Fabrication et caractérisation des échafaudages de fibre Griffithsin modifiés pour la prévention des Infections sexuellement transmissibles

L’objectif global de cette procédure est de fabriquer et de modifier la surface des fibres d’acide polylactique, d’acide coglycolique, d’électrofilage, avec des quantités variables de la protéine antivirale Griffithsin. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’administration de médicaments, telles que la formulation et la caractérisation de nouveaux véhicules d’administration capables de prévenir les infections virales sexuellement transmissibles, telles que le VIH-1. Le principal avantage de la technique est que l’activité antivirale de Griffithsin est maximisée en utilisant des fibres polymères électrofilées comme échafaudage fixe à la Griffithsin hautement localisée à la surface de la fibre.

Les implications de cette technique s’étendent au traitement d’autres infections virales et bactériennes, en raison du puissant potentiel prophylactique et thérapeutique de Griffithsin contre une variété de types d’infections. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la prévention de l’infection par le VIH-1, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que d’autres infections virales ou bactériennes dans lesquelles Griffithsin a démontré sa puissance. Pour commencer cette procédure, pesez 720 milligrammes de PLGA 50/50 dans une bouteille à scintillation de 10 millilitres.

À l’aide d’une pipette sérologique en verre, ajoutez 3,0 millilitres de HFIP. Couvrez l’ignoble avec un film plastique. Ensuite, mesurez et enregistrez la masse ignoble.

Incuber la suspension de polymère à 37 degrés Celsius pendant la nuit pour assurer la dissolution complète du polymère. Après cela, préparez l’appareil d’électrofilage comme indiqué dans le protocole de texte. Utilisez une seringue de trois millilitres pour aspirer la solution polymère.

Ensuite, connectez une pointe d’aiguille émoussée de calibre 18 de 0,5 pouce à la seringue. Distribuez l’excédent de solution pour éliminer l’espace vide dans l’aiguille. Placez la seringue sur un tire-seringue et réglez le débit de l’instrument sur 2,0 millilitres par heure.

Connectez la source d’alimentation à l’aiguille de la seringue. Electrospin la solution polymère en utilisant une tension positive de 27 kilovolts. Une fois que toute la solution est électrofilée, éteignez la source d’alimentation.

Laissez la mandrin tourner pendant 30 minutes supplémentaires, pour évaporer complètement le solvant. Ensuite, désactivez le collecteur de mandril rotatif. À l’aide d’une lame de rasoir, décollez délicatement la fibre de la vrille.

Collectez la fibre PLGA électrofilée dans une boîte de Pétri étiquetée. Placez le plat dans un dessiccateur pendant la nuit pour éliminer tout solvant résiduel. Pour commencer, préparez les solutions PBS et MES comme indiqué dans le protocole texte.

Ensuite, retirez l’EDC et le NHS du congélateur. Laissez-les reposer pour s’équilibrer à température ambiante. Après cela, pesez quatre milligrammes d’EDC dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre.

Pesez six milligrammes de NHS dans un autre tube de micro-centrifugeuse. Ajoutez un millilitre de tampon MES dans chaque tube. Agitez vigoureusement les deux tubes pour vous assurer que les réactifs sont complètement dissous.

Ensuite, pesez 70 milligrammes d’hydroxylamine dans un tube à centrifuger conique de 50 millilitres. Ajouter 20 millilitres de PBS, et vortex. Massez une quantité appropriée de fibre PLGA dans un tube de centrifugation conique de 15 millilitres.

Ajoutez huit millilitres de tampon MES à la fibre. Ensuite, ajoutez un millilitre des solutions EDC et NHS. Utilisez un film plastique pour sceller le tube de centrifugation conique de 15 millilitres.

Placez le tube sur un rotateur pour inverser doucement la solution pendant 15 minutes à température ambiante. Après cela, ajoutez 14 microlitres de bêta-mercaptoéthanol pour éteindre la réaction. Retournez le tube plusieurs fois pour assurer un mélange complet.

Jetez le surnageant et rincez la fibre PLGA deux fois avec 10 millilitres de PBS pour chaque lavage. Ajouter une quantité appropriée de solution mère de GRFT dans le tube, comme indiqué dans le protocole de texte. Ensuite, ajoutez suffisamment de PBS pour porter le volume final à huit millilitres.

Fermez et retournez le tube pour assurer un mélange complet. Scellez le tube avec un film plastique. Placez le tube sur le rotateur pour inverser doucement la solution pendant deux heures.

