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Advanced Biology

Une introduction à la mort cellulaire

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Cell Biology

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An Introduction to Cell Death

4.12: Detecting Reactive Oxygen Species

4.15: Annexin V and Propidium Iodide Labeling

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10:06 min

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April 30, 2023

Overview

La nécrose, l’apoptose et la mort cellulaire autophagique sont toutes les manières dont les cellules peuvent mourir et ces mécanismes peuvent être induites par des stimuli différents, tels que des lésions des cellules, faibles niveaux de nutriments ou protéines de signalisation. Considérant que la nécrose est considérée comme une forme « accidentelle » ou inattendue de la mort cellulaire, il existe une preuve que l’apoptose autophagie sont programmés et « planifié » par les cellules.

Dans cette vidéo de présentation, JoVE met en évidence des découvertes clés se rapportant à la mort cellulaire, y compris les travaux récents effectués en vers qui a permis d’identifier des gènes impliqués dans l’apoptose. Nous explorons ensuite des questions posées par les scientifiques qui étudient la mort cellulaire, certaines qui examinent les voies différentes de la mort et de leurs interactions. Enfin, plusieurs méthodes d’évaluation de mort cellulaire sont discutées, et nous remarquons comment les chercheurs appliquent aujourd’hui ces techniques dans leurs expériences.

Procedure

Paradoxalement, la mort cellulaire contribue à façonner la vie de l’organisme. À l’instar de n’importe quel ensemble de l’organisme, les cellules peuvent mourir en raison du vieillissement, en raison d’une blessure accidentelle, ou suite à une infiltration d’agents pathogènes unicellulaires peut sacrifier elle-même pour empêcher la propagation de l’infection. Dans ces circonstances, cellules peuvent suivre des voies différentes de la mort comme l’apoptose, autophagie ou nécrose. Tous ces types présentent des caractéristiques morphologiques spécifiques. L’apoptose ou mort cellulaire programmée conduit à membrane « blebbing » et de la fragmentation nucléaire. Autophagie, qui est également réglementée, conduit à la formation de grandes vacuoles contenant des composants cellulaires. Enfin, nécrose, c’est-à-dire les « imprévus » ou accidentels, se termine par la lyse cellulaire.

Cette vidéo va discuter des découvertes importantes qui ont conduit à l’identification de ces voies, explorer des questions auxquelles les chercheurs sont toujours poser des questions sur la mort cellulaire, discuter des outils qu’ils utilisent pour y répondre et enfin en revue quelques expériences d’exemple.

Tout d’abord, passons en revue certains des chercheurs qui a aidé à déchiffrer des voies cellulaires de la mort.

Des termes modernes utilisés pour décrire ces chemins remonte à Hippocrate, un médecin dans la Grèce antique. Il a utilisé le terme apoptose, ce qui signifie « falling off, » pour décrire les os « déchiquetage » observé après une fracture. Venir à l’époque moderne, la première mention notable de « nécrose » a eu lieu en 1859, quand Rudolf Virchow — dans sa compilation appelée Pathologie cellulaire— utilisé ce terme pour décrire la « dégradation des tissus avancé. »

Avec les progrès de la microscopie et l’histologie au cours de la prochaine décennie, en 1877 Carl Weigert et Julius Cohnheim ont pu étudier la nécrose au niveau cellulaire. Ils ont donné un aperçu des caractéristiques morphologiques associées à ce type de mort, comme la perte des noyaux.

Près de 70 ans plus tard, Christian de Duve découvert « autophagie, » un processus dans lequel les composants cellulaires sont engloutis et ventilées par organites membranaires appelées autophagosomes, qui fusionnent avec un autre type d’organite — lysosomes — pour détruire davantage leur contenu. Nous savons maintenant que l’autophagie joue un double rôle dans la cellule, facilite la survie ou induisant la mort.

En 1972, John Kerr, Andrew Wyllie et A. R. Currie a observé un autre type de mort cellulaire à la morphologie bien particulière. Depuis ce processus impliqués morceaux « tomber » des cellules mortes, ils lui a donné l’apoptose ancien nom grec. Plus tard, l’apoptose a été reconnu comme une forme de « mort cellulaire programmée » en 1977, quand H. R. Horvitz et John Sulston étudiaient développement de c. elegans . Ils ont constaté que des cellules spécifiques subirait l’apoptose en même temps chez les vers différents.

