Le nématode Caenorhabditis Elegans - un modèle polyvalent In Vivo pour étudier les Interactions hôtes-microorganismes

L’objectif global de ce test est d’observer l’effet de l’infection fongique dans l’organisme modèle C. Elegans. Cette méthode peut aider à répondre à des questions mécanistes clés dans le domaine des maladies infectieuses, telles que les facteurs de virulence des agents pathogènes, les effecteurs immunitaires de l’hôte, ainsi que la découverte de médicaments. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’un système expérimental permettant d’étudier les interactions hôte-pathogène des deux points de vue.

Il s’agit d’un système rapide, facile et rentable. Bien que cette méthode particulière puisse donner un aperçu des agents pathogènes fongiques, elle peut également être appliquée à d’autres agents infectieux, tels que des bactéries ou même plusieurs organismes pour étudier les interactions microbiennes chez un hôte vivant. Pour fabriquer un pic à vers, coupez un morceau de fil d’aluminium de 1,5 centimètre, puis insérez soigneusement environ 0,5 centimètre de fil dans la pointe d’une pipette pasteur

À l’aide d’un bec Bunsen ou d’une lampe à alcool, faites fondre la pointe de la pipette en verre en la faisant pivoter lentement dans la flamme jusqu’à ce que le fil adhère solidement à la pipette sans compromettre la forme originale de la pointe de la pipette. Enfin, à l’aide d’une pince, pliez soigneusement l’extrémité du fil pour créer une petite boucle. Pour transférer rapidement de grandes quantités de vers sur de nouvelles plaques, utilisez une spatule pour couper un morceau de gélose NGM contenant les vers sélectionnés.

Retirez ensuite le morceau coupé et placez-le face cachée sur le bord du patch de l’OP50 sur une nouvelle plaque. Pour transférer les vers individuellement, flambez le fil dans le cure-vis jusqu’à ce qu’il soit rouge, puis retirez-le de la flamme et laissez-le refroidir pendant quelques secondes. À l’aide du fil sur le pic, grattez doucement la parcelle de la culture OP50 cultivée sur la nouvelle plaque, en recouvrant le fil sur le pic.

La culture visqueuse recouvrant l’extrémité du fil fait adhérer les vers à l’extrémité du noyau. Utilisez donc un mouvement de balayage pour ramasser doucement les vers sélectionnés. Une fois les vers sélectionnés rassemblés, placez-les sur une nouvelle assiette en glissant doucement la culture sur la gélose.

Placez ensuite le fil dans la flamme pour éliminer la culture restante sur le pic. Placez environ 20 animaux adultes en les cueillant ou en les découpant sur une assiette contenant 50 microlitres de la souche OP50 d’E. coli. Pour recueillir les œufs après un à deux jours, inondez la plaque avec 10 millilitres de tampon M9.

Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique en verre, agitez doucement le contenu sur la plaque de gélose pour libérer les animaux adultes ou les œufs collés à OP50. Récupérez tout le liquide contenant les œufs et les adultes. Transférez la solution M9 et OP50 dans un tube conique de 15 millilitres.

Centrifugez le tube à 2, 100 x g pendant deux minutes. Aspirez ensuite environ neuf millilitres de surnageant sans déranger la pastille. Ensuite, utilisez deux millilitres d’eau stérile, un millilitre d’eau de Javel et un millilitre d’hydroxyde de sodium de 0,25 molaire pour remettre la pastille en suspension.

Mélanger doucement par inversion jusqu’à ce qu’environ 70 % des animaux adultes apparaissent lysés. En général, les œufs restent intacts pendant ce court traitement à l’eau de Javel en raison de leur coquille. Il est essentiel que la quantité d’exposition à l’eau de Javel soit limitée à cette étape.

Une exposition prolongée à l’eau de Javel détruira les œufs. En cas d’échec de la préparation des œufs, limitez la durée d’exposition à l’eau de Javel ou diluez la solution. Centrifugez le tube conique à 990 x g pendant deux minutes.

Aspirer le surnageant sans déranger la pastille. Remettez ensuite la pastille en suspension dans 10 millilitres de tampon M9. Après avoir essoré à nouveau et retiré le surnageant sans déranger le granulé, utilisez 200 microlitres de tampon M9 pour remettre le granulé en suspension.

Versez trois à cinq millilitres de YPD dans un tube à essai stérile et utilisez une boucle stérile pour l’inoculer avec une seule colonie de Candida albicans. Placez le tube sur un tambour rotatif à 30 degrés Celsius pendant environ 16 à 18 heures. Étiquetez un tube de microfuge de 1,5 millilitre pour contenir C. albicans et un autre pour contenir OP50, puis notez le poids de chaque tube vide.

Transférez 500 microlitres de la culture de nuit de C.albicans dans le tube étiqueté C.Albicans. Et 1500 microlitres de la culture OP50 de nuit dans le tube étiqueté OP50. Centrifuger les tubes pendant 10 minutes à 16, 100 x g, puis aspirer le surnageant sans déranger les granulés.