Après cela, éteignez la réaction en ajoutant deux millilitres de la solution d’hydroxylamine préparée et en tourbillonnant pendant 30 secondes. Jetez le surnageant. Rincez deux fois la fibre PLGA modifiée en surface, en utilisant 10 millilitres d’eau ultra pure et en tourbillonnant à chaque lavage.

Ensuite, transférez la fibre lavée dans une boîte de Pétri. Placez la boîte de Pétri à l’intérieur d’un dessiccateur, jusqu’à ce que la fibre soit complètement sèche. Conservez ensuite la boîte de Pétri à quatre degrés Celsius.

Pour commencer, disposez trois micro-tubes à centrifuger de 1,5 millilitre. Mettez deux milligrammes de fibres dans chacun. Ensuite, ajoutez un millilitre de DMSO dans chaque tube.

Agitez pendant une minute à température ambiante pour dissoudre complètement la fibre. Après cela, diluez une aliquote de 10 microlitres au moins 100 fois, dans un tampon TE. Conserver à moins 20 degrés Celsius, jusqu’à la caractérisation de chargement avec Eliza.

Pesez entre 5 et 10 milligrammes de fibres modifiées en surface et transférez-les dans un tube de micro-centrifugation. Enregistrez la masse de fibres placée dans chaque tube. Ensuite, ajoutez un millilitre d’une solution qui imite l’environnement physiologique de chaque échantillon.

Incuber les échantillons sur un agitateur rotatif à 200 tr/min et 37 degrés Celsius pendant une heure. Après cela, prélever environ un millilitre de la solution contenant le GRFT désorbé et l’aliquote dans des tubes en grappe. Conserver à moins 20 degrés Celsius jusqu’au moment d’effectuer la quantification des protéines.

Transférez ensuite l’échantillon dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse. Ajoutez un millilitre de solution tampon fraîche et incubez jusqu’au prochain point temporel, comme indiqué dans le protocole de texte. Dans cette étude, les conditions de fabrication des fibres électrofilées PLGA sont examinées.

L’analyse MEB des fibres GRFT vierges, 0,05 nanomole, 0,5 nanomole et 5 nanomoles indique que la modification GRFT n’a aucun effet sur la morphologie des fibres. Toutes les formations ont des diamètres moyens similaires, environ 1,9 micron, ce qui démontre la cohérence du processus de fabrication modifié entre les lots. La quantité de GRFT conjuguée dans les fibres électrofilées est ensuite déterminée.

La modification de 5 nanomoles contient 373 nanogrammes de GRFT, tandis que les modifications 0,5 et 0,05 en contiennent respectivement 165 et 42. Cela démontre que les fibres conjuguées avec une densité théorique de modification de surface plus élevée entraînent une plus grande quantité de GRFT conjuguée à la fibre. Cependant, une corrélation inverse peut être observée dans l’efficacité de conjugaison résultante.

Ensuite, la quantité de GRFT conjuguée de manière covalente à la fibre est évaluée. Au cours des quatre premières heures, 113 nanogrammes, 25 nanogrammes et 10 nanogrammes de GRFT par milligramme de fibre électrofilée sont détectés dans les concentrations de modification théorique de 5 nanomoles, 0,5 nanomole et 0,05 nanomole, respectivement. Après quatre heures, une quantité négligeable de GRFT est détectée dans l’élu de libération pour les trois formulations.

Ces données indiquent que la majorité du GRFT est liée de manière covalente aux fibres électrofilées et que le GRFT absorbé en surface est libéré dans les quatre premières heures. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre jours environ. L’électrofilage de l’échafaudage en fibre polymère nécessite deux jours pour préparer la solution polymère et l’électrofilage.

Alors que la modification de surface, le séchage ultérieur et la caractérisation des fibres nécessitaient au moins deux jours supplémentaires. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir les bons ratios de réactifs pour assurer une modification optimale. De plus, il est également important de vérifier que les paramètres d’électrofilage sont corrects pour garantir une morphologie de fibre appropriée.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’administration de médicaments pour fabriquer des fibres électrofilées, qui non seulement encapsulent des agents antiviraux dans la fibre, mais ont la capacité de conjuguer des agents actifs à travers la surface de la fibre. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’électrospiner la fibre polymère, d’effectuer la modification de surface de la fibre avec la protéine antivirale Griffithsin et la Griffithsin qualitative conjuguée à la fibre. N’oubliez pas que travailler avec des réactifs tels que le HFIP, le bêta-mercaptoéthanol, l’EDC et le NHS peut être extrêmement dangereux.

Des précautions telles que l’application correcte de l’EPI et l’utilisation de hottes chimiques doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.