Étant donné que cela est arrivé très tôt au cours du développement, il a laissé entendre que les gènes peuvent guider l’apoptose. Cette hypothèse a été confirmée par le groupe de Horvitz dans les années 1980, quand ils ont observé que les cellules présentant des mutations dans certains Dec ou gènes « Mort dec. elegans » n’est pas mort lors de l’élaboration de ces vers. Plus tard, Horvitz a montré que le gène de ced-3 code pour une enzyme dégradant les protéines appelée une caspase. Maintenant, nous savons qu’il existe plusieurs caspases, et ils jouent un rôle important dans la mort cellulaire.

Ces avancées dans le domaine de la mort cellulaire ouvert de nouvelles routes pour les chercheurs à explorer. Regardons certains d’entre eux.

Il y a toujours eu intérêt à savoir quels facteurs déclenchent la mort cellulaire. Pour les identifier, les chercheurs sont actuellement exposer aux radiations, produits chimiques, les cellules et molécules de signalisation, et puis la recherche de changements dans le degré ou le type de la mort.

D’autres scientifiques sont intéressent à élucider les voies biochimiques impliquées dans chaque mécanisme de mort cellulaire. Actuellement, nous savons que l’apoptosis suit une voie où les caspases sont les enzymes clés, considérant que l’autophagie suppose des protéines qui sont nécessaires pour la formation de l’autophagosome. Cependant, il y a des composants dans ces voies qui ne sont pas connus, et les chercheurs tentent de trouver des façons de les expliquer. En outre, les chercheurs étudient également que n’importe quel « crosstalk » intervienne entre les voies de mort cellulaire. Si la diaphonie est présent, puis le même signal peut interviennent dans l’apoptose, mais aussi d’autophagie.

Enfin, un quartier populaire de recherche traite de comprendre pourquoi certaines cellules, comme les cellules cancéreuses — devenir immortel. Les scientifiques sont constamment à la recherche de mutations dans les cellules cancéreuses et déterminer si un quelconque d’entre eux touchent des gènes codant des facteurs impliqués dans les voies de la mort.

Autant de questions complexes, mais heureusement les chercheurs ont une variété d’outils à leur disposition pour y répondre.

L’essai de bleu trypan est un outil de dépistage couramment utilisés pour évaluer l’effet d’un composé sur la mort cellulaire. L’analyse se fonde sur une tache qui ne peut pas entrer dans des cellules vivantes, car ils possèdent « membranes sélectives », mais peut facilement entrer dans les cellules mortes que leurs membranes sont « rompus ». Ce test identifie la mort cellulaire, mais ne parvient pas à identifier la voie de la mort cellulaire spécifique.

Par conséquent, scientifiques ont conçu des techniques comme les tests d’activité caspase. Puisque les caspases sont activés pendant l’apoptosis, scientifiques peuvent ajouter des substrats de ces enzymes qui réagissent lorsqu’ils sont activés par des caspases. Ce qui contribue à l’identification de cellules apoptotiques.

De même, fragmentation de l’ADN qui se passe pendant l’apoptosis peut être facilement identifiée à l’aide de l’essai TUNEL, qui s’appuie sur les réactifs de cette balise les extrémités « entaillées » de l’ADN endommagé. Comme cette méthode est relativement facile à réaliser, c’est un test couramment utilisé dans le domaine.

Lorsque les scientifiques veulent déterminer le mécanisme de mort cellulaire dans leur population, ils peuvent associer annexine V et l’iodure de propidium (PI) les taches avec analyse en cytométrie en flux. Annexine V se lie à des résidus de phosphatidylsérine dans la membrane, tandis que PI pénètre à travers les membranes endommagées à associer avec l’ADN. En étudiant les données résultantes, scientifiques peuvent séparer des cellules subissant les voies différentes de la mort.

Enfin, scientifiques peuvent utiliser l’imagerie de cellules vivantes pour visualiser le processus de mort cellulaire en temps réel. Il s’agit d’une technique globale qui peut être utilisée pour identifier l’autophagie, nécrotiques ou cellules apoptotiques basés sur des caractéristiques morphologiques uniques.

