Vivre la microscopie de Fluorescence cellulaire afin d’observer les processus essentiels au cours de la croissance des cellules microbiennes

L’objectif global de cette approche basée sur la microscopie est d’observer un processus central pendant la croissance des cellules bactériennes. Cette méthode nous permet d’aborder des questions importantes en bactériologie, telles que la façon dont les processus essentiels sont coordonnés lors de la croissance et de la division des cellules bactériennes. Le principal avantage de cette technique est que nous sommes en mesure d’utiliser des réactifs fluorescents pour visualiser les surfaces et les structures des cellules bactériennes dans les cellules vivantes.

Ici, nous utilisons cette méthode pour donner un aperçu des processus essentiels chez Agrobacterium tumefaciens. Cependant, ce processus pourrait également être adopté par d’autres bactéries pour étudier leur croissance. Pour commencer, à l’aide d’un bâtonnet en bois stérile ou d’une pointe de pipette, inoculez trois millilitres de milieu de croissance ATGN, avec une seule colonie d’une souche de type sauvage ou mutante d’A. Tumifaciens.

Cultivez la culture à 28 degrés Celsius et 225 RPM pendant la nuit. Le lendemain, utilisez un spectrophotomètre pour mesurer l’OD600. Ensuite, diluez la culture cellulaire à une DO 600 d’environ 0,2 et continuez à faire croître les cellules jusqu’à une DO 600 de 0,6.

Versez un millilitre de culture exponentielle dans trois tubes de microfuge. Et granulez les cellules dans une centrifugeuse de bureau à 7 000 x g pendant cinq minutes. Remettez en suspension chaque pastille de cellule dans un millilitre de PBS, puis ajoutez soit un microlitre de solution mère DMSO Orange, soit une solution mère DAPI.

Mélangez doucement par pipetage et incubez les cellules remises en suspension dans l’obscurité pendant cinq minutes. Granulez les cellules par centrifugation à 7 000 x g pendant cinq minutes et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de PBS pour éliminer l’excès de réactif. Ensuite, lavez les cellules deux fois de plus et remettez en suspension la pastille dans 50 microlitres de PBS ou de milieu.

Pour une imagerie simultanée en accéléré, combinez dix microlitres de cellules de chaque traitement dans un nouveau tube à microfuge. Pour préparer des tampons d’agarose pour l’imagerie cellulaire, utilisez une lamelle de protection comme guide et coupez un carré de 22 x 22 millimètres de film de laboratoire en passant un scalpel sur les bords. Découpez un carré au centre du film de laboratoire, en laissant une bordure d’environ deux à cinq millimètres pour servir de joint d’étanchéité au tampon d’agarose.

Ensuite, jetez la découpe centrale. Placez le joint du film sur une lame de verre, nettoyée avec un nettoyant sans ammoniaque et sans alcool. Et utilisez un bloc de chaleur réglé à 70 degrés Celsius ou une flamme pour chauffer la lame jusqu’à ce que le film soit légèrement fondu sur le verre.

Ensuite, préparez une solution d’agarose en mélangeant environ 0,075 gramme d’agarose et cinq millilitres de milieu dans une petite fiole. Chauffez la solution au micro-ondes en remuant périodiquement pour mélanger, jusqu’à ce que l’agarose soit dissoute et que la solution soit claire. Conservez la solution d’agarose à 55-70 degrés Celsius et utilisez-la pour la construction de plusieurs coussinets d’agarose dans les 48 heures.

Pipetez le milieu d’agarose chaud au centre du joint. Ensuite, placez une lamelle sur le joint pour répartir uniformément l’agarose. Placez la lame sur une surface froide et plane pour qu’elle se solidifie pendant environ deux minutes.

Maintenant, faites glisser délicatement le couvercle du tampon d’agarose, puis laissez le tampon d’agarose sécher à l’air libre pendant une à deux minutes à température ambiante, jusqu’à ce que la surface du tampon semble sèche. Une bonne construction du tampon d’agarose est cruciale pour l’acquisition d’images de haute qualité. N’essayez pas d’imager sur un mauvais bloc-notes.

Si le tampon d’agarose se dessèche, ondule ou se déchire, il est préférable de ne pas être paresseux et de fabriquer plutôt un nouveau tampon. Ensuite, à l’aide d’un scalpel, retirez une petite bande d’agarose pour créer une poche d’air d’environ deux mètres sur sept à dix millimètres. Les cellules tumorafaciennes ont tendance à se développer davantage près de la poche d’air.

Repérez 0,8 à 1 microlitre de cellules sur le tampon d’agarose. Ensuite, placez délicatement une lamelle sur le dessus du tampon d’agarose pour répartir les cellules sur la surface du tampon. Pour l’imagerie time-lapse à long terme, utilisez du Valap fondu pour sceller les bords de la lamelle.

Assurez-vous de sceller tous les bords et les coins de la lamelle avec Valap. Le non-respect de cette consigne peut entraîner une dérive pendant l’imagerie en accéléré de la plaque d’agarose. Pour effectuer une microscopie à épifluorescence, placez de l’huile d’immersion sur l’objectif souhaité et placez la lame inversée dans le porte-lame sur la platine.

Utilisez les boutons de mise au point pour faire la mise au point sur les cellules. Acquérez des images en phase, ou DIC et fluorescence, à l’aide du filtre de fluorescence souhaité pour les images de fluorescence. Facultativement, acquérez plusieurs positions x, y en sélectionnant au hasard dix champs de cellules à proximité de la poche d’air des coussinets d’agarose.

Configurez l’acquisition de la séquence temporelle sur l’image en phase, ou DIC, à l’intervalle de temps souhaité. Comme le montre ici, les cellules ont été imagées directement à partir de la culture après lavage par centrifugation et après avoir incubé les cellules avec 0,1 % de DMSO, les résultats ont montré que le DMSO seul n’a pas d’impact sur la morphologie cellulaire. L’ADN marqué par Orange et DAPI dans des cellules vivantes d’A. Tumefaciens.

Dans les cellules pré-divisions tardives, deux nucléoloïdes distincts sont observés avec la coloration orange, tandis que le marquage de l’ADN semble plus diffus avec la coloration DAPI. Dans cette expérience en accéléré avec une proportion égale d’A.Tumefaciens de type sauvage non marqué, marqué au DAPI et marqué en orange, toutes les cellules se sont développées lorsqu’elles ont été imagées avec la microscopie à contraste de phase, indiquant qu’aucun des deux colorants n’a altéré la croissance cellulaire. Les cellules se sont également développées sous contraste de phase en microscopie à épifluorescence à l’aide du filtre TRITC.

Cependant, lorsqu’elles ont été imagées avec le filtre DAPI, les cellules ont cessé de croître en moins d’une heure. En suivant des méthodes similaires, d’autres réactifs fluorescents peuvent également être utilisés pour visualiser la paroi cellulaire ou les membranes bactériennes. De plus, bon nombre de ces colorants fluorescents peuvent être combinés pour fournir une image complète de la surface des cellules bactériennes.

La visualisation des processus essentiels dans les bactéries vivantes est passionnante, car elle ouvre la possibilité d’étudier ces processus chez des mutants conditionnels ou des bactéries non modèles. Cela nous permet d’améliorer nos études sur diverses espèces bactériennes.