Utilisez 500 microlitres d’eau stérile pour remettre en suspension chaque pastille. Ensuite, centrifugez les tubes à 16, 100 x g pendant cinq minutes. Aspirer le surnageant sans déranger les granulés.

Enregistrez ensuite le poids final des tubes de microfuge. Déterminez le poids de chaque pastille en soustrayant le poids initial des tubes de microfuge du poids final. À l’aide d’eau stérile, remettre en suspension la pastille de C. albicans à 10 milligrammes par millilitre et la pastille OP50 à 20 milligrammes par millilitre.

Ensuite, préparez un mélange d’infection maître en combinant 10 microlitres d’une solution de 50 milligrammes par millilitre de streptomycine, 2,5 microlitres de culture OP50, 0,5 microlitres de culture de C. Albicans et 7 microlitres d’eau stérile.

Pour les plaques témoins, créer un mélange maître en remplaçant le volume de la culture de C. albicans par de l’eau stérile. Ensuite, à l’aide d’une micropipette, ensemencez 20 microlitres de mélange d’infection ou de solution de contrôle OP50 au centre des plaques NGM. Après avoir préparé les œufs comme démontré précédemment dans cette vidéo, comptez les œufs sous la portée de dissection.

Et utilisez M9 pour diluer la solution d’œuf jusqu’à ce qu’une concentration d’environ cinq à six œufs sains par microlitre soit atteinte. À l’aide d’une pipette, versez un échantillon de 20 microlitres contenant environ 30 œufs sur une plaque NGM préparée dans la zone située entre la culture bactérienne et le côté de la plaque. Incuber les plaques à 20 degrés Celsius pendant 48 heures.

Ensuite, sous un microscope de dissection, comptez le nombre de vers adultes vivants et morts sur chaque plaque. Considérer l’animal mort s’il ne répond pas à un coup sur la tête d’un fil d’aluminium ou à un tapotement sur la plaque. Comptez également le nombre de vers avec Dar et confirmez si un animal a Dar en tapotant rapidement la plaque sur la platine du microscope de dissection.

Les animaux sans Dar reculeront immédiatement, tandis que les animaux avec Dar auront besoin de tapotements répétés pour inverser leur direction ou ils ne le feront pas du tout. Tous les deux jours, transférez tous les vers adultes restants en les ramassant sur une nouvelle plaque d’infection ou de contrôle. À ce stade, si nécessaire, effectuez un test de survie en suivant le nombre de vers vivants, morts et manquants chaque jour.

Il est important de transférer les vers tous les deux jours au minimum. Cela garantit que les vers adultes qui sont marqués dans cet essai ne sont pas confondus avec leur progéniture. Les C. elegans ont été exposés à C. albicans pendant une période de six jours et ont été observés pour détecter des signes d’infection, de progression de la maladie et de décès.

Le phénotype Dar est plus visible au quatrième jour de l’essai de survie, comme le montre une région anale saillante qui n’est pas visible chez l’animal non infecté. Les vers infectés par C. albicans sont également connus pour présenter un gonflement dans la région de la vulve. Dans les deux cas, le ver est incapable d’éliminer l’infection après avoir atteint ce stade.

Afin de visualiser la colonisation de C. Albicans dans la lumière intestinale, les vers ont été nourris avec des C. albicans de type sauvage marqués avec RFP qui provoquent des zones de colonisation en rouge fluorescent. Les C. albicans colonisent la lumière intestinale dès le troisième jour du dosage. Comme on le voit ici, les vers infectés présentaient une distension intestinale plus sévère que celle observée chez le témoin non infecté.

Dans cette expérience, la capacité des vers à survivre à l’infection causée par le double mutant virulent C.Albicans efg1/efg1 cph1/cph1 a été testée. Les vers infectés par le double mutant vivent statistiquement beaucoup plus longtemps que les témoins. Suggérant que ces deux gènes sont nécessaires à la virulence de C. albicans contre C. Elegans.

Une fois maîtrisée, chaque partie de cette technique peut être réalisée en une à deux heures chaque jour de la durée de vie du ver. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que l’on peut utiliser des agents infectieux. Des précautions appropriées en matière de biosécurité doivent donc être prises.

Des modifications mineures peuvent être apportées à cette procédure de base, comme l’introduction d’agents microbiens supplémentaires afin d’étudier les interactions microbiennes dans le contexte d’un hôte vivant. Après sa mise au point, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des maladies infectieuses pour explorer la virulence microbienne, les mécanismes des réponses immunitaires innées de l’hôte, ainsi que la découverte de nouveaux agents antimicrobiens. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de maintenir et de manipuler C. Elegans et d’utiliser l’organisme pour étudier les interactions hôte-microbe au niveau moléculaire.

N’oubliez pas que travailler avec des agents pathogènes microbiens et des réactifs chimiques, comme l’azoture de sodium, peut être dangereux et que des précautions de sécurité appropriées telles que les EPI et les méthodes d’élimination des déchets doivent être utilisées.