Comme vous l’avez vu, il existe plusieurs méthodes pour détecter la mort des cellules, dont certaines ne sont pas spécifiques, d’autres qui peuvent aider à identifier les cellules apoptotiques, et certains qui distinguent entre les différentes voies.

Maintenant, nous allons voir comment les scientifiques utilisent ces techniques pour étudier plus sur la mort cellulaire.

Régime alimentaire joue un rôle important dans la santé et peut affecter la mort cellulaire dans différents tissus. Dans cet essai in vitro , les chercheurs exposés des neurones de souris à l’acide palmitique, un acide gras saturé présent dans les produits laitiers et viande et ensuite utilisé une analyse du caspase pour évaluer l’apoptose. Ils ont découvert que les cellules traitées à l’acide palmitique démontré caspase accru l’activité et la mort cellulaire.

D’autres chercheurs utilisent ces tests pour déterminer comment médicaments induisent des mécanismes différents de la mort. Ici, les souris transgéniques avec les cellules cancéreuses fluorescent étiquetés ont été injectés avec la doxorubicine, un médicament contre le cancer. Les cellules scientifiques puis photographiés dans les animaux vivants et en recherchant des changements dans la morphologie des cellules du cancer, déterminé que le traitement de la toxicomanie déclenchée tant l’apoptose et nécrose.

Enfin, certains scientifiques étudient si la mort cellulaire peut être inversée. Dans cette expérience, les chercheurs exposés à l’éthanol, les cellules cancéreuses humaines et confirment à travers une variété d’épreuves que ce traitement amenés à se lancer sur la voie de l’apoptose. Après lavage au large de l’éthanol, les cellules affectées ont été en mesure de récupérer de l’apoptose par un processus appelé « anastasis ». Cela donné un aperçu de comment les cancers peuvent retourner après traitement de la toxicomanie.

Vous avez juste regardé introduction de JoVE pour voies de mort cellulaire. Cette vidéo a examiné la riche histoire de la recherche sur les cellules mort — de l’Antiquité au XXe siècle — et ensuite discuté quelques questions actuelles. Nous a expliqué les méthodes populaires pour doser la mort cellulaire et a démontré comment ces techniques servent à mieux comprendre le lien entre l’environnement, la maladie et la mort cellulaire. Comme toujours, Merci pour regarder !

Transcript

Paradoxically, cell death helps shape an organism’s life. Just like any whole organism, cells can die as a result of aging, due to accidental injury, or following a pathogen infiltration a cell can sacrifice itself to prevent the spread of infection. Under these circumstances, cells can follow different death pathways like apoptosis, autophagy, or necrosis. All these types display specific morphological characteristics. Apoptosis or programmed cell death leads to membrane “blebbing” and nuclear fragmentation. Autophagy, which is also regulated, leads to formation of large vacuoles enclosing cellular components. Lastly, necrosis, which is “unplanned” or accidental, ends in cell lysis.

This video will discuss important discoveries that led to the identification of these pathways, explore questions that researchers are still asking about cell death, discuss tools they use to answer them, and finally review a few example experiments.

First, let’s review some key researchers who helped to decipher different cell death pathways.

Modern terms used to describe these paths can be traced back to Hippocrates, a physician in ancient Greece. He used the term apoptosis, meaning “falling off,” to describe bone “shredding” observed following a fracture. Coming to the modern era, the first noticeable mention of “necrosis” occurred in 1859, when Rudolf Virchow—in his compilation called Cell Pathology—used this term to describe “advanced tissue breakdown.”

With advances in microscopy and histology over the next decade, in 1877 Carl Weigert and Julius Cohnheim were able to study necrosis at the cellular level. They provided insight into the morphological features associated with this type of death, like the loss of nuclei.

Almost 70 years later, Christian de Duve discovered “autophagy,” a process in which cellular components are engulfed and broken down by membrane-bound organelles called autophagosomes, which fuse with another type of organelle—lysosomes—to further destroy their contents. We now know that autophagy actually plays a dual role in the cell, either facilitating survival or inducing death.

In 1972, John Kerr, A. R. Currie, and Andrew Wyllie observed another type of cell death with peculiar morphology. Since this process involved pieces “falling off” of dead cells, they gave it the ancient Greek name apoptosis. Later, apoptosis was recognized as a form of “programmed cell death” in 1977, when H. R. Horvitz and John Sulston were studying C. elegans development. They noticed that specific cells would undergo apoptosis at the same time in different worms.

