Focal Macropatch enregistrements de courants synaptiques de la jonction neuromusculaire larves de drosophile

L’objectif global de cette technique est de surveiller l’activité synaptique des boutons synaptiques visualisés à la jonction neuromusculaire de la larve de drosophile. Un excellent système modèle facilement adaptable aux manipulations génétiques. Cette technique peut répondre à des questions clés de votre science.

Comme la façon dont les mutations des protéines synaptiques régulent la transmission synaptique. Le principal avantage de cette technique est que l’activité d’un nombre limité de sites de libération peut être surveillée et enregistrée des courants de cinétique rapide et peut être facilement résolue. Pour commencer l’expérience : préparez l’extracteur de microélectrodes.

Utilisez un microscope à un grossissement de 35X pour vous assurer que le diamètre intérieur de l’électrode tirée est de l’ordre de sept à dix micromètres. Stockez les capillaires dans des récipients hermétiquement fermés pour éviter l’accumulation de poussière. Ensuite, polissez au feu les capillaires à l’aide d’une micro-forge.

Assurez-vous que le diamètre intérieur final de l’électrode polie est de cinq micromètres. Ensuite, passez à la flexion. Fixez l’électrode dans le manipulateur et positionnez la pointe sur le filament sans le toucher.

Réglez la valeur thermique à 60-70 % du maximum et appuyez sur la pédale de la micro-forge pendant une à deux secondes pour chauffer le filament. À l’aide d’une aiguille en forme de L, tirez doucement la pointe de l’électrode vers le bas et faites plier à environ 90 degrés. Tenez l’électrode au-dessus de la flamme de la torche à la main et faites le deuxième pli à sept à dix millimètres du premier pli et à un angle d’environ 120 degrés.

Préparez une solution semblable à l’hémolymphe ou HL3. Conservez la solution dans le réfrigérateur et faites-la fraîche chaque semaine. Préparez les pipettes de stimulation de la même manière que les pipettes en verre d’enregistrement sans les plier.

Ensuite, insérez une pipette de stimulation dans un porte-microélectrode relié à une seringue. Fabrication de plaques de dissection à partir de petites boîtes de Pétri recouvertes de caoutchouc de silicone époxy. Ensuite, à l’aide d’une pince, prélevez une larve errante du troisième stade dans une fiole.

Épinglez les larves en plaçant la première épingle dans la partie postérieure et une autre épingle à l’avant près des crochets buccaux. Ajouter la solution HL3. Sur la face dorsale des larves, faites une coupe à l’aide de ciseaux à ressort de la goupille supérieure à la goupille inférieure.

Épinglez le filet des larves en plaçant deux épingles supplémentaires sur les côtés gauche et droit des larves. Retirez les entrailles et la trachée à l’aide d’une pince. Coupez les nerfs juste à l’extérieur du cordon nerveux ventral à l’aide de ciseaux à ressort.

Placez la boîte de Pétri avec la préparation sur la platine du microscope. Insérez l’électrode de référence dans le bain. Remplissez l’électrode d’enregistrement avec la solution HL3.

Sous l’objectif 10X, plongez l’électrode dans le bain et placez-la sur les muscles six et sept des segments abdominaux de deux, trois ou quatre à l’aide du micromanipulateur. Ensuite, passez l’objectif à 60X et concentrez-vous sur la zone d’intérêt à l’aide d’une optique d’épi-fluorescence ou DIC. Placez l’extrémité de l’électrode sur le bouton synaptique, puis appuyez très doucement l’électrode sur le muscle, car une pression excessive peut endommager la JNM ou induire une augmentation de l’activité synaptique spontanée.

Ensuite, allumez l’amplificateur, la carte AD et l’ordinateur. Ensuite, choisissez le mode de pince de tension sur l’amplificateur. Démarrez le logiciel d’acquisition et choisissez le mode sans espace et observez l’apparition des MEJC sur l’écran de l’ordinateur.

Assurez-vous que l’amplitude des MEJC est comprise entre 0,2 et 0,7 nanoampères. À l’aide d’un micromanipulateur sous contrôle visuel, placez l’électrode de stimulation près de l’axone, innervant les segments abdominaux deux à quatre. Appliquez une pression négative en tirant sur le piston de la seringue reliée au porte-électrode de sorte que l’axone soit tiré à l’intérieur de l’électrode.

Ensuite, allumez le stimulateur. Tournez le bouton de l’unité d’isolation pour régler un courant zéro, puis augmentez-le doucement jusqu’à ce que les EJC apparaissent ou jusqu’à ce que le seuil soit atteint. Effectuez la stimulation dans un régime superseuil.

Avec l’augmentation du courant de stimulation environ deux fois par rapport au seuil d’observation des ECJ. Mesurez la résistance d’étanchéité de l’électrode macro-patch d’enregistrement en tournant l’interrupteur de résistance d’électrode de l’amplificateur en position de test d’étanchéité. Observez la valeur de la résistance d’étanchéité en giga ohms qui sera affichée dans la fenêtre actuelle.

Les enregistrements de macro-patchs focaux permettent de surveiller l’activité synaptique à partir de boutons synaptiques sélectionnés. Lorsque l’électrode est positionnée au-dessus d’un bouton synaptique, les MEJC enregistrés ont des amplitudes dépassant considérablement le niveau de bruit et des phases de montée brusques à une échelle inférieure à la milliseconde. Lorsque l’électrode d’enregistrement est éloignée du bouton synaptique de plusieurs microns, les amplitudes des MEJC de l’enregistreur diminuent presque jusqu’au niveau du bruit.

Les EJC enregistrés peuvent à peine être distingués du bruit et ils ont des phases de montée prolongées. Les enregistrements focaux permettent une détection précise des MEJC dans le complexe et le mutant gnome. Alors que les enregistrements intercellulaires de ce mutant présentent des événements de libération qui se chevauchent et ne peuvent pas être détectés de manière fiable.

Le réglage des angles de la puce électrique est essentiel pour le positionnement de l’électrode. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que la vérification de l’imagerie des événements de libération individuels, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’intégration de l’activité des zones actives individuelles.