique comment générer des mutants de deletion pour enquêter sur les phénotypes d'infection. Elle peut être étendue à modifier les gènes de manière quelconque, par exemple en ajoutant une séquence codant pour une étiquette de protéine fluorescente.

Manipulation génétique de l&#39;agent pathogène des plantes<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Pour étudier la biologie de Fungal and Plant Microbe Interactions

Découvrez comment étudier les infections fongiques chez Caenorhabditis elegans pour explorer la virulence pathogène et les réponses immunitaires de l'hôte. Cette méthode rapide et économique facilite la découverte de nouveaux antimicrobiens.

Le nématode Caenorhabditis Elegans - un modèle polyvalent In Vivo pour étudier les Interactions hôtes-microorganismes

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