Since this was happening early on during development, it hinted that genes may guide apoptosis. This hypothesis was confirmed by Horvitz’s group in the 1980’s, when they observed that cells with mutations in certain ced or “C. elegans death” genes didn’t die during the development of these worms. Later, Horvitz showed that the ced-3 gene encodes a protein-degrading enzyme called a caspase. Now, we know that there are several caspases, and they play major roles in cell death.

These advances in the cell death field opened new roads for researchers to explore. Let’s look at some of them.

There has always been interest in finding out what factors trigger cell death. To identify them, researchers are currently exposing cells to radiation, chemicals, and signaling molecules, and then searching for changes in the degree or type of death.

Other scientists are interested in elucidating the biochemical pathways involved in each cell death mechanism. Currently, we know that apoptosis follows a pathway where caspases are the key enzymes, whereas autophagy involves proteins that are necessary for autophagosome formation. However, there are components in these pathways that are unknown, and researchers are trying to figure out ways to explain them. In addition, researchers are also studying whether any “crosstalk” occurs between cell death pathways. If crosstalk is present, then the same signal can factor in apoptosis, as well as autophagy.

Lastly, a popular area of research deals with understanding why certain cells—like cancer cells—become immortal. Scientists are constantly looking for mutations in cancer cells, and assessing whether any of them affect genes encoding factors involved in death pathways.

These are all complicated questions, but luckily researchers have a variety of tools at their disposal to answer them.

The trypan blue assay is a commonly used screening tool to assess the effect of a compound on cell death. The assay relies on a stain that cannot enter live cells, as they posses “selective membranes,” but can easily enter dead cells as their membranes are “ruptured.” This assay identifies cell death, but fails to pinpoint the specific cell death pathway.

Therefore, scientists have designed techniques like caspase activity assays. Since caspases are activated during apoptosis, scientists can add substrates for these enzymes that fluoresce when they’re activated by caspases. This helps in the identification of apoptotic cells.

Similarly, DNA fragmentation that happens during apoptosis can be easily identified using the TUNEL assay, which relies on reagents that tag the “nicked” ends of damaged DNA. As this method is relatively easy to perform, it is a commonly employed assay in the field.

When scientists want to determine the cell death mechanism occurring in their population, they can pair annexin V and propidium iodide (PI) stains with flow cytometry analysis. Annexin V binds to phosphatidylserine residues in the membrane, whereas PI enters through the damaged membranes to associate with DNA. By studying the resulting data, scientists can separate cells undergoing different death pathways.

Lastly, scientists can use live cell imaging to view the cell death process in real time. This is an all-encompassing technique that can be used to identify autophagic, necrotic, or apoptotic cells based on unique morphological features.

As you’ve seen, there are several methods to detect cell death, some of which are not specific, others that can help identify apoptotic cells, and some that distinguish between different pathways.

Now, let’s see how scientists are using these techniques to study more about cell death.

Diet plays an important role in health, and may affect cell death in different tissues. In this in vitro assay, researchers exposed mouse neurons to palmitic acid, a saturated fatty acid present in both dairy products and meat, and then used a caspase assay to evaluate apoptosis. They discovered that palmitic acid-treated cells demonstrated increased caspase activity and cell death.

Other researchers are using these assays to determine how drugs induce different death mechanisms. Here, transgenic mice with fluorescently labeled cancer cells were injected with doxorubicin, an anti-cancer drug. Scientists then imaged cells in live animals, and by looking for changes in cancer cell morphology, determined that drug treatment triggered both apoptosis and necrosis.

Finally, some scientists are investigating whether cell death can be reversed. In this experiment, researchers exposed human cancer cells to ethanol, and confirmed through a variety of assays that this treatment caused them to embark on the apoptosis pathway. Upon washing off the ethanol, affected cells were able to recover from apoptosis through a process called “anastasis.” This provided insight into how cancers can return following drug treatment.

You’ve just watched JoVE’s introduction to cell death pathways. This video reviewed the rich history of cell death research—from ancient times to the 20th century—and then discussed a few current questions. We also explained popular methods to assay cell death, and demonstrated how these techniques are being used to better understand the connection between environment, disease, and cell death. As always, thanks for watching!

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